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Nocaute Eficiente de Genes no Fígado por Injeção Intraesplênica de RNA Pequeno em Grampo de Cabelo Entregue pelo Vírus Adeno-Associado Sorótipo 8 (AAV8)

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DOI:

10.3791/67376

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1 de novembro de 2024

 , 
1Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Translational Medical Sciences, College of Medicine, Texas A&M University Health Science Center

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve como a injeção intraesplênica de RNA em grampo de cabelo pequeno entregue por AAV8 atinge a mesma eficiência de knockdown de genes no fígado que a injeção na veia porta, representando um procedimento mais simples com mortalidade e complicações perioperatórias e pós-operatórias muito menores.

Resumo

O fígado é um órgão importante que desempenha funções metabólicas essenciais. O desenvolvimento de um método eficiente e seguro para reduzir a expressão gênica no fígado fornece uma ferramenta importante para determinar a função gênica na fisiopatologia hepática. Neste estudo, descrevemos um método para injeção intraesplênica de vírus adeno-associado sorotipo 8 (AAV8) projetado para expressar um pequeno RNA em grampo (shRNA) contra um gene alvo de interesse, nucleostemina (NS). A injeção intraesplênica de AAV8 expressando um shRNA direcionado a NS (AAV8-shNS1) alcançou a mesma eficiência de knockdown de NS no fígado que a injeção na veia porta, em comparação com a injeção de AAV8 expressando uma sequência embaralhada shRNA (AAV8-shScr). Além disso, a injeção do vírus AAV8-shRNA desencadeou reações inflamatórias mínimas no parênquima hepático. Mais importante ainda, este protocolo de injeção intraesplênica não foi tecnicamente exigente e causou sangramento mínimo no local da injeção, que é a principal causa de mortalidade perioperatória e pós-operatória ao realizar a injeção da veia porta. Este estudo relata um método aprimorado e relativamente seguro para obter um knockdown genético eficiente no fígado.

Introdução

O fígado é um órgão vital que metaboliza nutrientes e produtos químicos, mas também está sob constante exposição a insultos citotóxicos e cancerígenos. Embora o fígado adulto seja capaz de crescer novamente após uma lesão, seu poder regenerativo é severamente prejudicado por1 ano de idade. Até o momento, a única opção terapêutica para pacientes com doenças hepáticas crônicas em estágio terminal ou dano hepático agudo maciço é o transplante hepático, que apresenta muitos desafios por si só2. Para entender melhor a fisiopatologia molecular do fígado, interrogando as funções dos genes de interesse, manipulações genéticas foram desenvolvidas para aplicação in vivo , incluindo knockdown mediado por RNAi e deleção direcionada por uma Cre recombinase na presença de locais loxP3. O de expressão Cre e a construção shRNA podem ser entregues por veículos virais.

O sorotipo 8 do vírus adeno-associado (AAV8) é um vetor robusto para entrega de genes a tipos seletivos de tecidos (por exemplo, fígado, músculo esquelético, coração, cérebro e pâncreas) com alta eficiência e baixa resposta inflamatória 4,5. Para atingir os órgãos internos do corpo, o AAV8 é comumente introduzido por injeção na veia da cauda, na qual as partículas virais viajam primeiro pelo pulmão antes de atingir a circulação sistêmica. Em contraste, a injeção da veia porta permite que eles cheguem ao fígado antes de circular pelo pulmão, uma fonte potencial de sequestro e diluição. No entanto, a injeção da veia porta é tecnicamente desafiadora e muitas vezes complicada pelo sangramento induzido pela operação e uma alta taxa de mortalidade. Para obter um knockdown genético eficiente (KD) no fígado, evitando o problema de alta mortalidade peri / pós-operatória, testamos um método de injeção intraesplênica de AAV8 carregando um shRNA projetado visando nucleostinada (NS) (AAV8-shNS1) e comparamos sua eficiência KD com a de AAV8-shNS1 injetado na veia porta.

A NS é uma proteína enriquecida com células-tronco / progenitoras descoberta primeiro em células-tronco neurais e depois em vários outros tipos de células-tronco e cânceres 6,7. A importância biológica da NS é demonstrada pelo fenótipo letal embrionário precoce de camundongos germinativos nocaute para NS (NSKO) in vivo 3,8 e pela perturbação da auto-renovação induzida por NSKD in vitro 9,10. Em animais adultos, altos níveis de expressão de NS são encontrados no testículo e em vários tecidos em regeneração, incluindo as células epiteliais pigmentadas por tritões desdiferenciáveis após lentectomia e células musculares após amputação de membros11, bem como tecidos de mamíferos em regeneração, como cardiomiócitos de camundongos após lesão cardíaca12 e hepatócitos após lesão hepática (por exemplo, CCl4) ou ressecção cirúrgica (por exemplo, hepatectomia parcial)13,14. Além disso, a SN demonstrou desempenhar papéis importantes no desenvolvimento de tumores mamários, hepáticos e orais 15,16,17. Mecanicamente, a NS demonstrou promover a auto-renovação, protegendo o genoma replicante de danos ao DNA18,19. No entanto, devido ao fenótipo letal embrionário precoce da linha germinativa NSKO, é necessário um método experimental para introduzir temporariamente a NSKD após a conclusão do desenvolvimento do tecido para determinar melhor suas atividades biológicas em órgãos adultos.

Neste artigo, usamos o NS como um caso em questão para ilustrar o estabelecimento e teste de um método de DK do gene hepático in vivo que é eficiente e tem uma baixa mortalidade induzida por procedimento.

Protocolo

Todos os experimentos com animais concluídos neste estudo foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Centro de Ciências da Saúde da Universidade Texas A&M em Houston (número de aprovação: 2021-0264-IBT) e realizados de acordo e em conformidade com todas as diretrizes regulatórias e institucionais relevantes. Foram utilizados camundongos C57BL/6J fêmeas (4-5 meses de idade, peso corporal 23-30 g). Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. AAV8- design e produção de shRNA

NOTA: Consulte Sands et al.4 para obter detalhes do procedimento.

  1. Oligonucleotídeos shRNA de design sense e anti-sense que visam uma sequência longa de 21 nucleotídeos dentro da região codificadora do gene de interesse. Neste caso, foram utilizados NS de camundongo (shNS1) e uma sequência embaralhada de 21 nucleotídeos como controle negativo (shScr) (Figura 1A, painel inferior).
  2. Inclua na estrutura do gancho uma sequência de alça de haste de TTCAAGAGA, uma extremidade romba de 5 ', uma extremidade coesiva compatível com XhoI de 3 'e uma sequência de sentido direcionado específica do gene de 5'-GAA CTA AAA CAG CAG AAA-3 '(shNS1) ou uma sequência embaralhada de 5'-TCT CGC TTG GGC GAG AGT AAG-3 '(shScr).
  3. Fosforilar e recozer cada par de oligonucleotídeos.
  4. Digerir o vetor de transferência do gene AAV, AV5-siRNA-GFP (Figura 1A, painel superior), com HpaI e XhoI, desfosforilar e purificar o gel do fragmento do vetor.
  5. Ligue oligonucleotídeos recozidos no vetor purificado por gel.
  6. Transforme produtos de DNA ligados em bactérias DH5α competentes com eficiência de subclonagem.
  7. Escolha clones únicos por resistência à ampicilina e cultive 100 mL de cultura bacteriana para minipreparação de plasmídeo. Confirme a clonagem correta por sequenciamento e prepare plasmídeos usando o kit livre de endotoxinas disponível comercialmente (seguindo as instruções do fabricante).
  8. Embale os vírus AAV8 transfectando o vetor de transferência AV5, o sorotipo 8 Rep/Cap e os plasmídeos auxiliares AdF6 em células 293T usando o reagente de transfecção iMFectin. Um total de 40 × placas de 15 cm foram transfectadas e colhidas/digeridas aos 3 dias pós-transfecção.
  9. Recupere AAV8 associado a células por lise celular e precipite AAV8 secretado por meio com 40% de PEG. Após a digestão, combinar os vírus AAV8 no lisado celular e no meio, purificar num gradiente descontínuo de iodixanol e concentrar em unidades de centrifugação de corte de peso molecular (1,00,000 MW).
  10. Quantifique os títulos de AAV8 por qPCR de endpoint absoluto com primers: WPRE-172 (5'- TTTATGAGGAGTTGTGGCCC-3') e WPRE-392 (5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3').

2. Injeção intraesplênica de AAV8 (Figura 1B, 1C) 

  1. Coloque os camundongos C57BL6/J em uma câmara de anestesia cheia de isoflurano a 2% e oxigênio (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Após a perda de consciência, transfira os camundongos para a área cirúrgica asséptica em decúbito lateral direito. Mantenha a anestesia com isoflurano a 2% com oxigênio fornecido por meio de um cone nasal.
  2. Esterilize o local da incisão com clorexidina a 2% seguida de etanol a 80%. Use uma tesoura médica de 6,3 polegadas para fazer uma incisão de 15 mm na parede abdominal superior esquerda, seguida por uma incisão de 10 mm no peritônio.
  3. Exponha suavemente o baço usando uma pinça e segure-o no lugar com uma gaze úmida colocada embaixo do órgão.
  4. Misture e injete suavemente os vírus AAV8 (50 μL) durante um período de 30 s no baço usando uma agulha de 30 G com a ponta colocada a uma profundidade de 3 mm abaixo da superfície (Figura 1B). Cubra o local da injeção com um pedaço de cotonete e comprima por 1 min.
  5. Suturar o peritônio com uma sutura de intestino crômico absorvível 4-0.
  6. Feche a parede abdominal e a pele com uma sutura de seda 4-0.
  7. Coloque os ratos em uma gaiola limpa em cima de uma almofada térmica elétrica e monitore-os até a recuperação.

3. Injeção de AAV8 na veia porta

  1. Anestesiar camundongos C57BL6/J por inalação de isoflurano (2%) misturado com oxigênio (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
  2. Realize a laparotomia 4,13 através de uma incisão na linha média (~ 1 polegada) na pele e depois no peritônio.
  3. Coloque uma gaze estéril embebida em solução salina estéril no lado esquerdo do mouse e use um cotonete estéril para retirar suavemente o intestino grosso e delgado. Coloque o intestino em cima de uma gaze molhada e cubra-a com uma almofada para evitar entrar em contato com a pele ou secar.
  4. Injete o vírus AAV na veia porta com uma agulha estéril de 32 G em um volume de 50 μL. Insira a agulha 3-5 mm na veia da porta em um ângulo inferior a 5 graus. Deixe o sangue fluir pela agulha por 5 s para evitar o refluxo.
  5. Coloque uma ponta de cotonete estéril em cima do local da injeção com uma leve pressão até o fechamento total da veia e sem sangramento (cerca de 5 min) para evitar sangramento.
  6. Coloque suavemente os órgãos internos de volta na cavidade abdominal.
  7. Feche a parede abdominal e a pele com sutura de seda 4-0.

4. Análise qRT-PCR

  1. Extrair ARNs de 50-100 mg de tecido hepático 4,13 utilizando um reagente de isolamento de ARN disponível no mercado, seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
  2. Sintetize cDNAs de fita1ª a partir de RNAs totais com hexâmeros aleatórios e transcriptase reversa M-MLV20,21.
  3. Determine os valores de ΔC(t) entre o gene alvo e os genes de referência usando o sistema de detecção de PCR em tempo real de cor única e o reagente verde SYBR supermix seguindo relatórios publicados anteriormente22,23.
  4. Medir os valores de ΔΔC(t) a partir de quatro réplicas biológicas e três repetições técnicas (n = 12). DefinirT m a 60 °C para todas as reacções. Confirme os resultados usando dois genes de referência, Rps3 e Rplp0.
  5. Projete sequências de primers da seguinte forma: Ns, 5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3' e 5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3'; Rps3, 5'-atg gcg gtg cag att tcc aa-3' e 5'-cat tct gtg tcc tgg tgg c-3'; Rplp0, 5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3' e 5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'.

Resultados

Eficiências do gene KD no fígado por via intraesplênica vs. injeção de AAV8-shRNA na veia porta
Os estoques virais AAV8 foram diluídos para uma concentração de trabalho de 2E + 12 cópias do genoma (gc) por mililitro (gc / mL). Camundongos individuais foram injetados com 1E + 11 gc de AAV8-shNS1 ou AAV8-shScr (50 μL) por meio de injeção intraesplênica ou na veia porta. Duas semanas após a injeção, os tecidos hepáticos foram coletados para isolamento de RNA, síntese de cDNA de fita1 st e análise de qPCR. Os resultados mostraram que o método de injeção intraesplênica alcançou estatisticamente a mesma eficiência da NSKD (20,8% ± 4,4%) que o método de injeção na veia porta (16,3% ± 3,6%) usando Rsp3 e Rplp0 como referência interna (Figura 2). Mais notavelmente, o procedimento de injeção intraesplênica pode ser concluído em 15 minutos com quase nenhuma morte causada pelo procedimento, enquanto o método de injeção da veia porta normalmente requer 25-30 minutos com muita prática e foi associado a uma taxa de mortalidade mais alta (~ 25% -30% taxa de mortalidade).

Resposta inflamatória tecidual
Os tecidos hepáticos foram coletados de camundongos que receberam injeção na veia porta ou injeção intraesplênica de AAV8-shScr (Figura 3A) ou AAV8-shNS1 (Figura 3B) e comparados com os de camundongos controle (Figura 3C). As reações inflamatórias foram examinadas pela coloração H&E4. Os resultados mostraram que nem AAV8-shScr nem AAV8-shNS1 provocaram reações inflamatórias notáveis no parênquima hepático em comparação com PBS injetado pelo método de injeção intraesplênica (Spl) ou injeção na veia porta (PV) (Figura 3A-C).

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Figura 1: Ilustrações do projeto AAV8-shRNA e do procedimento de injeção intraesplênica. (A) (Topo) Diagrama do plasmídeo AV5-siRNA-GFP projetado para fazer o sorotipo 8 do vírus adeno-associado (AAV8) para experimentos de knockdown in vivo . AV5-siRNA-GFP contém uma sequência shRNA orientada por promotor de CMV e EGFP. (Abaixo) Pequenas construções de RNAi em grampo projetadas para direcionar sequências de 21 nucleotídeos em NS de camundongo (shNS1) ou uma sequência de 21 nucleotídeos embaralhada (Scr). (B) Um diagrama esquemático de fluxo de trabalho no procedimento de injeção intraesplênica de AAV8. (C) Visões passo a passo do procedimento cirúrgico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Eficiências do knockdown de nucleostemina (NS) mediado por AAV8-shRNA no fígado por meio de injeção intraesplênica vs. veia porta. Ensaios qRT-PCR da expressão de NS em amostras de fígado colhidas de camundongos 2 semanas após receber injeção intraesplênica (Spl) ou veia porta (PV) de AAV8-shScr ou AAV8-shNS1 (1E+11 gc). Os gráficos mostram resultados em referência a dois controles internos, Rps3 (A) e Rplp0 (B). As barras mostram ± média de SEM de quatro réplicas biológicas, cada uma com três repetições técnicas de PCR; *p < 0,01; **p < 0,001; p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Histologia dos tecidos hepáticos após injeção intraesplênica ou injeção na veia porta de PBS, AAV8-shScr ou AAV8-shNS1. Coloração H & E dos tecidos hepáticos 2 semanas após a injeção intraesplênica (Spl) ou injeção na veia porta (PV) de AAV8-shScr (A) ou AAV8-shNS1 (B), em comparação com a de amostras de controle não injetadas com AAV8 (C). Barras de escala: 100 μm. Os painéis direitos mostram vistas ampliadas das inserções nos painéis esquerdos. Barras de escala: 50 μm. Seis a nove seções de dois animais diferentes foram examinadas em cada grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O gene KD por entrega viral de uma construção que expressa shRNA em um fundo de tipo selvagem24,25 ou construção de expressão de Cre recombinase em um fundo floxed26 é uma maneira poderosa de interrogar a função do gene in vivo de maneira induzível e controlada pelo tempo. Um método de entrega ideal para estudos in vivo do gene KO/KD deve alcançar uma alta eficiência de KO/KD no órgão de interesse e, além disso, o procedimento em si deve ser tecnicamente fácil com mortalidade peri/pós-operatória mínima.

Para órgãos internos como o fígado, as partículas virais podem ser introduzidas por injeção através da veia da cauda27 ou veia porta28,29 ou por injeção direta no baço (injeção intraesplênica) 30 , 31 . As injeções na veia porta e intraesplênicas introduzem partículas virais na circulação portal, que drenam para o fígado antes de entrar na veia cava inferior e, posteriormente, na circulação pulmonar. Em contraste, as partículas virais introduzidas por injeção na veia da cauda contornam a circulação portal e entram na circulação pulmonar antes de atingir a circulação sistêmica. Para órgãos que recebem circulação portal, como o fígado, as injeções na veia porta e intraesplênicas oferecem a vantagem de entregar partículas virais diretamente a esses órgãos sem o risco de serem sequestradas pelo pulmão ou diluídas na circulação sistêmica. Para órgãos que não recebem circulação portal, como o cérebro, a injeção na veia da cauda pode ser mais benéfica para não submeter partículas virais ao fígado antes de atingir a circulação pulmonar e, posteriormente, a circulação sistêmica.

Neste estudo, injetamos AAV8-shNS1 na dosagem de 1E + 11 gc por animal, o que deu uma melhor eficiência de KD em comparação com 1E + 10 gc, mas alcançou o mesmo efeito KD que 5E + 11 gc via injeção intraportal (dados não mostrados). Na dosagem de 1E+11 gc, comparando o método de injeção na veia porta e o método de injeção intraesplênica, não foi encontrada diferença estatística entre esses métodos em sua eficiência de NSKD no fígado, atingindo 70%-80% de eficiência de KD. O efeito do gene KD do AAV8 injetado na veia porta no fígado pode durar até seis semanas de maneira dependente do construto23. Notavelmente, as complicações relacionadas ao procedimento, como sangramento induzido pela operação e adesão omento/peritônio, bem como a dificuldade técnica, são significativamente menores e menores para o método de injeção intraesplênica em comparação com o método de injeção da veia porta. Como resultado, a injeção da veia porta é realizada uma única vez, enquanto a injeção intraesplênica pode ser realizada repetidamente32. Por fim, as respostas inflamatórias foram pouco ou nenhuma no parênquima dos fígados que receberam injeção na veia porta ou injeção intraesplênica de AAV8-shScr ou AAV8-NS1. A última descoberta, no entanto, não exclui a possibilidade de que títulos extremamente altos de AAV ainda possam desencadear respostas inflamatórias que confundem os achados experimentais. Portanto, a dosagem ideal de AAV precisa ser determinada empiricamente e equilibrada entre a eficiência da DK e a reação induzida por AAV8 e pode variar entre diferentes genes e/ou sequências alvo. Em conclusão, esses resultados demonstram que a injeção intraesplênica de AAV8-shRNA é um método altamente eficiente, relativamente seguro e simples para alcançar o gene KD in vivo no fígado.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio de Pesquisa de Investigador Individual (RP200081) do Instituto de Pesquisa de Prevenção do Câncer do Texas (CPRIT) para RYT.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Unidades de centrifugação com filtro AmiconMilliporeSigmaUFC9100Ultrafiltração rápida
AV5-siRNA-GFP Adicionar #124972Plasmídeo
Competente DH5&alfa; bactérias Invitrogen#18265-017Cepa quimicamente competente para clonagem 
HpaI Enzima de restrição New England BiolabsR0105
iMFectin transfection reagent GenDepotI7100-101
M-MLV transcriptase reversa PromegaM1708DNA polimerase dependente de RNA 
Sistema de detecção de PCR em tempo real de cor única MyiQ Kit livre deqRT-PCR
BioteckD6915-03Plasmídeo DNA midi prep 
Hexâmeros aleatórios Invitrogen48190-011
Supermix SYBR reagente verde Bio-Rad1708882Aplicações de PCR em tempo real
T4 DNA LigasePromegaM1801
TRIzol Reagent Life Technologies15596-018Isolamento de RNA total de alta qualidade
XhoINew England BiolabsR0146Enzima de restrição
endotoxinas Omega BUN9740RAD Bio-Rad

Referências

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