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Investigando a diferenciação de células T CD4 murinas usando ablação gênica mediada por complexo de ribonucleoproteína CRISPR-Cas9

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DOI:

10.3791/67380

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20 de junho de 2025

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH

Neste artigo

Resumo

Descrevemos uma abordagem altamente adaptável para o uso da ablação gênica mediada por complexo de ribonucleoproteína CRISPR-Cas9 em células T CD4 virgens de murinos para investigar a função gênica na diferenciação de células T CD4.

Resumo

A ampla acessibilidade da tecnologia de repetição palindrômica curta agrupada regularmente interespaçada (CRISPR)-Cas9 tornou o direcionamento de genes em células primárias um método de rotina para avaliar a função gênica em células T. Dado o custo e a disponibilidade limitada de cepas de camundongos knockout (KO), testar hipóteses preliminares envolvendo a função do gene em células T pode ser proibitivo usando modelos animais direcionados a genes. No entanto, usando recursos disponíveis comercialmente, incluindo RNAs guia (gRNAs) pré-projetados, os pesquisadores podem gerar convenientemente células T virgens direcionadas a genes que podem ser usadas para estudos de ativação e diferenciação de células T.

Aqui, descrevemos um protocolo para o uso de complexos de ribonucleoproteína (RNPs) CRISPR-Cas9 entregues por nucleofecção para gerar eficientemente células T CD4 virgens murinas do gene KO que podem ser usadas para avaliar a função do gene na diferenciação de células T CD4, in vitro. O isolamento de células T CD4 virgens de órgãos linfóides secundários de camundongos, seguido de nucleofecção com complexos Cas9-gRNA, garante que o gene KO seja iniciado antes da ativação das células T a jusante, oferecendo uma vantagem estratégica sobre a entrega de gRNA mediada por retrovírus, que normalmente requer pré-ativação de células T, impedindo a avaliação de efeitos em células T virgens. Além disso, este método baseado em nucleofecção ignora possíveis problemas de desenvolvimento associados ao gene KO animais.

Após a entrega de Cas9-gRNA, descrevemos protocolos para estudar a diferenciação de células T CD4 nas linhagens Th1, Th2, Th17 e Treg usando polarização in vitro . Além disso, este protocolo é adaptável ao uso de células T CD4 ou CD8 direcionadas a genes para inúmeras aplicações a jusante, incluindo outros estudos de ativação de células T in vitro e estudos de transferência adotiva in vivo. O uso de métodos CRISPR-Cas9 simplificou nossa capacidade de avaliar a função gênica em células T e permite o KO de rotina de muitos genes de interesse, liberando os pesquisadores das limitações associadas ao estudo do gene KO em animais.

Introdução

O uso de tecnologias baseadas em repetição palindrômica curta (CRISPR) agrupada regularmente interespaçada transformou nossa capacidade de manipular sequências de DNA genômico, aumentando muito nossa capacidade de estudar a função gênica em inúmeros sistemas biológicos. Com relação às células T CD4, surgiram métodos que utilizam complexos ribonucleoproteicos (RNP) CRISPR-Cas9, facilitando o nocaute gênico (KO) eficiente em células T virgens primárias que podem ser usadas para estudos in vitro e in vivo 1,2,3,4. A identificação de novos genes putativos que regulam a diferenciação de células T CD4 é frequentemente impulsionada por análises transcriptômicas e epigenômicas, gerando novos alvos para os quais pode haver poucos ou difíceis de obter recursos para investigar, particularmente se o gene afetar vários tecidos e pode exigir avaliação usando camundongos direcionados a genes condicionais. O direcionamento de genes via transdução retroviral de gRNAs 5,6 tem sido usado para avaliar a função gênica em células T, mas requer ativação de células T para infecção retroviral e não pode ser usado para direcionar genes em células T virgens. O CRISPR-Cas9 entregue por nucleofecção em células T virgens oferece uma ferramenta alternativa relativamente barata e rápida para validar e interrogar novos genes de interesse antes de investir em modelos de camundongos demorados e caros.

Em nosso protocolo descrito aqui, a edição gênica mediada por CRISPR-Cas9 é realizada usando a proteína Cas9 recombinante complexada com moléculas de RNA guia (gRNA) que são entregues em células T CD4 virgens por meio de nucleofecção. O gRNA é composto de dois componentes distintos, um RNA CRISPR transativador (tracrRNA) e um RNA CRISPR (crRNA). Funcionalmente, as sequências derivadas de tracrRNA facilitam a associação do gRNA com Cas9, enquanto as sequências de crRNA contêm especificidade para regiões de DNA alvo de interesse. Os complexos Cas9-gRNA medeiam quebras de DNA de fita dupla direcionada (dsDNA), com gRNAs mediando a especificidade da sequência da atividade da endonuclease Cas9 7,8. A clivagem mediada por Cas9 do dsDNA leva à inativação do gene, através da geração de mutações indel após a junção final não homóloga nas células-alvo9. Neste protocolo, recomendamos o uso de vários gRNAs direcionados a genes de interesse para garantir KO robusto em células T CD4 virgens.

As células T CD4 auxiliares são atores-chave no sistema imunológico, orientando as respostas imunes por meio da produção de uma variedade de citocinas que modulam a função de muitos tipos de células imunológicas. Após a estimulação através do receptor de células T (TCR) na presença de citocinas específicas, as células T CD4 virgens podem se diferenciar em linhagens distintas de células T T auxiliares (Th), incluindo Th1, Th2, Th17 e células T reguladoras (Treg)10,11,12. A definição dessas linhagens distintas de células T CD4 é a expressão de fatores de transcrição (TFs) e citocinas definidoras de linhagem específicas (Figura 1). A diferenciação de células T CD4 pode ser modelada usando polarização in vitro 13,14,15, usando células T CD4 virgens ativadas através do TCR na presença de citocinas promotoras de linhagem e anticorpos bloqueadores que impedem a adoção inadequada da linhagem.

A combinação do direcionamento do gene CRISPR-Cas9 em células T CD4 virgens com a polarização in vitro de células T CD4 oferece um sistema robusto para avaliar a função gênica nessas células (Figura 2). Dada a ampla disponibilidade de reagentes para avaliar a diferenciação de CD4 por citometria de fluxo, os principais aspectos da diferenciação de células T CD4, incluindo a expressão de TF e a produção de citocinas, podem ser facilmente interrogados usando os protocolos descritos aqui. A identificação de novos genes que regulam a função das células T CD4 melhora nossa compreensão dessas células, e os métodos CRISPR-Cas9 combinados com a polarização in vitro oferecem uma modalidade robusta para avaliar a função do gene antes de se comprometer com modelos de camundongos KO do gene.

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Protocolo

Para todos os procedimentos aqui descritos, usamos camundongos C57 / BL6J do tipo selvagem (WT). Os camundongos foram mantidos e tratados em condições específicas livres de patógenos (FPS) de acordo com as diretrizes do NIAID (protocolo LISB-22E) e os comitês de Cuidados e Uso de Animais do NIH (Animal Welfare Assurance #A-4149-01).

1. Considerações antes de começar

  1. Seleção de reagentes de gRNA
    NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter reagentes de gRNA pré-projetados direcionados ao genoma do camundongo usado neste protocolo.
    1. Pesquise o gene de interesse (Tabela de Materiais, crRNAs desejados) e selecione os três principais crRNAs pré-projetados classificados (formato de 2 nmol). Além disso, obtenha crRNA de controle negativo para usar em paralelo (Tabela de Materiais).
      NOTA: A formação de gRNAs funcionais requer a duplexação de crRNA com tracrRNA; obtenha um reagente de tracrRNA e siga as etapas da seção 3.
    2. Projete sequências de gRNA direcionadas personalizadas.
      NOTA: O projeto de sequências de gRNA direcionadas personalizadas está fora do escopo deste protocolo, mas pode ser realizado usando ferramentas disponíveis publicamente, como CRISPick (Tabela de Materiais).
  2. Buffers, mídia e equipamentos
    NOTA: Salvo indicação em contrário, use tampões e reagentes frios (4 °C).
    1. Prepare o tampão MACS, o tampão FACS, o tampão Triton X-100 a 0,5%, o tampão de permeabilização 1x, a mídia RPMI completa e a mídia IMDM completa (Tabela de Materiais) antes de iniciar o procedimento e armazene a 4 °C.
    2. Obtenha isolamento de células T CD4 virgens e kits de microesferas anti-FITC (Tabela de Materiais) antes de iniciar este procedimento.
    3. Antes de iniciar a nucleofecção (seção 4), pré-aqueça (37 ° C) 5 mL de meio IMDM completo e prepare um mínimo de 10 mL de IMDM completo suplementado com IL-7 a 5 ng / μL aquecido a 37 ° C (Tabela de Materiais). Ajuste o volume do meio pré-aquecido conforme necessário para levar em conta a adição de 125 μL por amostra após a nucleofecção. Ajuste o volume de IMDM completo contendo IL-7 conforme necessário, com base no número de células nucleofecadas (seção 4).
    4. Antes de iniciar o isolamento das células apresentadoras de antígeno (APC), prepare o reagente de mitomicina C adicionando 4 mL de H2O estéril ao frasco de 2 mg de mitomicina C (concentração estoque de 0,5 mg / mL).
      NOTA: Execute todas as etapas em uma capa de cultura de tecidos e use técnicas assépticas estéreis.

2. Isolamento ingênuo de células T CD4

NOTA: As células T CD4 virgens podem ser isoladas usando isolamento magnético ou por meio de classificação celular. A pureza obtida a partir do isolamento magnético é tipicamente de 97% e a viabilidade celular é muito alta, enquanto a classificação eletrônica pode melhorar a pureza celular às custas da viabilidade celular. O protocolo descrito aqui usará isolamento magnético, mas pode ser adaptado a qualquer cenário. Certifique-se de que as colunas LS estejam preparadas adequadamente (Tabela de Materiais).

  1. Isole o baço e os gânglios linfáticos (inguinal, braquial, axial e cervical) dos camundongos (camundongos WT C57BL / 6J usados aqui).
  2. Colocar um ecrã de 70 μm numa placa de 60 mm com 5 ml de RPMI (Tabela de Materiais) completa para cada tecido processado. Processe os gânglios linfáticos e o baço em diferentes placas para aumentar o rendimento. Triture suavemente os tecidos através do filtro usando um êmbolo de uma seringa de 3 mL. Enxágue o filtro com 1-3 mL de meio e transfira as suspensões de célula única para tubos cônicos de 15 mL.
  3. Repita a etapa 2.2 para linfonodos e tecidos esplênicos adicionais, conforme necessário.
  4. Centrifugar as suspensões unicelulares a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
  5. Prepare-se para contar as células da seguinte maneira.
    1. Para amostras esplênicas, aspire o sobrenadante, ressuspenda suavemente o pellet celular em 1 mL de tampão de lise ACK, incube por 2-5 min em RT, adicione 2 mL de RPMI completo, gire para baixo, ressuspenda em 5 mL de RPMI completo e conte as células.
    2. Para células linfonodais, aspire o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em 5 mL de RPMI completo fresco e conte as células.
  6. Para entrada no kit de isolamento CD4 virgem, misture os esplenócitos com células linfonodais, para atingir o número de células desejado para isolamento.
    NOTA: Normalmente, 1 × 108 células linfonodais, linfonodos e baços de camundongos WT-B6 produzem 2-8 × 106 células T CD4 virgens.
  7. Centrifugue as células agrupadas do baço e dos linfonodos a 500 × g durante 5 min a 4 °C, remova o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular no volume apropriado de tampão MACS (Tabela de Materiais), conforme indicado no protocolo do fabricante (kit de isolamento de células T CD4 sem consulta).
  8. Siga precisamente o protocolo do fabricante para isolar células T CD4 virgens por seleção negativa (Tabela de Materiais) usando Coquetel de Anticorpo de Biotina de Células T CD4+ Ingênuas, Microesferas Anti-Biotina e Microesferas CD44; use colunas LS para este isolamento e colete as células em tubos cônicos de 15 mL.
  9. Após o isolamento, centrifugue as células a 500 × g durante 5 min, 4 °C, remova o sobrenadante, ressuspenda o sedimento celular em 2 ml de meio RPMI completo e conte as células.
  10. Conservar as células a 4 °C até estarem prontas para iniciar a nucleofecção.

3. Formação do complexo Cas9-gRNA

NOTA: Prepare estoques de crRNA de controle negativo e específicos do gene. Descrevemos o uso de um crRNA exclusivo para condições de controle negativo e três crRNAs exclusivos para condições de direcionamento de genes. O uso simultâneo de três crRNAs distintos garante o KO dos genes de interesse.

  1. Ressuspenda os crRNAs e tracrRNA para concentrações de estoque de 100 μM usando tampão duplex (Tabela de Materiais). Isso equivale a 10 μL de tampão por 1 nmol de RNA.
  2. Combine crRNAs individuais com tracrRNA na proporção de 1:1 em tubos de PCR estéreis e misture por pipetagem. Aqueça a 95 °C por 5 min em um termociclador. Em seguida, deixe os complexos esfriarem até RT em uma bancada por pelo menos 10 min.
    NOTA: os duplexes crRNA/tracrRNA são chamados de gRNAs a partir deste ponto. Os complexos são estáveis por pelo menos 6 meses se armazenados a -20 °C. Normalmente produzimos 6 μL de gRNA (3 μL de crRNA + 3 μL de tracrRNA) por execução, fornecendo material suficiente para cerca de cinco amostras (1 μL/amostra).
  3. Para gRNAs direcionados a genes: Em tubos de PCR estéreis, adicione 3 μL de gRNAs (1 μL de cada um dos três gRNAs exclusivos por alvo), 1 μL de proteína Cas9 e 1 μL de tampão Duplex (5 μL no total por amostra). Pipete suavemente para misturar e garantir que todo o material esteja no fundo do tubo. Incubar em RT por 10 min. Sincronize o tempo desta etapa com a nucleofecção (etapas 4.1-4.2).
  4. Para gRNA de controle negativo: Em tubos de PCR estéreis, adicione 1 μL de gRNA, 1 μL de proteína Cas9 e 3 μL de tampão Duplex (5 μL no total por amostra). Pipete suavemente para misturar e garantir que todo o material esteja no fundo do tubo. Incubar em RT por 10 min. Novamente, sincronize o tempo desta etapa com a nucleofecção (etapas 4.1-4.2).
    NOTA: O uso de 50 pmol de gRNA para controle negativo (versus 3 x 50 pmol para teste) é mais econômico e não tem impacto nos resultados.

4. Nucleofecção - ablação gênica mediada por Cas9-gRNA

  1. Centrifugar 1-8 × 106 células T purificadas a 500 × g durante 5 min, 4 °C por amostra de nucleofecção. Remova cuidadosamente o máximo de sobrenadante possível.
  2. Ressuspender as células em 20 μL de tampão P3 (16,4 μL de P3 + 3,6 μL de suplemento por amostra; Kit Nucleofector Misture e transfira para poços independentes de uma nucleocuvette de 16 poços (Kit Nucleofector, Tabela de Materiais). Certifique-se de que não se formaram bolhas ao transferir células para a cubeta, pois isso pode afetar negativamente a eficiência da nucleofecção. Bata a cubeta contra uma superfície de trabalho para garantir que todo o material esteja no fundo de cada poço e livre de bolhas.
  3. Execute a nucleofecção usando o programa DN100 do nucleofector referenciado (Tabela de Materiais). Adicione imediatamente 125 μL de meio IMDM completo pré-aquecido aos poços de nucleocuvette e transfira as células para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Enxágue cada poço mais uma vez com 125 μL de meio pré-aquecido para garantir a coleta de todas as células.
  4. Centrifugue as células a 500 × g por 5 min, 4 ° C, remova todos os meios e ressuspenda em 200 μL de meio IMDM completo aquecido + 5 ng / mL IL-7 (Tabela de Materiais).
  5. Transfira 200 μL das células para a placa de cultura e adicione meio IMDM completo aquecido + 5 ng/mL IL-7 para fazer o volume final desejado de acordo com o tamanho da placa da seguinte forma: 1-2 × 106 células por poço em uma placa de 48 poços (1 mL de meio por poço), 2-4 × 106 células por poço em uma placa de 24 poços (1,5 mL de meio por poço) de volume, 4-6 × 106 células por poço em uma placa de 12 poços (2 mL de meio por poço) e 6-10 × 106 células por poço em uma placa de 6 poços (4 mL de meio por poço). Cultivar as células numa incubadora a 37 °C, 5% de CO2 durante 3 dias.
    NOTA: Dependendo da renovação da proteína e do ensaio a jusante, otimize este período de cultura. Encontramos um período de descanso ideal de 3 dias, mas isso pode ser ajustado com base no gene alvo para entre 1 e 7 dias usando essas condições.
  6. Após a cultura em meio IMDM completo + 5 ng/mL de IL-7, ressuspenda as células pipetando e colete-as em tubos cônicos de 15mL. Centrifugue as células a 500 × g durante 5 min, 4 °C, remova o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular em 1 ml de meio RPMI completo.
  7. Conte as células para determinar o número de células T CD4 vivas virgens correspondentes às células nucleofectadas de gRNA de interesse.
    NOTA: No processo de nucleofecção, espere perder ~ 50% das células de entrada ao longo deste protocolo e ajuste o número de células T CD4 virgens usadas de acordo. Além disso, neste ponto, você pode testar a eficiência do direcionamento do gene em células T CD4 virgens usando uma variedade de técnicas (citometria de fluxo, western blot, qPCR ou ensaio T7EI).

5. Isolamento de células apresentadoras de antígeno (APC)

NOTA: Certifique-se de que o reagente de mitomicina foi preparado, que será usado para tratar APCs após o isolamento (Tabela de Materiais). Leia o protocolo de microesferas anti-FITC do fabricante antes de começar e certifique-se de que as colunas LS estejam preparadas adequadamente (Tabela de Materiais).

  1. Isole os baços de camundongos WT designados para isolamento de APC.
  2. Faça suspensões unicelulares conforme descrito acima (2.2, 2.5.1) - lise eritrócitos com tampão de lise ACK, ressuspenda o pellet celular em 5 mL de RPMI completo (4 ° C) e conte as células.
    NOTA: Após o isolamento do APC, espere obter aproximadamente metade do número de células de entrada, por exemplo, 1 × 108 esplenócitos de entrada produzirão ~ 40-50 × 106 APCs. Prepare o número desejado de esplenócitos para isolamento.
  3. Centrifugue as células a 500 × g durante 5 min, 4 °C, e ressuspenda o sedimento celular em 800 μL de tampão MACS (Tabela de Materiais).
  4. Adicione 4 μL de anticorpos anti-CD4 e anti-CD8 conjugados com FITC (Tabela de Materiais) aos esplenócitos. Misture bem e incube a 4 °C por 15 min.
  5. Centrifugar as células a 500 × g durante 5 min, 4 °C e remover o sobrenadante. Seguindo as instruções do fabricante, ressuspenda as células no volume recomendado de tampão MACS e adicione a quantidade apropriada de microesferas anti-FITC (Tabela de Materiais).
  6. Incubar as células a 4 °C durante 15 min. Centrifugar as células a 500 × g durante 5 min, 4 °C. Ressuspenda as células em 500 μL de tampão MACS e passe as células pela coluna LS preparada, conforme descrito no protocolo do fabricante, coletando as células em um tubo cônico de 15 mL.
  7. Centrifugue as células a 600 × g por 5 min, 4 ° C, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 2,7 mL de PBS 1x estéril.
    NOTA: Os APCs podem ser mal pellets; Use uma velocidade aumentada para centrifugação.
  8. Adicione 300 μL de solução de mitomicina C às células para fazer uma concentração final de 50 μg / mL. Misturar bem e incubar a 37 °C em banho-maria durante 30 min ou durante 45 min a 37 °C, 5% de CO2 numa incubadora.
  9. Após a incubação, centrifugue as células a 600 × g por 5 min, 4 ° C e lave-as com 10 mL de PBS 1x estéril. Use vácuo para remover o máximo de sobrenadante possível. Repita a lavagem 2x.
  10. Centrifugue as células novamente a 600 × g por 5 min, 4 ° C, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 5 mL de meio RPMI completo (4 ° C). Conte as células. Armazene as APCs a 4 ° C até que estejam prontas para realizar a diferenciação de células T CD4.

6. Diferenciação de células T CD4

NOTA: Este protocolo é definido para cultivar células em um formato de placa de 48 poços - 2 × 105 CD4 ingênuo + 1 × 106 APC por poço - uma proporção de 1: 5. As células são cultivadas em meio IMDM completo. Aqui, forneceremos condições para a diferenciação de células T CD4 Th1, Th2, Th17 e Treg; no entanto, as condições de linhagem individuais podem ser escolhidas dependendo do foco do usuário.

  1. Determine o número de células em uma placa de 48 poços a ser usada e calcule o número de células necessárias para cada tipo de célula.
    NOTA: Por exemplo, 10 poços exigiriam 2 × 106 CD4 ingênuos e 10 × 106 APCs para manter a proporção de 1:5. Se o número de células permitir, calcule células suficientes para um poço adicional para contabilizar qualquer erro de pipetagem durante o recobrimento.
  2. Misture o número desejado de CD4 e APCs virgens a 1: 5, centrifugue as células a 600 × g por 5 min, 4 ° C, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 500 μL de meio IMDM completo por poço (por exemplo, células correspondentes a 10 poços em 5 mL de meio).
  3. Plaquear incrementos de 500 μL de células em poços de uma placa de 48 poços, garantindo que cada poço contenha 2 × 105 CD4 + 1 × 106 APCs.
  4. Para as condições desejadas de diferenciação de células T CD4, prepare 2x misturas de citocinas + anticorpos em IMDM completo, conforme descrito na Tabela 1. Adicione 500 μL da mistura 2x aos incrementos de 500 μL previamente plaqueados de células para fazer as concentrações finais de reagentes 1x.
    NOTA: Esses exemplos são baseados na confecção de 2,5 mL de preparações 2x, o suficiente para cinco poços para cada condição. Novamente, se as quantidades de reagente permitirem, faça um incremento adicional de 2x a mistura para compensar o erro de pipetagem.
  5. Adicione 500 μL de meio 2x citocina + anticorpo a 500 μL de poços contendo células CD4 / APC para fazer uma concentração final de reagentes em 1x.
  6. Coloque a placa de 48 poços em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2. Cultivar as células durante 72 h para permitir a conclusão da polarização do CD4.
    NOTA: Examine a placa após o período de cultura para garantir um crescimento robusto. O meio deve ser de cor laranja após a incubação, com o meio amarelo indicando potencial crescimento excessivo de células.

7. Avaliação do impacto da ablação gênica na diferenciação de células T CD4

NOTA: Para todas as etapas de coloração, prepare uma mistura principal de anticorpos adicionados na diluição apropriada ao tampão de coloração necessário. Utiliza-se um volume de 50 μL do cocktail anticorpo/tampão por amostra. Ajuste os anticorpos específicos usados com base no experimento. Os usuários devem escolher painéis de anticorpos relevantes para seus experimentos específicos; Aqui, fornecemos um modelo para abordar isso no contexto dos genes visados aqui.

  1. Após a diferenciação de CD4, remova cuidadosamente 600 μL do sobrenadante e, em seguida, ressuspenda as células em cada poço por pipetagem.
  2. Remova 200 μL das células de cada poço e adicione-as a uma placa de 96 poços marcada para coloração do fator de transcrição. Granular as amostras centrifugando a 500 × g durante 5 min a 4 °C, retirar o sobrenadante e proceder à coloração superficial (passo 7.5).
  3. Para análise de citocinas, reestimule os 200 μL restantes de células com PMA (50 ng/mL), Ionomicina (500 ng/mL) e Golgi Stop (diluição de 1/2.000) em IMDM completo. Adicione 200 μL da mistura de reestimulação 2x a cada poço e incube a 37 °C, 5% de CO2 por 4 h.
    NOTA: Deve haver 200 μL restantes na placa de 48 poços; portanto, adicionar 200 μL da mistura 2x de PMA (2x, 100 ng/mL), Ionomicina (2x, 1 μg/mL) e Golgi Stop (2x, 1/1.000) criará uma concentração final de 1x (Tabela de Materiais).
  4. Enquanto isso, comece a coloração com fator de transcrição. Realize a coloração do antígeno de superfície ressuspendendo as células em 50 μL de tampão FACS contendo os anticorpos conjugados com fluorocromo desejados por amostra (Tabela 2). Incubar no escuro a 4 °C durante 30 min.
  5. Adicione 150 μL de tampão FACS a cada poço para lavar o tampão de coloração. Centrifugar a placa a 500 × g durante 5 min a 4 °C. Desligue o sobrenadante. Repita para um total de duas lavagens.
  6. Fixe as células com 100 μL de solução de fixação Foxp3 (Tabela de Materiais) no escuro em RT por 25 min.
  7. Após 25 min, adicione 100 μL de tampão FACS a cada poço para lavar o fixador. Centrifugar a placa a 500 × g durante 5 min a 4 °C e retirar o sobrenadante. Repita para um total de duas lavagens.
  8. Realize a coloração intracelular ressuspendendo as células em 50 μL de tampão de permeabilização 1x Foxp3 contendo anticorpos específicos do fator de transcrição diretamente conjugados por amostra (Tabela 2) por um mínimo de 1 h a 4 ° C no escuro.
  9. Após a coloração intracelular estar completa, adicione 100 μL de tampão FACS a cada poço. Centrifugar a placa a 500 × g durante 5 min a 4 °C e retirar o sobrenadante. Repita para um total de duas lavagens. Ressuspenda as células em um volume final de 200 mL para citometria de fluxo.
  10. Após a reestimulação de PMA / ionomicina / Golgi Stop, ressuspenda as células pipetando e transfira 400 μL de cada amostra de citocina para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Aplicar pellets nas amostras a 500 × g durante 5 min a 4 °C e remover o sobrenadante. Ressuspenda as amostras de células em 100 μL de tampão FACS e transfira-as para uma placa de 96 poços para coloração da superfície. Pelete novamente as amostras centrifugando a 500 × g durante 5 min a 4 °C, retire o sobrenadante.
  11. Prepare um coquetel de coloração de superfície com tampão FACS contendo anticorpos fluorescentes direcionados contra antígenos de superfície (Tabela 2). Ressuspenda as células em 50 μL de tampão de coloração por amostra e incube por 30 min a 4 ° C no escuro.
  12. Adicione 150 μL de tampão FACS a cada poço para lavar o tampão de coloração. Centrifugar a placa a 500 × g durante 5 min a 4 °C. Desligue o sobrenadante. Repita para um total de duas lavagens.
  13. Fixe as células em 100 μL de PFA a 4% (Tabela de Materiais) no escuro em RT por 25 min.
  14. Adicione 100 μL de tampão FACS a cada poço para lavar o fixador. Centrifugar a placa a 500 × g durante 5 min a 4 °C. Desligue o sobrenadante. Repita para um total de duas lavagens.
  15. Realize a coloração intracelular de citocinas ressuspendendo as células em 50 μL de anticorpo anticitocina contendo 0,5% de tampão de coloração Triton X-100 por amostra (Tabela 2) por um mínimo de 1 h a 4 ° C no escuro.
  16. Após a coloração intracelular estar completa, adicione 100 μL de tampão FACS a cada poço. Centrifugar a placa a 500 × g durante 5 min a 4 °C e retirar o sobrenadante. Repita para um total de duas lavagens. Ressuspenda as células em um volume final de 200 mL para citometria de fluxo.
  17. Analise o fator de transcrição e as amostras coradas com citocinas por citometria de fluxo.
    NOTA: Os perfis de citometria de fluxo esperados dos painéis de coloração descritos serão mostrados na seção de resultados representativos.

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Resultados

Para validar que uma população pura de células T CD4 virgens foi obtida usando nosso protocolo (Seção 2), usamos citometria de fluxo para identificar essas células antes e depois do isolamento magnético. Usando nossa abordagem, obtivemos uma população altamente pura de células T CD4+TCRb+CD25-CD44-CD62L+ vivas virgens após o isolamento (Figura 3A). Além disso, para confirmar que os complexos Cas9-gRNA foram nucleofecados...

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Discussão

A integração de protocolos para a entrega de complexos CRISPR-Cas9 em células T CD4 virgens com métodos para estudar a diferenciação de células T CD4 fornece uma ferramenta robusta para explorar novos genes que regulam a biologia das células T CD4. Aqui, fornecemos um guia abrangente para a utilização de reagentes Cas9 e gRNA disponíveis comercialmente que são fáceis de trabalhar. A entrega mediada por nucleofecção de complexos Cas9-gRNA em células T CD4 virgens fornece edição de genes a...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIAID, NIH.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,5 M EDTA, pH = 8,0IPM Scientific11005-016
16% Paraformaldeído, PFAMicroscopia Eletrônica Sciences15710Diluir com PBS para fazer solução fixadora de PFA a 4%
1x tampão eBioscience (1x tampão de permeabilização)Thermo Fisher Scientific00-5523-00Use tampão de permeabilização do kit para fazer 1x solução
1x PBS, pH = 7,4Qualidade Biológico114-058-101
2-mercaptoetanol (1000x)Gibco21985-023
4D Nucleofector Core UnitLonzaAAF-1003B
4D Nucleofector X UnitLonzaAAF-1003X
60 mm pratoFalcon353002
70 µ Filtro de malha de nylonFisherbrand22363548
ACK Lysing BufferGibcoA10492-01
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X KitLonzaV4XP-3032Este kit inclui: P3 Primary Cell Solution, Suplemento 1, e tiras de nucleocuvette de 16 poços
microesferas anti-FITCMiltenyi Biotec130-048-701Siga o protocolo de microesferas anti-FITC Miltenyi
CD28 (37.51)bioXcellBE0015-1consulte a Tabela 1 para concentração de estoque
anti-mouse CD3e (145-2C11)bioXcellBE0001-1consulte a Tabela 1 para concentração de estoque
anti-mouse IFN e gama; (XMG1.2)bioXcellBE0055consulte a Tabela 1 para concentração de estoque
anti-camundongo IL-12p40 (C17.8)bioXcellBE0051consulte a Tabela 1 para concentração de estoque
anti-camundongo IL-4 (11B11)bioXcellBE0045consulte a Tabela 1 para concentração de estoque
BioLite 48-well MutlidishThermo Fisher Scientific130187
Albumina de soro bovino, BSASigma Life CiênciaA3059
Cas9 enzimaIDT1081059Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 (10mg/mL) - contém sequência de localização nuclear
IMDM + IL-7 completo IMDMcompleto com 5 ng/mL IL-7
IMDM completo IMDM+GlutMAX, 10% FBS, 1% L-glutamina, 1% caneta/estreptococos, 0,1% BME
MídiaRPMI completaRPMI-1640, 10% FBS, 1% L-Glutamina, 1% Pen/Strep, 0.1% BME
CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
crRNAs desejados IDTUsado pré-projetado do site da IDT: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN  
eBioscience FOXP3/Conjunto de tampão de coloração de fator de transcriçãoThermo Fisher Scientific00-5523-00O kit contém três reagentes: Concentrado de fixação/permeabilização (4x), Diluente de fixação/permeabilização e Tampão de permeabilização (10x)
Tampão1x PBS, 1% FBS, 1 mM EDTA
Fetal Bovine Serum (FBS)VWR Seradigm Life Science97068-085Inative o calor antes do uso (aqueça a 56° C por 45 minutos)
FITC anti-mouse CD4 (RM4-5)Biolegend100510diluição 1/200 (concentração de estoque de 0,5 mg/mL)
FITC anti-mouse CD8α (53-6,7)Biolegend100706diluição de 1/200 (concentração de estoque de 0,5 mg/mL)
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZdiluição de 1/2000
IMDM (1x) + GlutMAX-1 MeioGibco31980-030
Sal de cálcio de ionomicina de Streptomyces conglobatus (1 mg/mL)Sigma Aldrich10634Concentração final recomendada de 500 ng/mL
de L-Glutamina 200 mM (100x)Colunas LS Gibco25030-081
Miltenyi Biotec130-042-401
MACS Buffer1x PBS, 0.5% BSA, 1 mM EDTA, filtro esterilizado
Mitomicina C (0.5 mg/mL)Millipore SigmaM4287-2MG 
Naï do rato; ve Kit de Isolamento de Células T CD4Miltenyi Biotec130-104-453Siga Miltenyi Naï ve Protocolo de Isolamento de Células T CD4. Este kit inclui Naï coquetel do anticorpo da biotina da pilha T de ve CD4+, microesferas da Anti-biotina e microesferas CD44
O crRNAIDT1072544alternativa a projetar possuir
frente e verso livres do tubo do PCR do amortecedorIDT1072570 do
EUACientífico 1402-2700
EstreptomicinaGibco15140-023
da penicilinaPhorbol 12-miristato 13-acetato, PMA (100 µ g/mL)Sigma AldrichP8139Concentração final recomendada de 50 ng/mL
ProSeries Tubos de centrífuga de 15mL de alto desempenhoAlkali ScientificPS5600Tubos cônicos de 15 mL
humanos recombinantes (h) IL-2Peprotech200-02consulte a Tabela 1 para concentração de estoque
humano recombinante TGF-b1 (derivado de HEK293)Peprotech100-21consulte a Tabela 1 para estoque
IL-12p70 murino recombinantePeprotech210-12consulte a Tabela 1 para
IL-4 murino recombinantePeprotech214-14consulte a Tabela 1 para
IL-6 murino recombinantePeprotech216-16consulte a Tabela 1 para
IL-7 murino recombinantePeprotech217-17Prepare a 100 ng / mL
RPMI 1640 MediaGibco21870-076
TermocicladorApplied Biosystems4375786Usamos este modelo de termociclador, no entanto, qualquer equipamento semelhante funcionará bem neste protocolo
tracrRNA Atto550 rotulado IDT1075928Permite a detecção de complexos Cas9-gRNA após nuceloefecção usando fluorescência Atto550 como leitura. Recomendamos este reagente, se possível. 
Triton-X Buffer1x PBS, 0.5% TritonX-100, 0.1% BSA
TritonX-100BioRad161-0407
tracrRNA não marcado IDT1072534Uma opção de tracrRNA mais econômica, mas não permite a avaliação da eficiência de nucelofecção de complexos Cas9-gRNA
Veriti Thermal Cycler, Fast Thermo Fisher Scientific de 96 poços4375305Usamos este modelo de termociclador, no entanto, qualquer equipamento semelhante funcionará bem neste protocolo
anti-rato FACS do controle negativo tiras Duplex do controle negativo de concentração de estoque de concentração de estoque de concentração de estoque de concentração de estoque

Referências

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