Artigo de método

Modelo de cicatrização de feridas de queimadura semelhante a um tabuleiro de xadrez de camundongos baseado em dispositivo de aquecimento digital

2.4K vistas

⸱

DOI:

10.3791/67375

⸱

27 de dezembro de 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

Neste artigo

Resumo

Um protocolo simplificado é apresentado para estabelecer um modelo de cicatrização de queimaduras em camundongos usando um dispositivo de aquecimento digital. Os locais experimentais semelhantes a tabuleiros de xadrez criados na pele facilitam uma análise funcional adicional para o ensaio de cicatrização de feridas.

Resumo

As queimaduras graves estão entre as condições mais traumáticas e fisicamente debilitantes, afetando quase todos os sistemas de órgãos e resultando em morbidade e mortalidade consideráveis. Dada a sua complexidade e o envolvimento de múltiplos órgãos, vários modelos animais foram criados para replicar diferentes facetas da queimadura. Os métodos usados para produzir superfícies queimadas variam entre os modelos animais experimentais. Este estudo descreve um modelo de queima de rato simples, econômico e fácil de usar para criar queimaduras consistentes de espessura total usando um dispositivo de aquecimento digital. A ponta deste dispositivo foi aplicada ao dorso de camundongos por 10 s a 97 ° C para estabelecer uma queimadura semelhante a um tabuleiro de xadrez e examinar a cicatrização de feridas sob o tratamento de um curativo experimental. Amostras de pele foram coletadas para análise histológica, incluindo coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e coloração de Masson. A cicatrização da ferida foi avaliada por meio da análise da área da ferida e exame microscópico de infiltração inflamatória, reepitelização e formação de tecido de granulação. O modelo de lesão por queimadura em camundongos pode servir como uma ferramenta fundamental no estudo da fisiopatologia das lesões térmicas e na avaliação de intervenções terapêuticas.

Introdução

As queimaduras são consideradas uma das lesões críticas à pele, causadas pela exposição ao calor, eletricidade, materiais químicos e exposição à radiação 1,2. Pode ser classificado em quatro graus, dependendo da profundidade da lesão, desde a epiderme até a espessura total da pele, e até mesmo os músculos e ossos. Pequenas queimaduras podem levar à formação de cicatrizes e aumentar o risco de infecção. Uma grande área de queimadura não apenas causa danos locais, mas também estimula distúrbios do coração, rins e outros órgãos ou sistemas do corpo por meio de inflamação grave e de longo prazo e respostas imunes, levando a sérias consequências sistêmicas e alta morbidade3. A maioria dos sobreviventes de queimaduras é acompanhada por deficiências físicas duradouras, sofrimento emocional e diminuição da qualidade de vida 4,5. Portanto, é importante estudar o processo patológico das queimaduras e os mecanismos de regeneração do tecido queimado.

Envolvidos em respostas imunes, regeneração tecidual e homeostase sistemática, os estudos in vitro não puderam investigar de forma abrangente o processo patológico de cicatrização de queimaduras. Assim, nas últimas duas décadas, a fim de explorar potenciais intervenções terapêuticas, diferentes modelos animais de cicatrização de queimaduras foram desenvolvidos para replicar as várias características da queimadura 6,7. As queimaduras geralmente são produzidas na superfície do dorso de porcos, ratos, camundongos, coelhos e outros animais após a depilação. O tempo de queima pode durar de 3 s a 30 s para formar danos térmicos de espessura parcial a total com uma faixa de 5% a 30% da área total da superfície corporal (TBSA)8. Atualmente, não existem modelos padronizados desses métodos em pesquisas com animais queimados devido à alta variabilidade das técnicas utilizadas. Os métodos usados para produzir superfícies queimadas variam entre os modelos animais experimentais, incluindo chama de gás9, banho de etanol em queima10, placa/barra metálica única pré-aquecida11,12, fervura ou água quente13,14. No entanto, a técnica de inflição de queimadura e a profundidade de queimadura produzida são frequentemente inconsistentes e mal descritas em estudos anteriores, o que é crucial para determinar a gravidade da queimadura e o método de tratamento da queimadura.

Este estudo tem como objetivo desenvolver um modelo animal de queimadura de camundongo simples, econômico e fácil de usar para criar queimaduras consistentes de espessura total em cenários clínicos simulados. Neste protocolo, usamos um dispositivo de aquecimento digital conveniente para controlar a profundidade da queimadura, ajustando a temperatura aplicada à pele. A ponta deste dispositivo pode ser alterada para diferentes tamanhos para induzir queimaduras térmicas com faixas variadas de TBSA. Isso permite a criação de uma queimadura semelhante a um tabuleiro de xadrez nas costas do camundongo, permitindo a comparação de vários tratamentos experimentais e de controle dentro do mesmo animal. Observamos e registramos o processo de fechamento da ferida. Amostras de pele foram colhidas para avaliação histológica (coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e tricrômico de Masson) em diferentes estágios da cicatrização da ferida. Essa abordagem reduz o número de animais usados no experimento e, portanto, reduz os custos econômicos, sendo mais compatível com a ética animal. Este estudo fornecerá aos pesquisadores ferramentas essenciais para facilitar o desenvolvimento de novos tratamentos para queimaduras e revelar os mecanismos fisiopatológicos da cicatrização de queimaduras.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais neste estudo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética da Escola de Estomatologia da China Ocidental, Universidade de Sichuan (WCHSIRB-D-2024-499). Vinte e quatro camundongos C57BL/6 de oito semanas de idade (fêmea, peso corporal 25-30 g) foram usados para o presente estudo. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparando o equipamento e o mouse antes da queimadura

  1. Adquira os animais e aloje-os em gaiolas por 7 dias após a chegada para permitir que eles se aclimatem ao ambiente.
  2. Esterilize a área de trabalho pulverizando e limpando com etanol 70% (v/v). Cubra a mesa de operação com absorventes cirúrgicos estéreis.
  3. Ajuste a temperatura do dispositivo de aquecimento digital para 97 °C. O dispositivo de aquecimento consiste em três partes (Figura 1).
    NOTA: A temperatura de 50-450 °C pode ser ajustada através do controlador de temperatura (Figura 1A). A base do suporte é usada para colocar a ponta (Figura 1B), que pode ser desmontada (Figura 1C) para substituir diferentes tamanhos de instrumentos. Desinfete a ponta com iodóforo ou álcool.
  4. Anestesiar o camundongo com isoflurano a 5% em oxigênio a 100% em uma câmara de indução por 3 min (taxa de fluxo: 4 L/min) até que a respiração diminua. Avalie a profundidade da anestesia usando um teste de pinça do dedo do pé.
    NOTA: A inalação de isoflurano pode causar sonolência e prejudicar o sistema cardiovascular. É essencial usar equipamento de proteção e manuseá-lo dentro de uma hotte em uma área bem ventilada.
  5. Assim que o mouse estiver profundamente anestesiado, transfira-o para uma almofada aquecida em decúbito ventral para manter o calor e evitar a hipotermia durante a recuperação da anestesia. Reduza o isoflurano para 1. 5% de oxigênio para manutenção por meio de um cone nasal.
  6. Aplique gel lubrificante em ambos os olhos do camundongo com um cotonete para evitar o ressecamento da córnea.

2. Induzir lesão por queimadura de espessura total

NOTA: O processo geral de indução e análise de queimaduras é mostrado na Figura 2.

  1. Raspe a pele do mouse com um barbeador elétrico em uma área de aproximadamente 5 cm de comprimento e 4 cm de largura do pescoço à cauda. Trabalhe suavemente para evitar ferir a pele ao fazer a barba (Figura 3C).
  2. Use um aplicador com ponta de algodão para aplicar creme depilatório na área da pele raspada por 3 min (Figura 3D).
    NOTA: Evite aplicar o creme depilatório em outras partes do mouse para evitar queimaduras, que podem ser difíceis de detectar. O creme causou erupções cutâneas se usado por mais de 5 min. A duração exata para a eficácia ideal varia entre os produtos e deve ser determinada pelo operador.
  3. Limpe o creme com gaze úmida até que o creme e o cabelo não sejam detectados. Desinfetar a área cirúrgica com clorexidina esfoliante seguida de etanol a 70% (v/v) três vezes cada. Limpe e seque a área com gaze estéril.
  4. Empregue uma ponta de pipeta esterilizada de 1 mL com um diâmetro de 9 mm (Figura 3A) embebida em tinta esterilizada para identificar com precisão os locais de ferimento desejados. A pele dorsal murina é caracterizada por uma topografia irregular. Definir a área da ferida além da medula espinhal de camundongos é essencial para garantir a repetibilidade.
  5. Cubra a pele com um campo estéril previamente aparado, deixando a área cirúrgica livre (Figura 3). Coloque luvas resistentes ao calor e verifique a temperatura do dispositivo de aquecimento digital. Antes e após a indução da queimadura, higienize a ponta do aparelho com etanol 70% (v/v).
  6. Aplique a ponta do dispositivo de aquecimento no centro dos locais da ferida localizada (97 ° C por 10 s) para criar seis feridas redondas com um diâmetro de 4 mm (Figura 3B). O intervalo entre as queimaduras adjacentes é de 0,5-1 cm. Determine o número de queimaduras de acordo com o projeto experimental.
    NOTA: A queimadura é causada principalmente pela condução de calor; portanto, não é necessário exercer pressão sobre a haste, ou seja, mantê-la em contato com a pele por gravidade durante a indução da queimadura. Houve seis queimaduras para o delineamento experimental. Este é o número máximo de queimaduras que podem ser construídas de acordo com o dispositivo que usamos e a área do dorso do camundongo. Múltiplas réplicas do mesmo grupo experimental podem ser alcançadas com base nisso.

3. Cuidados e medição pós-queimadura

  1. Aplique gelo na ferida queimada por 5 minutos para reduzir a dor potencial para o controle da dor (Figura 3G).
  2. Desligue o isoflurano e remova o cone do nariz após a queimadura. Transfira o mouse para uma almofada de aquecimento até que o mouse se mova normalmente (por exemplo, não agachado ou tremendo).
  3. Coloque cada rato em uma gaiola de recuperação para evitar que eles se arranhem. Amoleça alguns pellets de comida adicionando 5 a 10 gotas de água potável a cada pellet e coloque-os no chão da gaiola para facilitar a alimentação.
    NOTA: Esterilização das gaiolas por pulverização e limpeza com etanol a 70% (vol/vol). A roupa de cama deve ser substituída regularmente para manter os ratos aquecidos e absorver a urina.
  4. Administre buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea em localização caudal duas vezes ao dia por um total de 3 dias, garantindo pelo menos 8 h entre as injeções.
  5. Limpe todas as feridas com gaze estéril umedecida com solução salina após 24 h de indução de queimadura. Seque a pele com gaze e aplique uma pequena quantidade de gel antibacteriano (hidrogel TKH) usando uma seringa para cobrir a queimadura12,14. Repita este procedimento nos dias 3, 7 e 10 seguintes.
  6. Use um curativo respirável e transparente para cobrir as feridas. O tamanho do curativo deve cobrir cerca de 1 cm ao redor da ferida e não deve cobrir a área sem depilação.
    NOTA: Troque o curativo pelo menos uma vez a cada 2 dias. O uso prolongado do curativo sem substituição pode levar à infecção da ferida com formação de pus, resultando em atraso na cicatrização da ferida.
  7. Durante todo o período de acompanhamento, meça o peso a cada 2-3 dias. Geralmente, os camundongos que perdem 15% a 20% de seu peso corporal inicial devem ser sacrificados e removidos do experimento.

4. Coleta de feridas

  1. Aos 0, 3, 7, 10 e 14 dias, marque a ferida com a ponta de uma ponta de pipeta estéril de 1 mL e registre-a com uma câmera digital.
  2. Eutanasiar os camundongos por overdose de anestesia e luxação cervical (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
    NOTA: Tenha cuidado durante a luxação cervical para evitar puxões excessivos, que podem danificar as feridas do dorso.
  3. Com uma tesoura, isole o local da ferida e a pele circundante, incluindo a musculatura subjacente (1 cm x 1 cm). Prepare-se para pelo menos três amostras para cada grupo.
  4. Fixe as amostras de pele em paraformaldeído (PFA) a 4% por 24 h e armazene a 4 ° C. O volume do fixador deve ser 30 vezes o volume do tecido15,16.
    NOTA: O PFA é perigoso. Certifique-se de trabalhar em uma área bem ventilada e use equipamentos de proteção adequados.

5. Avaliação da cicatrização de feridas

  1. Lave o tecido da ferida duas vezes com PBS e espalhe-o com papel de filtro, que deve ser aparado em um tamanho apropriado (Figura 2H). Devido à presença de algum conteúdo mucoso na camada de tecido subcutâneo, ele adere à superfície do papel de filtro sem movimento ou ondulação do tecido.
    1. Coloque o papel de filtro e a amostra em um de tecido para desidratação com parafina para obter amostras de tecido relativamente lisas e, em seguida, incorpore o tecido15,16. Armazenar amostras a 4 °C.
      NOTA: Estique o tecido o máximo possível e evite qualquer dobra, pois essas dobras se tornarão permanentes após a fixação.
  2. Corte as amostras embebidas em parafina em seções de 5 μm de espessura e core as lâminas via H&E e tricrômico de Masson para avaliar a extensão do tecido de granulação, formação de angiogênese e deposição de colágeno, fornecendo evidências para avaliar os diferentes estágios e a progressão da cicatrização da ferida17,18.
  3. Capture imagens de todas as amostras usando um microscópio com objetiva de 40x.
  4. Use um software compatível para analisar a seção da pele manchada, incluindo epiderme, derme, tecido subcutâneo e condição muscular.

Resultados

Neste protocolo, queimaduras semelhantes a tabuleiros de xadrez foram criadas com uma duração de queimadura de 10 s a 97 °C pelo dispositivo de aquecimento digital (Figura 1). A ponta do dispositivo é feita de cobre puro, conhecido por sua excelente condução de calor e capacidade de aquecimento rápido. A empunhadura segurada pelo experimentador é feita de material de policarbonato, que fornece resistência ao calor e não inflamabilidade. Em comparação com os métodos de placa/barra de metal único pré-aquecido ou fervura ou água quente, este dispositivo demonstra desempenho de segurança superior e reduz o tempo de anestesia em camundongos, consequentemente encurtando a duração geral do experimento.

O processo geral de indução e análise de queimaduras é mostrado na Figura 2. Cada animal tinha seis queimaduras no dorso, dispostas conforme ilustrado na Figura 2E. O tamanho da ferida nesses animais foi avaliado e amostras de pele foram colhidas para análise histológica, incluindo coloração de H&E e tricrômico de Masson nos dias 1, 3, 7, 10 e 14 pós-queimadura, respectivamente.

Cada ferida de queimadura era de forma circular com área igual e profundidade uniforme após a indução da queimadura. A cor da borda da queimadura mudou de branco ceroso para vermelho, acompanhada por uma zona hiperêmica devido à resposta inflamatória imediata à lesão. Além disso, o tamanho da ferida queimada aumentou ligeiramente ao longo das 72 h após a queimadura (Figura 4A).

A análise microscópica dos cortes corados com tricrômico de H&E e Masson das feridas (Figura 4B) revelou destruição completa da camada epidérmica e danos em toda a espessura da derme, afetando tanto a gordura subcutânea quanto o músculo. O exame histológico indicou que o processo de cicatrização da ferida estava no estágio inflamatório no dia 3, caracterizado por vasodilatação e infiltração substancial de células inflamatórias. Uma redução notável na área da ferida foi observada no dia 7 pós-queimadura em comparação com o dia 3, como visto nas imagens microscópicas das amostras. O tecido de granulação e cardiovascular se formam, e as fibras de colágeno são depositadas densamente no dia 14, o que significa que a cicatrização de feridas entra no estágio de remodelação. As feridas se recuperaram sem infecção óbvia durante todo o processo de cicatrização.

Além disso, as habilidades de cicatrização de feridas foram avaliadas quantificando os dados de cicatrização de feridas e analisando os traçados de feridas (Figura 5). Observou-se que a recuperação da ferida foi aprimorada em feridas tratadas com hidrogel de peptídeo TKH12,14, evidenciada por áreas de feridas significativamente menores nos dias 7, 10 e 14.

O intervalo entre as feridas adjacentes (Figura 6), transversal ou longitudinal, confirmou que não houve diferença em relação à pele não queimada. A epiderme, derme e tecidos subcutâneos estavam íntegros, e não havia infiltração de linfócitos e nem vasodilatação. O processo de cicatrização das duas feridas não interfere um no outro. Portanto, diferentes medicamentos ou curativos podem ser aplicados ao tratamento de feridas com base no modelo para avaliar o efeito in vivo.

figure-results-1
Figura 1: Dispositivo de aquecimento digital para indução de queimadura. O dispositivo de aquecimento digital usado para induzir queimaduras. (a) O controlador de temperatura permite configurações de temperatura que variam de 50 a 450 °C. (b) A base do suporte é usada para segurar a ponta de queima. (c) A ponta do dispositivo pode ser alterada para diferentes tamanhos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Esquema do modelo de enrolamento semelhante a um tabuleiro de xadrez. Um esboço passo a passo para reproduzir o modelo de ferida semelhante a um tabuleiro de xadrez descrito no artigo. (A) Um camundongo de 8 semanas é usado como modelo para experimentos de cicatrização de feridas. (B) O cabelo é removido da área de ferimento designada. (C) Os seis locais de ferimento são marcados com uma ponta de pipeta de 1 mL. (D) Um dispositivo de aquecimento digital é usado para criar seis queimaduras no centro de cada local marcado (E). (F) Uma imagem em close-up do dorso após a indução da queimadura. (G) Amostras de pele (cerca de 1 cm × 1 cm) são colhidas nos dias 3, 7, 10 e 14. (H) As amostras de pele são achatadas usando papel de filt e transferidas para de incorporação. (I) A desidratação com parafina é realizada e (J) as amostras são seccionadas com 5 μm de espessura. (K) Os cortes são corados com hematoxilina e eosina (H&E) e tricrômico de Masson. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Processo de indução de queimaduras de espessura total. (A) O diâmetro de uma ponta de pipeta de 1 mL e (B) a ponta do dispositivo de aquecimento digital são de 9 mm e 4 mm, respectivamente. (C) A área dorsal do mouse é raspada com um barbeador elétrico. (D) O creme depilatório é aplicado por 3 min. (E) A área depilada é limpa e seca, e os pontos de ferida são marcados com uma ponta de pipeta esterilizada de 1 mL. (F) O dispositivo de aquecimento digital é aplicado a 97 ° C por 10 s para criar seis queimaduras. (G) O gelo é aplicado nas feridas de queimadura para o controle da dor. (H) Toda a parte de trás do camundongo mostra as seis queimaduras de espessura total. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Imagens representativas de queimaduras e análise histológica. (A) Imagens de queimaduras nos dias 3, 7, 10 e 14, mostrando a progressão da cicatrização. (B) Imagens histológicas coradas com H&E e tricrômico de Masson demonstram cicatrização de feridas e regeneração da pele. Barras de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: Variação do tamanho da ferida ao longo do tempo. (A) A variação no tamanho da ferida em animais controle e tratados com hidrogel TKH ao longo do tempo, analisada usando o software ImageJ. (B) Os dados correspondentes de rastreamento de feridas são apresentados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 6: Queimaduras adjacentes e análise histológica. (A) Imagens representativas de queimaduras adjacentes no dia 1. (B) Amostras de feridas adjacentes colhidas para análise histológica no dia 3 (circuladas em vermelho). (C) O papel de filtro é usado para achatar as amostras de tecido antes da desidratação da parafina. (D) Análise tricrômica de H&E e Masson de feridas adjacentes. Barras de escala: 1 mm e 200 μm (ampliadas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Para estudos de queimaduras, os modelos in vitro geralmente se concentram nos efeitos inibitórios de agentes antimicrobianos locais ou antibióticos em bactérias associadas a queimaduras, como Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa19, bem como no impacto de vários biomateriais (como elastina, seda e curativos de hidrogel14,20) em células inflamatórias pós-queimadura (como neutrófilos, macrófagos) ou células-tronco (como células-tronco mesenquimais). Esses experimentos geralmente são conduzidos em ambientes controlados artificialmente, e as células cultivadas in vitro podem exibir características de crescimento e comportamentos diferentes daqueles in vivo, que podem falhar em replicar totalmente os processos fisiológicos de cicatrização de queimaduras, como interações célula a célula e a influência da matriz extracelular. Por essas razões, modelos animais de queimaduras são essenciais para elucidar os mecanismos patológicos pós-queimadura e avaliar novas abordagens terapêuticas. O processo de cicatrização de feridas em camundongos e humanos passa por quatro estágios sobrepostos, mas distintos: inflamação, proliferação, reepitelização e remodelação21,22. Existem várias vantagens biológicas em usar camundongos como sujeitos experimentais, incluindo a disponibilidade de vários reagentes específicos para camundongos e a viabilidade de criar modelos transgênicos para investigar as vias de sinalização molecular envolvidas no processo de recuperação. Isso torna os camundongos um dos modelos animais mais comumente utilizados para pesquisas sobre queimaduras e cicatrização de feridas.

O presente estudo estabeleceu um modelo de ferida tipo tabuleiro de xadrez de queimadura de espessura total e avaliou a eficácia de um curativo de hidrogel usando esse modelo. Os resultados indicam que este modelo pode monitorar efetivamente o desempenho clínico de curativos experimentais. Dentro de cada animal, seis queimaduras foram distribuídas simetricamente ao longo da coluna vertebral. Feridas de queimadura podem ser criadas em locais semelhantes, mas em ratos diferentes. Devido à limitada área cutânea do dorso e ao número de feridas, a análise histológica mostrou que as feridas não interagiam entre si, garantindo a avaliação independente de cada curativo experimental em diferentes locais no mesmo dorso do camundongo, minimizando o viés relacionado ao processo de cicatrização da ferida. Além disso, este modelo também se beneficia de garantir que cada camundongo sirva como seu próprio controle, possibilitando comparar tratamentos experimentais e de controle no dorso de um mesmo camundongo, levando a uma redução significativa no número de animais e no custo experimental. Devido aos impactos variáveis de diferentes medicamentos na saúde geral dos camundongos, se vários medicamentos forem aplicados na pele do mesmo camundongo para o tratamento de diferentes feridas e subsequente comparação, pode ser necessário observar e verificar se a aplicação de um único medicamento ou a aplicação combinada de diferentes medicamentos afetará a saúde geral do camundongo. Além disso, deve-se prestar atenção à estabilidade ou adesão de diferentes medicamentos na superfície da pele para evitar a contaminação cruzada de medicamentos ou infecção da ferida devido ao coçar do camundongo durante o processo de cicatrização.

A coleta de amostras de pele é crucial para a análise histológica subsequente. A borda do tecido encolherá e dobrará no fixador sem nenhum tratamento16. Após a desidratação e secção da parafina, ela também será curvada ou mesmo parcialmente sobreposta na lâmina, resultando em imagens inestéticas ao microscópio e potencialmente afetando outras análises histológicas, como a análise estatística do comprimento ou espessura da ferida. Portanto, o uso de papel de filtro para achatar o tecido pode obter uma seção mais lisa na lâmina, o que torna a imagem histológica limpa e facilita a análise estatística posterior. Também tentamos usar clipes de papel para fixar a amostra antes da desidratação, o que ajudou a garantir a suavidade do tecido. No entanto, a aplicação de clipes de papel pode exercer pressão sobre o tecido grampeado, levando à compressão e deformação do tecido. Portanto, ao usar este método, a parte da ferida queimada não pode ser pinçada para evitar afetar a observação.

Inúmeros fatores podem influenciar o processo de cicatrização, incluindo dor, coceira e infecção bacteriana23. O manejo eficaz da dor por queimadura é crucial para a recuperação e reintegração de pacientes com queimaduras. O controle inadequado da dor pode impedir o processo de cicatrização, levando a desafios físicos e psicológicos duradouros, bem como a internações hospitalaresprolongadas 24. Geralmente, a dor afeta o comportamento alimentar em camundongos. Portanto, cada ferida foi imediatamente tratada com gelo após a queimadura e injetada buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea duas vezes ao dia por 3 dias para controle da dor. Além disso, os pellets de comida foram amolecidos e colocados no chão da gaiola para facilitar a alimentação. Em instalações de habitação comunitária, os ratos podem coçar e lamber as feridas uns dos outros, potencialmente atrasando a cicatrização de feridas ou causando infecções. Portanto, o alojamento individual de camundongos torna-se necessário como medida preventiva. O uso de curativos respiráveis para cobrir o dorso após a indução da queimadura pode evitar que os camundongos cocem a ferida e reduzir o risco de infecção25. No entanto, é essencial selecionar os curativos criteriosamente e cortá-los no tamanho adequado para permitir o movimento normal dos ratos. Os curativos devem ser substituídos imediatamente se caírem, com a recomendação de trocá-los pelo menos uma vez a cada dois dias. O uso prolongado de curativos pode levar à absorção inadequada dos exsudatos da ferida.

Embora o modelo de camundongo tenha suas vantagens específicas, ele ainda não pode simular totalmente o processo de cicatrização de feridas em humanos. Os humanos se curam principalmente por meio de reepitelização e granulação. Em contraste, a pele do camundongo apresenta um panículo carnoso único, uma fina camada de músculo esquelético que está presente apenas no platisma do pescoço em humanos7, de modo que a cicatrização de feridas ocorre principalmente por meio da contração da ferida. Além disso, a pele do camundongo pode possuir um pool enriquecido de células progenitoras, o que facilita a rápida cicatrização e queratinização da pele26,27. Esses fatores contribuem coletivamente para reduzir substancialmente o tempo de cicatrização. Em modelos animais, os anéis anti-contração de feridas têm sido utilizados para mitigar o impacto da contração da ferida no processo de cicatrização e imitar a cicatrização fisiológica de feridas semelhante à humana que cicatriza com tecido de granulação e reepitelização 12,17,28.

O estabelecimento bem-sucedido do modelo de lesão por queimadura em camundongos fornece uma ferramenta valiosa para estudar a fisiopatologia das lesões térmicas e avaliar possíveis intervenções terapêuticas. As alterações histológicas observadas no tecido cutâneo queimado alinham-se com as características da lesão térmica, destacando a confiabilidade e validade do modelo em recapitular as manifestações clínicas das queimaduras.

No geral, o modelo de lesão por queimadura em camundongo oferece uma plataforma robusta para investigar os mecanismos moleculares subjacentes ao dano tecidual induzido por queimaduras, inflamação e processos de cicatrização de feridas. Estudos futuros utilizando esse modelo podem contribuir para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas destinadas a melhorar os resultados para pacientes queimados e reduzir a carga de morbidade e mortalidade relacionadas a queimaduras.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (23ZYZYTS0120), pelo Hospital de Estomatologia da China Ocidental de Sichuan (RD-03-202011) e pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2022NSFSC0614). As figuras foram criadas com BioRender. com.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ponta de pipeta de 1 mLKIRGEN,USAKG1333Usado para localizar locais de queimaduras
3 M Filme Tegaderm3M,USA1624WCN 6 cm x 7 cmPara a cobertura da ferida após indução de queimadura
4% paraformaldeído (PFA)Biosharp,ChinaBL539AUsado para fixar as amostras de pele
BuprenorfinaSigma-Aldrich,EUAPHR8955-50MGPara o controle da dor dos camundongos
C57BL/6 camundongosChengdu Dashuo empresa animal experimental, ChinanenhumPara o estabelecimento do modelo de queimadura
Creme depilatórioVeet, China—Para a depilação do dorso dos camundongos
Dispositivo de aquecimento digitalShenzhen Kapper Technology Company, ChinaNo.936DPara a indução de queimaduras dos ratos
Barbeador elétricoAUX, ChinaAUX-A5Para a depilação do dorso dos ratos
Papel de filtro——Usado para desdobrar as amostras de pele
Software GraphPad—GraphPad prism 9.5.0Para a análise da área da ferida queimada
Luvas resistentes ao calor——Usado para segurar a ponta do dispositivo de aquecimento digital
Kit de coloração de hematoxilina e eosinaSolarbio, ChinaG1120Para a análise histológica das lâminas
Software ImageJ—ImageJ 1.54fPara a análise da área da ferida queimada
IsofluranoRWD,ChinaR510-22-10Para a anestesia dos
camundongos Kit de Coloração Tricrômica de MassonSolarbio,ChinaG1340Para a análise histológica das lâminas
MicroscópioOlympus,Japão VS200 ASWUsado para escanear o H& E e Masson corado slides:
de tecidoCITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD, China31050102WPara desidratação de parafina de tecido e incorporação de parafina

Referências

  1. Mofazzal Jahromi, M. A., et al. Nanomedicine and advanced technologies for burns: Preventing infection and facilitating wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 123, 33-64 (2018).
  2. Burgess, M., Valdera, F., Varon, D., Kankuri, E., Nuutila, K. The immune and regenerative response to burn injury. Cells. 11 (19), 3073(2022).
  3. Arbuthnot, M. K., Garcia, A. V. Early resuscitation and management of severe pediatric burns. Sem Pediatr Surg. 28 (1), 73-78 (2019).
  4. Smolle, C., et al. Recent trends in burn epidemiology worldwide: A systematic review. Burns. 43 (2), 249-257 (2017).
  5. Jeschke, M. G., et al. Burn injury. Nat Rev Dis Primers. 6, 11(2020).
  6. Nomellini, V., Gomez, C. R., Gamelli, R. L., Kovacs, E. J. Aging and animal models of systemic insult: Trauma, burn, and sepsis. Shock. 31 (1), 11-20 (2009).
  7. Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J Biomed Biotechnol. 2011, 969618(2011).
  8. Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M. G. Animal models in burn research. Cell Mol Life Sci. 71 (17), 3241-3255 (2014).
  9. Katakura, T., Yoshida, T., Kobayashi, M., Herndon, D. N., Suzuki, F. Immunological control of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infection in an immunodeficient murine model of thermal injuries. Clin Exp Immunol. 142 (3), 419-425 (2005).
  10. Dai, T., et al. Animal models of external traumatic wound infections. Virulence. 2 (4), 296-315 (2011).
  11. Tavares Pereira, D. D. S., Lima-Ribeiro, M. H. M., De Pontes-Filho, N. T., Carneiro-Leão, A. M. D. A., Correia, M. T. D. S. Development of animal model for studying deep second-degree thermal burns. J Biomed Biotechnol. 2012, 460841(2012).
  12. Gong, Y., et al. Exudate absorbing and antimicrobial hydrogel integrated with multifunctional curcumin-loaded magnesium polyphenol network for facilitating burn wound healing. ACS Nano. 17 (22), 22355-22370 (2023).
  13. Dahiya, P. Burns as a model of sirs. Front Biosci. 14 (13), 4962-4967 (2009).
  14. Yergoz, F., et al. Heparin mimetic peptide nanofiber gel promotes regeneration of full-thickness burn injury. Biomaterials. 134, 117-127 (2017).
  15. Rao, G., et al. Rat burn model to study full-thickness cutaneous thermal burn and infection. J Vis Exp. (186), e64345(2022).
  16. Yampolsky, M., Bachelet, I., Fuchs, Y. Reproducible strategy for excisional skin-wound-healing studies in mice. Nat Protoc. 19 (1), 184-206 (2024).
  17. Wang, C., et al. Engineering bioactive self-healing antibacterial exosomes hydrogel for promoting chronic diabetic wound healing and complete skin regeneration. Theranostics. 9 (1), 65-76 (2019).
  18. Papp, A., et al. The progression of burn depth in experimental burns: A histological and methodological study. Burns. 30 (7), 684-690 (2004).
  19. Barrett, J. P., et al. An in vitro study into the antimicrobial and cytotoxic effect of Acticoat dressings supplemented with chlorhexidine. Burns. 48 (4), 941-951 (2022).
  20. Lou, P., et al. Injectable self-assembling peptide nanofiber hydrogel as a bioactive 3D platform to promote chronic wound tissue regeneration. Acta Biomater. 135, 100-112 (2021).
  21. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  22. Bielefeld, K. A., Amini-Nik, S., Alman, B. A. Cutaneous wound healing: Recruiting developmental pathways for regeneration. Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2059-2081 (2013).
  23. Yildiz, S. C., Demir, C., Ayhanci, A. Examination of the effects of kefir on healing factors in a mice burn model infected with E. coli, S. aureus and P. aeruginosa using qRT-PCR. Burns. 49 (2), 425-431 (2023).
  24. Wang, Y., et al. Burn injury: Challenges and advances in burn wound healing, infection, pain and scarring. Adv Drug Deliv Rev. 123, 3-17 (2018).
  25. Chen, Y., et al. Research advances in smart responsive-hydrogel dressings with potential clinical diabetic wound healing properties. Mil Med Res. 10 (1), 37(2023).
  26. Ito, M., et al. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nat Med. 11 (12), 1351-1354 (2005).
  27. Ito, M., et al. Wnt-dependent de novo hair follicle regeneration in adult mouse skin after wounding. Nature. 447 (7142), 316-320 (2007).
  28. Chen, K., et al. Pullulan-collagen hydrogel wound dressing promotes dermal remodeling and wound healing compared to commercially available collagen dressings. Wound Repair Regen. 30 (3), 397-408 (2022).

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Modelo de Queimadura em CamundongoQueimaduras de Espessura TotalAn lise da rea da FeridaAn lise Histol gicaInfiltra o Inflamat riaTecido de Granula oReepiteliza oHidrogel Pept dico

Artigos relacionados