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Artigo de método

Estudando a exposição crônica de camundongos à radiação ultravioleta B

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DOI:

10.3791/67368

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19 de agosto de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Human Genetics and Biochemistry, Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2The Ragon Institute of Mass General, MIT, and Harvard Main Street

Neste artigo

Resumo

O protocolo descreve um estudo dos efeitos sistêmicos e locais da exposição ao ultravioleta B na pele em camundongos.

Resumo

A radiação ultravioleta B (UVB) (280-320 nm) é reconhecida como cancerígena desde 1928, levando à minimização da exposição ao sol. No entanto, estudos epidemiológicos sugerem que a exposição ao sol se correlaciona com o aumento da expectativa de vida e a redução da incidência de doenças cardiovasculares e certos tipos de câncer, como câncer de cólon e endométrio. A exposição ao UVB também influencia o metabolismo hepático, protege contra a lipotoxicidade hepatocelular e afeta a saúde metabólica. Esses efeitos são parcialmente devidos à síntese de vitamina D, embora alguns sejam independentes da vitamina D. Além disso, a fototerapia com UVB tem propriedades imunomoduladoras e é usada para tratar doenças de pele como vitiligo e psoríase, além de afetar o sistema imunológico sistêmico. Dados os amplos efeitos fisiológicos do UVB, existem lacunas na compreensão do mecanismo por trás da maioria desses efeitos. Mostramos que a exposição diária a UVB de baixo nível aumenta o comportamento de busca de alimentos em camundongos machos, mas não em fêmeas, devido ao aumento da secreção de grelina dos adipócitos da pele. Nas mulheres, o estrogênio inibe a atividade p53 dos adipócitos, bloqueando a elevação da grelina e demonstrando uma resposta dependente do sexo à radiação UVB. Além disso, a ativação do p53 induzida por UVB em queratinócitos epidérmicos ativa o eixo hipotálamo-hipófise-gonadal, induzindo comportamento sexual e pró-fertilidade ovariana. Este artigo descreve um protocolo para estudar os efeitos locais e sistêmicos da baixa radiação UVB usando um modelo de camundongo C57BL / 6J. Os elementos-chave incluem calibração precisa das doses de UVB, condições de alojamento e depilação cuidadosa para garantir uma exposição consistente. Os camundongos são submetidos a um regime de exposição UVB gradual ao longo de várias semanas, com monitoramento de mudanças comportamentais e de saúde. Métodos para validação da eficiência da radiação por meio de medições de pigmentação também são detalhados. Ao enfatizar a calibração das doses de UVB, cuidados rigorosos com os animais e controles metodológicos, este protocolo facilitará o estudo dos efeitos abrangentes da exposição ao UVB, contribuindo para uma compreensão diferenciada de seus benefícios e riscos terapêuticos.

Introdução

As frequências de radiação solar que atingem a superfície da Terra incluem radiação ultravioleta (UV), radiação UVA (320-400 nm) e radiação UVB (280-320 nm). UVB é um indutor de mutação. O UV foi reconhecido como cancerígeno em 19281 e, a partir de meados de 1900, a redução da exposição ao sol foi recomendada como medida de precaução para evitar o câncer de pele2. Embora o UVB seja claramente um gatilho ambiental para o câncer de pele, pesquisas na última década3 com estudos recentes de nosso grupo 4,5,6 mostraram que o UVB tem amplos efeitos nos sistemas fisiológicos. Um estudo de uma coorte de mulheres acompanhadas ao longo de 20 anos revelou que a expectativa de vida foi maior em 2 anos em mulheres que não evitaram o sol em comparação com mulheres que o fizeram7. Estudos adicionais demonstraram que a exposição solar foi correlacionada com a diminuição das doenças cardiovasculares e da mortalidade geral 8,9,10. Correlações inversas também foram relatadas entre luz solar e câncer de cólon e câncer de endométrio8. A exposição ao UVB também induz o metabolismo hepático11, protege contra a lipotoxicidade hepatocelular e doenças metabólicas e tem efeitos positivos sobre endorfinas e comportamentos sexuais 3,6. Essas linhas de evidência indicam os efeitos prejudiciais de evitar a exposição ao sol na saúde humana. Os efeitos benéficos da exposição solar têm sido atribuídos principalmente à indução da produção de vitamina D, no entanto, pelo menos alguns dos benefícios da luz solar para a saúde são independentes dos níveis de vitamina D 4,6,12

A pele é o maior órgão do corpo e é a primeira linha de defesa contra os estressores ambientais. As camadas epidérmica e dérmica da pele são separadas por uma camada epidérmica basal composta por queratinócitos e melanócitos indiferenciados e auto-renovados10. Os queratinócitos em estágios crescentes de diferenciação terminal são encontrados na camada epidérmica superior. A derme inclui fibroblastos e vasos sanguíneos, e a hipoderme consiste principalmente de adipócitos. A pele é um órgão dermatoendócrino, uma vez que múltiplos receptores de hormônios, como o receptor de andrógeno e o receptor do hormônio liberador de corticotropina, são expressos na pele, sugerindo que os hormônios influenciam os processos na pele por vias parácrinas e autócrinas 13,14,15. A pele também é produtora de hormônios. Com algumas exceções, no entanto, a produção de hormônios na pele e a liberação no sangue não foram documentadas, nem os gatilhos para a expressão são conhecidos (revisão em16).

O UVB demonstrou ter potencial terapêutico em doenças de pele. A fototerapia, incluindo a terapia com psoraleno-UVA e UVB de banda estreita, é a principal modalidade de tratamento para o vitiligo generalizado17. A resposta à fototerapia ocorreu em 74% dos pacientes em 6 meses e em 75% dos pacientes em 12 meses após o início do tratamento18. O mecanismo de ação da fototerapia no vitiligo não é bem compreendido. Sua ação terapêutica envolve uma combinação de efeitos na cinética do ciclo celular, alterações na expressão de citocinas, efeitos nos melanócitos e imunomodulação. Numerosos estudos examinaram os efeitos da fototerapia na imunidade da pele 19,20,21; No entanto, os efeitos sistêmicos são pouco compreendidos, especialmente no contexto do vitiligo. Em contraste com a psoríase, onde um estudo mostrou uma diminuição nas citocinas pró-inflamatórias e um aumento nas células T reguladoras após o tratamento com fototerapia, no vitiligo, o número de células T reguladoras diminuiu com a fototerapia UV21.

Embora o UVB tenha efeitos no cérebro14,15, glândulas supra-renais22, ovários 5,6, testículos 6, fígado11 e linfonodos23, os mecanismos pelos quais o UVB modula os sistemas sistêmicos não são conhecidos. Este protocolo de pesquisa descreve um modelo de camundongo para estudar os efeitos sistêmicos e locais (pele) da exposição UVB que facilitará o estudo dos efeitos abrangentes da exposição UVB. O modelo de camundongo UVB é de amplo interesse em fisiologia da pele, dermatologia e câncer de pele, especialmente melanoma. O objetivo geral deste método é fornecer um protocolo simples, mas robusto e eficaz para desenvolver o modelo de camundongo UVB para questões de pesquisa científica relacionadas à pele. O protocolo descreve como superar os desafios do eritema cutâneo associado à depilação e à exposição aos raios UVB em condições fisiológicas e é eficaz no estudo dos efeitos locais e sistêmicos dos raios UVB na pele.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais descritos foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Tel Aviv (licença IACUC: 01-20-043).

1. Habituação dos camundongos para o experimento

  1. Obtenha camundongos C57BL/6J de 7 a 8 semanas comprando de um fornecedor comercial ou criando internamente, dependendo do protocolo IACUC do experimentador. Este protocolo testa os camundongos de 15 semanas de idade no fundo C57BL / 6J, mas o protocolo deve ser calibrado em outras cepas de camundongos e para idades mais jovens (< 7 semanas de idade).
    NOTA: O protocolo de utilização dos diferentes camundongos por faixa etária deve ser aprovado pelo IACUC da instituição onde o experimento será realizado. São fornecidos pormenores sobre o estado sanitário dos animais (Quadro Suplementar 1).
  2. Habitue os camundongos por pelo menos 7 dias antes do início do experimento. A habituação é crítica para os ratos após o transporte e a logística.

2. Abrigando os mouses

  1. Alojar os animais em gaiolas domésticas com cama padrão ad libitum , acesso à ração padrão e água em um ciclo padrão de escuridão / luz de 12:00 h (horas de luz: 07:00 - 19:00 h e horas escuras: 19:00-07:00 h) à temperatura padrão de 22 ± 1 ° C e 32% -35% de umidade.
    NOTA: Testamos este protocolo em acesso dietético restrito e também funciona bem nessas condições experimentais.
  2. Certifique-se de que o número de camundongos por gaiola esteja de acordo com seu peso corporal, tamanho da ninhada e hipótese experimental.

3. Barbear e depilação

  1. Antes de fazer a barba, coloque os ratos na câmara de isoflurano conectados a um vaporizador de anestesia com isoflurano a 5% e 1 L/min de oxigênio.
    NOTA: As experimentadoras devem ser cautelosas ao usar isoflurano, pois a exposição pode causar sérios riscos à saúde e as mulheres grávidas devem evitá-lo de qualquer forma.
  2. Certifique-se de que os ratos estejam imóveis e respirando consistentemente. Use pomada ocular para evitar o ressecamento.
  3. Ligue a máquina de barbear (dimensões da lâmina CxLxA: 204 x 50 x 41 mm) e segure-a paralelamente à pele do rato. Mova suavemente a máquina de barbear na direção para a frente. Não empurre a máquina na pele do mouse; Algumas rodadas de barbear devem raspar suficientemente os ratos do lado dorsal. Raspe os camundongos dorsalmente para que 50% a 60% da região dorsal seja raspada (Figura 1) antes do início da exposição à radiação. Raspe novamente os ratos sempre que houver manchas de crescimento de pelos, que normalmente têm cerca de 0,5 cm.
    NOTA: Use cuidadosamente o barbeador para não machucar ou rasgar a pele dos animais; O experimentador deve manter o barbeador o mais paralelo possível com a pele. A frequência da depilação depende da tensão e do tipo de tratamento experimental dado aos ratos.
  4. Anestesie os ratos de uma gaiola de cada vez e depois raspe-os. Após o barbear, aplique creme depilatório (o suficiente para cobrir o aplicador de algodão) na área depilada usando discos de algodão. Tenha cuidado para não expor o creme depilatório mais perto dos olhos dos animais. Fazer o contrário pode causar complicações graves e coceira.
  5. Após 1-2 min, lave a área suavemente com lenços embebidos em solução salina tampão fosfato estéril (PBS) para remover vestígios do creme depilatório do corpo do camundongo para remover os vestígios do cabelo preso.
    NOTA: O tempo prolongado (> 5 min) com o creme depilatório pode prejudicar a pele dos camundongos e deve ser evitado. Certifique-se de que a temperatura do PBS seja ambiente em temperatura ambiente e não muito fria.
  6. Seque a área raspada com tecidos moles e, em seguida, coloque os ratos na gaiola de recuperação limpa e seca com cama de gaiola. Observe atentamente os ratos até que eles recuperem a consciência.
    NOTA: A lâmpada de luz infravermelha pode garantir que a temperatura corporal dos ratos não caia drasticamente após as etapas de lavagem.
  7. Deixe os ratos descansarem em sua gaiola doméstica com comida e água ab libitum e se recupere do procedimento de barbear por pelo menos 10 dias antes da primeira exposição UVB.
    NOTA: Se os camundongos forem expostos ao UVB antes de 10 dias após o barbear, isso pode levar a eritema cutâneo.

4. Configuração de exposição UVB

  1. Use uma camisa de mangas compridas, calças, jaleco, sapatos fechados, luvas duplas e protetor facial. Realize a irradiação dentro de uma capa biológica com a cobertura de plexiglass de 10 mm para baixo para evitar a exposição UVB do experimentador.
  2. Coloque o UVB lamp na câmara de vidro Plexi transparente sem ligá-lo, conforme mostrado na Figura 2.
  3. Ligue a lâmpada UVB e deixe-a operar até que a intensidade esteja estável. Coloque o radiômetro UVX ligando-o conforme monitorado usando um radiômetro UVX equipado com um cabeçote de medição UVB. Certifique-se de ligar o radiômetro UVX para 20 mW/cm2 e ler as configurações no radiômetro. Deixe a lâmpada UVB aquecer e estabilizar por pelo menos 2 min. Quando a lâmpada estiver pronta para uso, retire o radiômetro UVX.
  4. Use uma gaiola limpa diferente da gaiola doméstica para irradiação e coloque-a na capa biológica sob a lâmpada UV. Transfira os camundongos para a gaiola de irradiação antes do tratamento com a lâmpada UV LIGADA ou DESLIGADA para as respectivas exposições UV ou simuladas. Trate apenas 2 ratos de cada vez para fornecer espaço suficiente.
    NOTA: A câmara tinha uma área de piso de 500 cm2 e uma altura interna de 14 cm para permitir que os ratos se movessem livremente sem subir uns nos outros durante a irradiação. A razão para usar a câmara de exposição é evitar que os camundongos se sobreponham durante a exposição e garantir que todos os camundongos recebam a mesma quantidade de exposição UVB. A introdução de mais de dois camundongos na câmara levará a um cenário em que os camundongos sobem uns nos outros, o que criará inconsistência na dose de UVB administrada a cada camundongo.
  5. Calcule a quantidade de tempo necessária para expor os ratos à intensidade UVB desejada usando a calculadora. Por example, se o radiômetro UVX mostrar 2 mW / cm2 na tela do monitor e a exposição desejada for 50 mJ / cm2 a ser dada aos camundongos, exponha os camundongos por 25 s na câmara de irradiação UV enquanto a lâmpada UV estiver ligada.
    NOTA: Antes de começar, certifique-se de colocar o equipamento de proteção apropriado, conforme mencionado na etapa 4.1. A duração da exposição durante todo o tratamento variou entre 20-120 s. No entanto, a duração pode variar de acordo com a intensidade da radiação da lâmpada UVB e, portanto, deve ser calculada para cada tratamento. Não se espera que os camundongos sejam removidos do estudo, pois não há sinais de perda de peso, sinais de dor, incluindo queimaduras graves na pele, sangramento, eritema, apatia ou dificuldade para respirar com este protocolo.
  6. Exponha camundongos machos e fêmeas separadamente e limpe a câmara com desinfetante entre cada sexo para evitar contaminação cruzada de odores para os estudos comportamentais. Em caso de exposição de diferentes grupos de camundongos que foram tratados com tratamento adicional ou animais geneticamente transgênicos ou de controle, limpe a câmara entre a exposição de cada grupo para evitar a contaminação cruzada de fatores desconhecidos que são diferentes entre os dois grupos.

5. Exposição UVB

  1. Ligue o UVB lamp e configure-o a partir da etapa 4.1. para 4.5.
  2. Transfira os camundongos da gaiola doméstica para a câmara de exposição pelo tempo desejado. Exponha os camundongos ao UVB uma vez por dia durante os dias experimentais desejados (aqui, fizemos 5 dias/semana) por 8 semanas com um suporte XX-15 equipado com lâmpadas UVB de 15 W e 302 nm.
    NOTA: A duração da exposição é subjetiva e depende da questão científica. Os animais não devem desenvolver eritema cutâneo. Em caso de eritema, interrompa imediatamente a exposição e informe ao veterinário. Foram utilizados 5 dias/semana de exposição, excluindo os finais de semana. A frequência da dose de UVB pode ser reduzida em condições semelhantes a este protocolo, mas a exposição adicional exigirá calibração do experimentador.
  3. Exponha os camundongos a uma dose de UVB de 50 mJ / cm2, uma dose sub-eritemática na cepa de camundongo C57BL / 6J.
    NOTA: Uma dose de UVB de 50 mJ / cm2 é uma dose sub-eritemática, e usamos essa dose por 8 semanas nos camundongos experimentais. Em outros experimentos, usamos uma única exposição UVB de 200 mJ / cm2 para estudar danos ao DNA4.
  4. Coloque os camundongos raspados irradiados simulados (não expostos a UVB) na câmara de radiação por um período igual de tempo sem ligar a lâmpada UVB e use-os como controle da exposição UVB.
    NOTA: Como os camundongos são neofóbicos, os experimentos envolvendo camundongos devem sempre ter o grupo controle, que passa pelo mesmo pseudo-tratamento do experimental.

6. Análise de exposição UVB

NOTA: Os camundongos foram sacrificados usando asfixia por CO2 de acordo com as diretrizes da AVMA.

  1. Para validar a eficiência da radiação, medir a pigmentação da orelha e da cauda (Figura 2) usando um espectrofotômetro dérmico ou instrumento similar ou imunomarcando biópsias de pele seguidas de coloração de Fontana Masson, conforme descrito anteriormente4.
  2. Validação usando espectrofotômetro dérmico: Calibre o espectrofotômetro dérmico para definir a linha de base usando papel branco limpo e comum. Assim que a calibração for concluída, coloque o sensor de medição na orelha ou cauda do mouse e anote as leituras de intensidade de melanina. Os níveis de melanina nos camundongos irradiados por UVB simulado e irradiado por UVB são mostrados na Figura 3.
  3. Validação por imunofluorescência: Corrigir biópsias de pele de camundongo (2 cm x 2 cm) em paraformaldeído a 4% e incorporar em blocos de parafina. Corar fatias de tecido de 10 μm de espessura com anticorpo anti-CPD (usado na concentração de 1:100)24 durante a noite a 4 °C, seguido de anticorpos secundários marcados com fluorescência (anticorpo secundário conjugado com Alexa-594 de cabra anti-coelho na concentração de 1:1000)24 por 1 h à temperatura ambiente. Contra-corar os tecidos com DAPI e obter imagens usando microscopia de fluorescência.
  4. Validação por meio da coloração de Fontana Masson: Corrija biópsias de pele de camundongo em paraformaldeído a 4% e incorpore-as em blocos de parafina. Corar fatias de tecido de 10 μm para melanina usando o protocolo de coloração Fontana Masson4 com nitrato de prata e solução de cloreto de ouro. Contracore as biópsias de tecido com solução nuclear rápida e monte-as usando um suporte de tecido, seguido de captura de imagem de campo claro no microscópio.

7. Cuidados com os animais

  1. Realizar experimentos com animais de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.
  2. Pese os ratos semanalmente para avaliar seu estado básico de saúde. Remover os animais com > diminuição de 15% do peso entre as medições do experimento. Remova os animais que apresentam sinais de dor, incluindo queimaduras graves na pele, sangramento, eritema, apatia ou dificuldade para respirar devido à exposição aos raios UVB e sacrifique de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.

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Resultados

Este artigo de método menciona o procedimento passo a passo detalhado de geração do modelo de camundongo de exposição UVB. A Figura 1 demonstra claramente a área raspada do camundongo C57BL / 6J representativo no lado dorsal antes da exposição ao UVB, demonstrando que 50% -60% da área dorsal foi raspada. O protocolo de barbear não mostra sinais de eritema cutâneo, o que é de extrema importância para estudos dermatológicos. A Figura 2 mostra a configuração da exp...

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Discussão

O UVB é reconhecido há muito tempo como um fator de risco ambiental para câncer de pele; no entanto, estudos recentes iluminaram um espectro mais amplo de efeitos UVB3. Há necessidade de estudos que forneçam uma compreensão mais profunda dos efeitos sistêmicos do UVB. As diferentes doses usadas na pesquisa básica em comparação com os ambientes clínicos complicam nossa compreensão dos efeitos do UVB, ressaltando a importância da pesquisa que preenche essas lacunas....

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

C.L. reconhece o apoio financeiro do Conselho Europeu de Pesquisa no âmbito do programa de pesquisa e inovação Horizonte 2020 da União Europeia (contrato de subvenção nº 726225), do Centro de Regulação de Genes I-CORE em Doenças Humanas Complexas (nº 41/11) e da Fundação de Ciência de Israel (ISF; concessão 129/13).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Desinfetante Amizade internacionalNão aplicável
Câmara de exposiçãoFeito em casaNão aplicável
Creme depilatórioVeetNão aplicável
Barbeador de cabeloHeiniger707-303 120V EUA
Isoflurano Cuidados Intensivos PiramalNão aplicável
Sistema isofluranoKent CientíficoVetFlo-1210S
PBSSigma AldrichTMS-012
Câmara de plexi-vidroFeito em casaNão aplicável
Lâmpada UVBProdutos UltravioletaSérie XX - 15 Watts
Radiômetro UVXProdutos Ultravioleta97-0015-02

Referências

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