Artigo de método

Um modelo de camundongo de transformação hemorrágica induzida por hiperglicemia aguda combinada com isquemia focal transitória

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DOI:

10.3791/67371

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15 de novembro de 2024

 ,  ,  , 
1Hubei Key Laboratory of Cognitive and Affective Disorder, Institute of Biomedical Sciences, School of Medicine, Jianghan University

* These authors contributed equally

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Resumo

Este estudo apresenta um protocolo para o estabelecimento de um modelo animal altamente reprodutível de transformação hemorrágica (TH) usando oclusão/reperfusão da artéria cerebral média (MCAO/R) em camundongos C57BL/6 com hiperglicemia aguda.

Resumo

A transformação hemorrágica (TH) é uma complicação grave que pode ocorrer como resultado da terapia trombolítica após acidente vascular cerebral isquêmico (AVC) isquêmico (AVC) e apresenta limitações significativas na aplicação clínica do ativador de plasminogênio tecidual recombinante (rt-PA). Infelizmente, atualmente não há intervenções eficazes disponíveis para TH na prática clínica. Portanto, há uma necessidade urgente de modelos animais experimentais estáveis e confiáveis para elucidar a patogênese da TH e desenvolver estratégias de intervenção eficazes. Este estudo apresentou um protocolo para estabelecer um modelo de camundongo de TH induzida por hiperglicemia aguda combinada com isquemia focal transitória (tMCAO). Camundongos C57BL/6J machos foram injetados com glicose a 30% para induzir hiperglicemia e, em seguida, submetidos a 60 min de tMCAO com reperfusão. O volume do infarto, a integridade da barreira hematoencefálica (BHE) e o grau de hemorragia intracraniana foram avaliados 24 h após a OCM. Os resultados mostraram que a injeção de glicose levou à hiperglicemia transitória (14,3-20,3 mmol / L), o que aumentou significativamente o volume do infarto e a incidência de TH. A coloração de hematoxilina-eosina (H & E) indicou lesões hemorrágicas significativas dentro da zona de infarto em camundongos hiperglicêmicos. Além disso, camundongos hiperglicêmicos exibiram interrupção agravada da BHE, conforme mostrado pelo vazamento mais grave de azul de Evans (EB) e FITC-Dextran. Em conclusão, a hiperglicemia aguda resultou de forma confiável e consistente em TH macroscópica em um modelo de camundongo de tMCAO. Este modelo reprodutível oferece uma ferramenta valiosa para investigar os mecanismos patológicos da TH e desenvolver intervenções terapêuticas correspondentes.

Introdução

O infarto cerebral é a principal causa de incapacidade e a segunda principal causa de morte em adultos em todo o mundo1. A fase aguda desempenha um papel crucial na progressão do infarto cerebral, servindo como um ponto crucial para o tratamento da doença. A restauração precoce e oportuna do fluxo sanguíneo na área da penumbra é essencial para evitar a morte de células cerebrais, com trombólise e terapia intervencionista representando os pilares do tratamento do infarto cerebral agudo (ACI). No entanto, a transformação hemorrágica (TH) representa uma complicação significativa após trombólise e terapia intervencionista, ocorrendo em 15% a 30% dos pacientes com AVC isquêmico, limitando sua aplicação em alguma medida 2,3. A ocorrência de TH aumenta significativamente o risco de mortalidade e incapacidade, afetando o prognóstico da ACI. Portanto, é de grande importância clínica investigar os mecanismos patológicos da TH e identificar alvos terapêuticos eficazes.

Atualmente, a oclusão da artéria cerebral média induzida por embolia por fio (MCAO) é frequentemente utilizada como modelo de TH em roedores4. A obstrução prolongada pode resultar em infarto cerebral maciço envolvendo o córtex e o estriado, potencialmente levando à TH secundária. O Thread MCAO não requer craniotomia, é altamente reprodutível e produz dano cerebral focal e TH semelhante a um acidente vascular cerebral humano. No entanto, esse modelo mecânico tem algumas desvantagens distintas, incluindo altas taxas de mortalidade precoce e baixas taxas de sobrevida em longo prazo5. Outro modelo de TH frequentemente utilizado é o modelo de trombólise, no qual a formação de coágulos sanguíneos é induzida primeiramente no vaso-alvo, seguido pelo uso de drogas trombolíticas (por exemplo, rt-PA, varfarina) para dissolver o coágulo, mimetizando o processo clínico da TH no AVC isquêmico 6,7. Apesar de replicar em grande parte o processo patológico da terapia trombolítica clínica, os modelos animais de TH induzidos por rt-PA ou varfarina são difíceis de implementar e associados a alta mortalidade animal, bem como incidência e localização variáveis de sangramento. Para avançar na pesquisa translacional básica e clínica sobre TH após infarto cerebral, é essencial estabelecer um modelo animal reprodutível de TH que seja fácil de operar e ofereça alta estabilidade.

A hiperglicemia é um contribuinte significativo para a TH após isquemia/reperfusão cerebral (I/R)8. Vários estudos retrospectivos analisaram os dados clínicos de pacientes submetidos à trombectomia mecânica, revelando que níveis elevados de glicemia na admissão estão ligados a uma maior incidência de HA espontânea3. Em pacientes diabéticos com AVC, a hiperglicemia aumenta significativamente o risco de TH e leva a déficits neurológicos mais graves 9,10. Os pesquisadores desenvolveram modelos de HT induzindo I/R cerebral em modelos animais diabéticos por meio do MCAO. No entanto, o modelo diabetes-MCAO tem longa duração experimental, procedimento complexo e alto custo11,12. Um modelo confiável de TH pode ser estabelecido induzindo hiperglicemia aguda por meio de injeção intraperitoneal de glicose e integrando-o a um modelo de I/R cerebral gerado pela técnica de sutura. Este método é facilmente realizado com posição de sangramento consistente e imita efetivamente as características clínicas da hiperglicemia pós-AVC. No entanto, existem diferenças significativas em condições cruciais, como tempo isquêmico e concentração de glicose; além disso, a estabilidade do modelo e a incidência de TH são inconsistentes em diferentes literaturas.

Nosso grupo de pesquisa utilizou extensivamente o método de hiperglicemia aguda-MCAO para estabelecer um modelo de HT. Além disso, realizamos uma série abrangente de experimentos para explorar a relação entre o tempo isquêmico, a concentração de glicose no sangue, a taxa de incidência de TH e a mortalidade animal. Esses experimentos acabaram levando à identificação de condições ideais para a criação de um modelo HT pós-infarto cerebral. Este estudo apresenta um protocolo detalhado para estabelecer um modelo de TH induzida por hiperglicemia aguda usando injeção intraperitoneal de glicose a 30% combinada com MCAO embólico.

Protocolo

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Jianghan (JHDXLL2024-080) e conduzido de acordo com as Diretrizes Éticas de Animais Experimentais emitidas pelo Centro de Controle de Doenças da China. Camundongos C57BL / 6J machos adultos pesando 21-26 g foram usados neste estudo. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Agrupamento animal e indução de hiperglicemia aguda

  1. Alojar os camundongos no centro de animais de laboratório da Universidade de Jianghan em um ambiente controlado de ciclo claro/escuro de 12 horas (20–22 °C, 50%–55% de umidade) com comida e água ad libitum.
  2. Divida aleatoriamente os camundongos em quatro grupos: Sham + solução salina (n = 12), Sham + glicose (n = 12), MCAO + solução salina (n = 12) e MCAO + glicose (n = 20).

2. Preparo pré-operatório

NOTA: Todos os camundongos experimentais jejuaram por 12 h antes da cirurgia.

  1. Administre analgesia sistêmica (meloxicam, 5 mg/kg subcutâneo) e anestesia local no local da incisão (bupivacaína, 2 mg/kg subcutânea) no perioperatório.
  2. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos, cotonetes e suturas cirúrgicas em autoclavagem nas condições de 121 °C e 15 psi por 30 min.
  3. Limpe a plataforma cirúrgica e a área de trabalho circundante com etanol a 75% e ligue o interruptor de aquecimento com a temperatura ajustada para 37 °C.
  4. Anestesie o camundongo com uma mistura de isoflurano a 3% e gás oxigênio a 20% na câmara de indução anestésica. Em seguida, avalie o reflexo de pinça do dedo do pé para testar a profundidade da anestesia.
  5. Mova o mouse na plataforma cirúrgica em decúbito ventral e insira rapidamente o nariz do mouse no cone do nariz. Abra o fluxo de gás para o cone do nariz, fechando o fluxo para a câmara de indução de anestesia. Ajuste a proporção de isoflurano para 2% e defina o fluxo da mistura de gases para 0,4 mL/min para manutenção da anestesia.
  6. Aplique gel ocular nos olhos do camundongo para manter a umidade durante a cirurgia.
  7. Raspe o cabelo da região do pescoço usando o cortador de animais. Limpe e desinfete a pele alternando a aplicação com iodo e etanol 70% usando um algodão desinfetante.
  8. Cubra uma gaze estéril no pescoço e faça uma abertura para expor a região operatória.

3. Medição do fluxo sanguíneo cerebral basal

  1. Raspe o cabelo da região do couro cabeludo usando o cortador de animais. Limpe e desinfete o couro cabeludo alternando a aplicação com iodo e etanol 70% usando um cotonete desinfetante.
  2. Faça uma incisão na linha média de 1,0 cm de comprimento na pele sobre a região frontal para expor a fontanela craniana. Mantenha o crânio úmido com solução salina normal.
  3. Prepare o instrumento de fluxometria Doppler a laser (LDF) e segure a ponta da sonda LDF perpendicular à superfície do crânio parietal esquerdo (1 mm posterior e 5 mm lateral ao bregma); uma vez que o FLUX esteja estável e registre o valor da linha de base.
    NOTA: A unidade de medida do FLUX é Unidades de Perfusão (PU), com uma faixa de medição de 0-1000 PU. O CBF basal ideal em uma fluxometria Doppler a laser é >600 PU. Um período contínuo de 5 segundos com uma faixa de flutuação inferior a 10% é considerado como leitura FLUX válida.
  4. Suturar o músculo e a pele separadamente com sutura absorvível 5.0 PGA. Aplique gel de diclofenaco sódico e pomada de mupirocina na ferida.

4. Procedimento cirúrgico MCAO

NOTA: A AOCM é realizada usando um método de oclusão de rosca modificado, conforme descrito anteriormente por Chiang et al.13.

  1. Vire suavemente o mouse para a posição supina e administre glicose a 30% por via intraperitoneal (7,2 mL / kg) ou solução salina normal aos camundongos 15 minutos antes do procedimento cirúrgico.
    NOTA: Camundongos dos grupos Sham + glicose e MCAO + glicose receberam injeções intraperitoneais de glicose. Camundongos dos grupos Sham + solução salina e MCAO + solução salina receberam injeções intraperitoneais de solução salina normal.
  2. Raspe o cabelo da região do pescoço usando o cortador de animais. Limpe e desinfete a pele alternando a aplicação com iodo e etanol 70% usando um algodão desinfetante. Cubra uma gaze estéril no pescoço e faça uma abertura para expor a região operatória.
    NOTA: Certifique-se de que a incisão seja mantida reta para obter uma visualização ideal da artéria carótida.
  3. Faça uma incisão na linha média de 1,5 cm na face ventral do pescoço usando um bisturi. Separe o tecido subcutâneo e a fáscia superficial usando uma pinça cirúrgica.
    NOTA: Certifique-se de que a incisão seja mantida reta para obter a visualização ideal da artéria carótida.
  4. Abaixo da fáscia superficial, localize a glândula submandibular e um triângulo invertido formado por três músculos: o esterno-hióideo, posicionado na linha média sobre a traqueia; o ventre posterior do músculo digástrico, reconhecível por sua parte tendínea branca brilhante; e, finalmente, o músculo esternomastóideo.
  5. Realize a dissecção romba dentro do triângulo invertido para identificar e separar a artéria carótida comum esquerda (CCA).
  6. Disseque o nervo vago adjacente ao CCA e o tecido mucoso ao redor dos vasos sanguíneos usando uma pinça oftálmica. Faça uma campainha no CCA usando uma sutura absorvível de ácido poliglicólico (PGA) 5.0, mas mantenha a sutura destensionada.
  7. Separada para cima ao longo da ACC, uma bifurcação em "Y" pode ser observada para dividir a ACC em artéria carótida externa (ACE) e artéria carótida interna (ACI).
  8. Separe a bifurcação para expor totalmente o ECA e o ICA. Enrole e amarre firmemente uma sutura absorvível 5.0 PGA ao redor do ECA distalmente da bifurcação.
    NOTA: Garanta uma distância suficiente entre o local da ligadura permanente e a bifurcação vascular para evitar que o fio se desloque durante a rotação do ECA.
  9. Clampeie temporariamente o CCA e o ICA usando dois grampos de artéria arterial microsserrafina leve de 8 mm x 2 mm para bloquear o fluxo sanguíneo do CCA para o ICA.
  10. Estique o laço de sutura no ECA distal e no CCA para endireitar o segmento ECA.
  11. Use uma microtesoura para fazer uma pequena incisão entre os dois laços de sutura no ECA.
  12. Insira uma sutura de monofilamento revestida de silicone (30 mm de comprimento, 3–4 mm de silício revestido) no ECA. Enrole e amarre levemente uma segunda sutura absorvível 5.0 PGA no ECA perto da bifurcação para evitar que a sutura do monofilamento recue.
  13. Corte completamente a ECA distal à ligadura permanente e remova a pinça da artéria da ACI.
  14. Retire a sutura até a bifurcação do CCA, depois retraia e gire cuidadosamente o coto ECA. Ajuste a direção de inserção da sutura e insira-a lentamente, aproximadamente 9,0–10,0 mm da bifurcação CCA na ACI, para ocluir a ACM.
  15. Aperte a segunda sutura absorvível PGA ao redor do ECA e remova a pinça da artéria do CCA.
  16. Suturar o músculo e a pele separadamente com sutura absorvível 5.0 PGA. Aplique gel de diclofenaco sódico e pomada de mupirocina na ferida.
  17. Vire suavemente o mouse para a posição de bruços e repita a etapa 3.4. para registrar o fluxo sanguíneo após a oclusão da ACM.
    NOTA: Os camundongos que exibiram uma redução do fluxo sanguíneo inferior a 40% do valor basal após o MCAO foram excluídos do estudo14.
  18. Ligue o interruptor de aquecimento da gaiola de recuperação com a temperatura ajustada para 37°C. Coloque o mouse na gaiola de recuperação durante o período pós-oclusão (60 min).

5. Remoção e reperfusão de monofilamentos

  1. Re-anestesiar o mouse como descrito anteriormente, pouco antes do período de oclusão deve terminar.
  2. Clamp o CCA usando um grampo de artéria microclip.
  3. Retraia parcialmente o monofilamento do ICA até que a ponta revestida de silicone se torne visível através do ICA.
  4. Coloque outra braçadeira de artéria microclip na ACI acima da ponta revestida de silicone.
  5. Retire completamente o monofilamento e ligue firmemente o coto ECA.
  6. Remova a pinça da artéria microclip da ACI e da CCA, respectivamente.
  7. Suturar o músculo e a pele camada por camada usando sutura absorvível 5.0 PGA.
  8. Coloque o mouse na câmara de recuperação e monitore todos os ratos até que estejam totalmente acordados. Administre meloxicam (5 mg/kg, por via subcutânea) para alívio da dor a cada 12 h por até 24 h.

6. Medição de glicose no sangue

NOTA: Os níveis de glicose no sangue foram medidos nos seguintes momentos: (1) imediatamente antes da cirurgia MCAO (linha de base), (2) imediatamente após a inserção do monofilamento (15 min após a injeção de glicose), (3) imediatamente após a retirada do monofilamento imediatamente após a inserção do monofilamento (75 min após a injeção de glicose).

  1. Limpe a cauda do rato com uma bola de algodão alcoólica para tornar a veia da cauda totalmente hiperêmica.
  2. Corte a ponta da cauda em 1–2 mm usando uma tesoura cirúrgica.
  3. Aperte suavemente ao longo da raiz da cauda até a ponta da cauda, facilitando o fluxo de sangue para fora da incisão.
  4. Posicione o sample tanque de absorção do papel de teste na borda da gota de sangue.
    NOTA: O sangue será retirado para o papel de teste devido ao efeito de sifão.
  5. Leia a leitura do medidor de glicose no sangue e registre o resultado.
    NOTA: Exclua os camundongos cujos níveis de glicose no sangue não subiram acima de 10 mmol / L após 15 minutos de injeção de glicose.
  6. Remova qualquer excesso de sangue usando uma bola de algodão e aplique pressão para estancar o sangramento.

7. Coloração de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC)

  1. Eutanasiar o camundongo por injeção intraperitoneal de uma overdose de pentobarbital (300 mg / kg).
  2. Assim que o mouse parar de respirar, imobilize-o imediatamente em decúbito dorsal.
  3. Abra o tórax usando uma tesoura e corte o diafragma para expor o coração.
  4. Insira uma agulha de injeção de 23 G no ventrículo esquerdo do camundongo e faça uma incisão no apêndice auricular com uma tesoura.
  5. Perfunda 15 mL de soro fisiológico até que o líquido drenado do apêndice auricular pareça claro e transparente.
  6. Decapite o rato e corte o couro cabeludo para expor totalmente o crânio usando uma tesoura. Insira a ponta da tesoura 2 mm ligeiramente à frente da sutura coronal do crânio para abri-la.
  7. Use uma pinça para remover o tecido cerebral do camundongo intacto.
  8. Coloque o tecido cerebral em uma matriz cerebral de roedor e corte-o em fatias coronais de 2 mm.
  9. Transfira as fatias para uma placa de 24 poços e incube-as com solução de TTC a 2% a 37 °C por 15 min.
  10. Inicie o software de digitalização e defina as configurações dos parâmetros para uma resolução de 1200 dpi e um formato JPG para análise de imagem.
  11. Prenda as seções de tecido da placa de 24 poços com uma pinça curva e organize as seções na placa de varredura de vidro.
  12. Digitalize as seções de tecido e exporte as imagens para análise de medição.
  13. Meça a área do infarto corrigindo o inchaço do tecido. Subtraia a área não infarto do lado ipsilateral da área do lado contralateral usando o software ImageJ15. Avalie o tamanho do infarto como uma porcentagem do hemisfério contralateral. Para obter detalhes adicionais sobre a análise da área do infarto, consulte Friedländer et al.16.

8. Observação Gross

  1. Repita as etapas 7.1–7.8.
  2. Corte as seções de tecido da matriz cerebral com uma pinça curva e organize as seções na placa de varredura de vidro.
  3. Examine as seções coronais do cérebro conforme descrito nas etapas 7.10 e 7.12.

9. Coloração de hematoxilina e eosina (H & E)

  1. Repita as etapas 7.1 a 7.4. Perfundir lentamente 15 mL de solução salina normal, seguida de perfusão de aproximadamente 15 mL de paraformaldeído (PFA).
  2. Repita as etapas 7.6–7.7. Fixe o tecido cerebral com 4% de PFA por 24 h em temperatura ambiente.
  3. Coloque o tecido cerebral fixo no desidratador de tecido automatizado para desidratação, vitrificação e imersão em cera.
  4. Incorpore o tecido em cera de parafina e corte o tecido cerebral em fatias coronais de 5 μm de espessura por micrótomo.
  5. Desparafine a fatia mergulhando-a em xileno três vezes, com cada imersão durando 8 min. Em seguida, mergulhe gradualmente a fatia em soluções de etanol de concentrações decrescentes (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), seguidas de água destilada, com cada etapa com duração de 5 min.
  6. Manchar a fatia com solução de hematoxilina durante 3 min. Em seguida, diferencie-o imergindo-o em álcool ácido clorídrico a 5% por 5 s.
  7. Incubar a fatia com solução de eosina por 1 min, depois desidratar e hialinizar com solução de etanol gradiente (90%, 95%, 100%) e xileno.
  8. Monte a seção com resinas neutras.
  9. Capture as imagens de fatias de cérebro coradas com H & E sob um campo brilhante usando microscopia de fluorescência.

10. Determinação do lekage Evans Blue (EB)

NOTA: Para obter detalhes sobre este procedimento, consulte Wang et al.17.

  1. Injete solução de Evans Blue (EB) a 2% (p / v) (2 mL / kg) através da veia da cauda 23 h após o MCAO.
  2. Repita as etapas 7.1 a 7.7 uma hora após a injeção de EB e capture uma foto de todo o cérebro.
  3. Coloque o cérebro em uma matriz de cérebro de roedor e corte-o coronalmente em fatias de 2 mm. Examine as seções coronais do cérebro conforme descrito nas etapas 7.10 a 7.12 para observar o vazamento de EB.
  4. Divida as fatias em porções direita e esquerda e coloque cada uma em um tubo de centrífuga.
  5. Homogeneizar cada fatia de tecido cerebral em ácido tricloroacético a 50%, com uma proporção de 100 mg de tecido cerebral para 0,4 mL de ácido tricloroacético.
  6. Depois de incubado a 4 °C durante a noite, centrifugue o homogenato durante 30 min a 10.000 x g (a 4 °C).
  7. Transferir o líquido sobrenadante para outro tubo de centrifugação e diluí-lo quatro vezes com etanol.
  8. Medir a absorvância do líquido sobrenadante a 620 nm com um espectrofotómetro.
  9. Converta os valores de absorbância para a concentração de EB usando uma curva padrão de EB em etanol (por exemplo, a 31,25, 62,5, 125 e 250 ug / mL).
    NOTA: O resultado é apresentado como um micrograma de EB por grama de tecido cerebral.

11. Determinação de vazamento de FITC-Dextrano

  1. Injete FITC-Dextran (10 KDa, 6 mg / mL, diluído em 0,01M PBS; 4 mL / kg) na veia da cauda 24 h após o MCAO, permitindo que circule no sangue por 10 min.
  2. Repita as etapas 7.1 a 7.7 para realizar a perfusão e remover o tecido cerebral intacto.
  3. Fixe o tecido cerebral em PFA a 4% por 24 h em temperatura ambiente no escuro.
  4. Transfira o tecido cerebral fixo para a solução de sacarose com concentrações gradientes de 10%, 20% e 30% (diluído em 0,01M PBS) para desidratação.
  5. Incorpore o tecido cerebral usando o composto de temperatura de corte ideal (OCT) e corte em seções de tecido cerebral de 30 μm de espessura. Transfira as seções para uma lâmina de microscópio usando uma alça de inoculação e certifique-se de que elas adiram à superfície da lâmina.
  6. Monte as seções de tecido cerebral usando um meio de montagem contendo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
  7. Inicie a microscopia confocal a laser e seu software de controle.
  8. Fixe a lâmina do microscópio no objeto stage e localize a área do infarto sob a ocular de 200x.
  9. Defina a resolução para 1024 x 1024 e ajuste o valor de ganho e o tempo de exposição para obter a imagem mais nítida possível.
  10. Adquira as imagens da região corada com FITC-Dextran do infarto cerebral sob um comprimento de onda de excitação de 488 nm.

Resultados

O procedimento experimental deste estudo está ilustrado na Figura 1. Resumidamente, os camundongos foram submetidos a MCAO induzida por oclusão de thread por 60 min, seguido de reperfusão. A glicose (30% em solução salina normal, 7,2 mL/kg de peso corporal) foi administrada por via intraperitoneal 15 min antes do MCAO. Os níveis de glicose no sangue foram medidos no início (antes da injeção de glicose), imediatamente após a OCM e no momento da reperfusão. Após 24 h de reperfusão, os camundongos foram eutanasiados e os tecidos cerebrais foram coletados para análise do volume do infarto, vazamento da barreira hematoencefálica e histopatologia. Conforme ilustrado na Figura 2, todos os quatro grupos exibiram níveis basais de glicose no sangue semelhantes. No entanto, os camundongos que receberam injeções de glicose apresentaram níveis de glicose no sangue significativamente elevados em comparação com os dos grupos salinos.

Conforme ilustrado na Figura 3A, nenhum infarto visível foi observado em fatias de cérebro no grupo Sham + solução salina ou Sham + glicose, enquanto o infarto cerebral acentuado foi claramente revelado pela coloração TTC em fatias de cérebro de ambos os grupos MCAO. Além disso, os camundongos injetados com glicose exibiram um maior volume de infarto em comparação com aqueles injetados com solução salina normal nos diferentes grupos MCAO. De acordo com a análise estatística, o volume do infarto foi de 20,8% ± 0,8% e 45,1% ± 1,6% no grupo OCM + solução salina e no grupo OCM + glicose, respectivamente (Figura 3B).

As observações macroscópicas não revelaram hemorragias no hemisfério cerebral esquerdo do grupo MCAO + solução salina ou do grupo Sham + solução salina / glicose. Em contraste, múltiplas hemorragias puntiformes foram observadas no hemisfério cerebral isquêmico do grupo MCAO + glicose (Figura 4A). Imagens de varredura de cortes cerebrais coronais consecutivos mostraram que as hemorragias no grupo MCAO + glicose estavam distribuídas nas regiões de infarto do córtex e estriado (Figura 4A). Além disso, a análise histológica usando coloração H & E demonstrou infiltração significativa de células sanguíneas nas regiões de infarto do córtex e estriado no grupo MCAO + glicose (Figura 4B). Por outro lado, nenhuma infiltração de células sanguíneas foi observada no grupo MCAO + solução salina ou no grupo Sham + solução salina / glicose.

Conforme ilustrado na Figura 5A, nenhum vazamento de EB foi observado nas fatias cerebrais do grupo Sham + glicose. No entanto, ambos os grupos MCAO mostraram coloração azul distinta devido ao vazamento de EB. Além disso, em comparação com camundongos injetados com solução salina, aqueles injetados com glicose exibiram aumento da permeabilidade EB 24 h pós-MCAO. Em comparação com o grupo Sham + salina, o grupo MCAO + solução salina demonstrou um aumento significativo no conteúdo de EB (4,2 μg/g ± 1,8 μg/g vs. 28 μg/g ± 0,7 μg/g, p < 0,01), que foi ainda mais elevado no grupo MCAO + glicose (28 μg/g ± 0,7 μg/g vs. 65,5 μg/g ± 6,0 μg/g, p < 0,01) (Figura 5B). Conforme ilustrado na Figura 5C, o extravasamento de FITC-Dextran foi mais intenso no córtex cerebral isquêmico e estriado do grupo MCAO + glicose em comparação com o grupo MCAO + solução salina.

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Figura 1: Diagrama esquemático do procedimento experimental. Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com glicose a 30% ou solução salina antes da cirurgia de MCAO, com glicose no sangue monitorada durante o procedimento. 24 h após a reperfusão, os camundongos foram eutanasiados para análise patológica e histológica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Alterações nos níveis de glicose no sangue em vários momentos após a injeção de glicose a 30%. Os dados são apresentados como média ± DP. N = 10-20. p < 0,001 em comparação com o grupo Sham + solução salina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: A hiperglicemia piorou o dano cerebral isquêmico 24 h após a reperfusão. (A) Imagens representativas de cortes coronais corados com TTC, com tecido cerebral normal aparecendo vermelho-rosado e áreas de infarto isquêmico aparecendo branco-acinzentado. Barra de escala = 5 mm. (B) Análise estatística do volume do infarto. Os dados são apresentados como média ± DP. N = 3. p < 0,001 em comparação com o grupo Sham + solução salina, ##p < 0,01 em comparação com o grupo MCAO + solução salina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: A hiperglicemia aumentou o risco de TH 24 h após a reperfusão. (A) Imagens representativas de observação macroscópica e cortes coronais. O asterisco indicava os focos hemorrágicos visíveis. Barra de escala = 5 mm. (B) Imagens representativas de meio cérebro coradas com H & E (superior) e imagens ampliadas (inferior). Barra de escala = 200 μm para imagens de meio cérebro; Barra de escala = 20 μm para imagens ampliadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Hiperglicemia agravou a ruptura da BHE 24 h após a reperfusão. (A) Imagens representativas do vazamento de azul de Evans. Barra de escala = 5 mm. (B) Análise estatística do vazamento de azul de Evans nos hemisférios isquêmicos. Os dados são apresentados como ± média DP, N = 3, **p < 0,01, *** p < 0,001 em comparação com o grupo Sham+salina, ##p < 0,01 em comparação com o grupo MCAO + solução salina. (C) Imagens representativas do córtex cerebral isquêmico corado com FITC-Dextran e estriado. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O protocolo atual foi projetado para criar um modelo animal confiável de transformação hemorrágica após AVC isquêmico, que pode replicar os efeitos nocivos da revascularização do vaso em condições hiperglicêmicas. Dentre os vários fatores de risco para AVC isquêmico, o nível glicêmico dentro de 24 h após o início do AVC está positivamente correlacionado com a exacerbação da lesão cerebral e aumento da mortalidade 3,18. Numerosas investigações clínicas também demonstraram que a hiperglicemia pós-AVC é um dos fatores de risco mais críticos para TH e piores resultados neurológicos19. No presente protocolo, 19 de 20 camundongos foram induzidos com sucesso a TH sob hiperglicemia aguda, resultando em uma taxa de modelagem bem-sucedida de aproximadamente 95%. Infelizmente, quatro camundongos morreram de hematoma cerebral grave dentro de 24 horas após a cirurgia MCAO e, portanto, foram excluídos de análises adicionais.

Modelos animais de TH induzidos por hiperglicemia têm sido utilizados em pesquisas pré-clínicas recentes. Won et al. demonstraram que a hiperglicemia promoveu a TH em um modelo de rato de tratamento de AVC tPA20. No entanto, os fatores patogênicos no modelo de HT de Won foram mais complexos, pois o próprio tPA pode aumentar o risco de TH. Em contraste, o protocolo atual utilizou hiperglicemia aguda combinada com MCAO e alcançou uma taxa de sucesso significativa de TH em camundongos. Notavelmente, existe variabilidade entre os modelos de TH induzida por hiperglicemia em relação à concentração de glicose, duração da isquemia, confiabilidade do modelo e ocorrência de TH 21,22,23,24. Alguns estudos utilizaram injeção de glicose a 50% para induzir níveis significativamente mais altos de glicose no sangue (20-28 mmol / L), superando a faixa típica observada em pacientes com AVC. A taxa de TH nesses experimentos varia de 70% a 73,3%, com uma taxa de mortalidade registrada em 37,5% em um modelo experimental. Em contraste, os procedimentos experimentais atuais envolveram o uso de uma injeção de glicose a 30% para induzir hiperglicemia aguda mantida entre 14,3 mmol / L e 20,3 mmol / L, alinhando-se melhor com a faixa de valores de glicose no sangue encontrados nos pacientes. Além disso, esses procedimentos exigiram um período de jejum para camundongos experimentais antes da cirurgia para regular seus níveis basais de glicose no sangue pré-operatórios para aproximadamente cerca de 5 mmol / L; não fazer isso pode resultar em um nível sanguíneo basal elevado de cerca de 10 mmol / L, levando subsequentemente a níveis excessivamente altos de glicose no sangue e, finalmente, taxas de mortalidade mais altas entre os camundongos.

Em um estudo recente, MacDougall et al. descobriram que a hiperglicemia levou a um aumento no tamanho do infarto, particularmente em um modelo de diabetes tipo 125. Os achados atuais indicam que o grupo administrado com glicose exibiu um tamanho de infarto maior após 60 min de isquemia em comparação com o grupo em condições salinas. Esse resultado é consistente com um experimento anterior que demonstrou o impacto prejudicial da glicose elevada na progressão do infarto na área da penumbra18. Nesse protocolo, a injeção pré-operatória de glicose a 30% resultou em hemorragia pontilhada cerebral após 24 h pós-MCAO. Consistente com os achados de gradação macroscópica, a análise histológica usando coloração H & E revelou infiltração significativa de células sanguíneas no estriado isquêmico e no córtex em camundongos com hiperglicemia aguda. Naturalmente, existem outros métodos disponíveis para avaliar a TH, como a medição da hemoglobina por ELISA ou ressonância magnética (RM). Embora o mecanismo fisiopatológico subjacente à TH permaneça indefinido, a ruptura da BHE é considerada sua principal causa após a isquemia cerebral26. Portanto, a interrupção da BHE pode refletir indiretamente a gravidade da TH. Este protocolo usou a coloração EB para testar a permeabilidade da BHE. Fatias cerebrais coradas com EB demonstram visualmente mudanças na permeabilidade da BHE e permitem a medição quantitativa do conteúdo do corante EB que permeou o tecido cerebral. Nos últimos anos, outros traçadores, como a fluoresceína-sódica e o FITC-Dextrano, têm sido amplamente utilizados para avaliar a permeabilidade da BHE em modelos animais de doenças neurológicas27,28. Assim, também realizamos um experimento de coloração com Dextran para delinear a localização e a extensão da lesão endotelial vascular com mais detalhes, observando o grau de vazamento do FITC-Dextran.

O protocolo atual tem várias limitações que não podem ser negligenciadas. Em primeiro lugar, a cirurgia MCAO requer um alto nível de proficiência do operador. É crucial garantir a entrega oportuna do fio embólico na ACM e a colocação precisa e a profundidade da oclusão. Atender a esses requisitos requer treinamento extensivo para o operador do experimento. Em segundo lugar, devido ao potencial da TH para piorar a lesão cerebral, os cuidados pós-operatórios são essenciais para melhorar as taxas de sobrevivência dos animais experimentais. Por fim, é importante reconhecer que os pacientes com AVC clínico geralmente apresentam vários fatores de risco para TH, como diabetes, pressão alta, fibrilação atrial e29 anos. Portanto, o presente modelo animal não pode replicar totalmente os mecanismos complexos envolvidos nesses fatores de risco.

Em conclusão, este protocolo replicou efetivamente a TH desencadeada pela hiperglicemia aguda em um modelo de camundongo de isquemia-reperfusão cerebral. Este modelo demonstra boa repetibilidade, alta estabilidade e alta taxa de sobrevivência animal, tornando-o adequado para uso generalizado em pesquisas pré-clínicas de TH.

Divulgações

Os autores não têm interesses conflitantes a divulgar.

Agradecimentos

A Figura 1 foi criada com o software BioRender (https://www.biorender.com/). Este estudo foi apoiado por doações do projeto orientador da Fundação de Ciências Naturais da Província de Hubei (nº 2022CFC057).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC)Sigma-Aldrich108380O corante para coloração TTC
Placa de cultura de 24 poçosCorning IncorporatedCLS3527O vaso para coloração TTC 30
% de injeção de glicoseKelun PharmaceuticalH42021188Indução de hiperglicemia aguda
% de paraformaldeídoWuhan Servicebio Technology
Co., Ltd. 		G1101Sutura
absorvível de ácido poliglicólicoJinhuan Medical Co., LtdKCR5315.0 Equipamento para cirurgia
Placa de cultura de 96 poçosCorning IncorporatedCLS3596EB que mede o conteúdo
anestesiaMidmark CorporationVMRAnestesia para animais
Meio de montagem antidesbotamento com DAPIBeyotime BiotechP0131Suporte para seções de tecido
Automação-desidratação de tecidos  Máquina
Leica BiosystemsTP1020Desidratar tecido
Microscopia confocalLeica BiosystemsSTELLARIS 5Aquisição de imagem
Gel de sódio diclofenacoMaYinglong FarmacêuticaH10950214Analgesia para solução de
coloração de eosinaServicebio TechnologyG1001O corante para H& Coloração E
Evans BlueAladdinE104208coloração EB Gel
ocularGuangzhou PharmaceuticalH44023098Material para cirurgia
Fitc-dextranSigma-Aldrich60842-46-8Avaliação da permeabilidade BBB
Microscópio de fluorescênciaOlympusBX51Aquisição de imagem
Micrótomo congeladoLeica BiosystemsCM1900Uso para seções congeladas
GlicosímetroYuWell580Medição de glicose no sangue
Solução de coloração de hematoxilinaServicebioG1004O corante para H & Coloração
E IodoLircon20020059Material para cirurgia
IsofluranoRwd Life ScienceR510-22-10Anestesia para animais
Medidor de fluxo sanguíneo Doppler a laserMoor InstrumentsmoorVMSMonitoramento do fluxo sanguíneo
MCAO SuturasRwd Life Science907-00023-01Material para cirurgia
MeloxicamBoehringer-IngelheimJ20160020Analgesia para animais
Kit de instrumentos microcirúrgicosRwd Life ScienceSP0003-MEquipamento para cirurgia
MicrótomoThermo Fisher ScientificHM325Produção de seção de tecido Lâmina
micrótomoLeica Biosystems819Produção de seção de tecido
Pomada de mupirocinaGlaxoSmithKlineH10930064Anti-infecção para animais
Bálsamo neutroAbsin Bioscienceabs9177Seal para H & E coloração
Centro de incorporação de parafinaThermo Fisher ScientificEC 350Produzir blocos de parafina
Pentobarbital sódicoSigma-AldrichP3761Eutanásia para animal
Solução salina tamponada com fosfatoBeyotime BiotechC0221AEnxágue para seção de tecido
ScannerEPSONV330Barbeador
de varredura de tecidoShenzhen Codos Electrical Appliances Co., Ltd.CP-9200Equipamento para cirurgia
EspectrofotômetroThermo Fisher Scientific1510-02362EB medição de conteúdo
sacaroseShanghai Macklin Biochemical57-50-1Desidratação para tecido
Tissue-Tek O.C.T. CompostoSakura4583Meio de inclusão de tecido
Ácido tricloroacéticoSigma-AldrichT6399EB Medição de conteúdo
4 Fixação de tecido Máquina de animal de Solução de

Referências

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Reimpressões e permissões

Errata


Formal Correction: Erratum: A Mouse Model of Hemorrhagic Transformation Induced by Acute Hyperglycemia Combined with Transient Focal Ischemia
Posted by JoVE Editors on 1/06/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/67371

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Um modelo de camundongo de transformação hemorrágica induzida por hiperglicemia aguda combinada com isquemia focal transitória
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