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Artigo de método

Imagem ao vivo estendida de nichos de células-tronco germinativas de Drosophila melanogaster fêmea

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DOI:

10.3791/67389

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20 de dezembro de 2024

 ,  , 
1Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, CSIC/Universidad Pablo de Olavide/JA, 2Departamento de Genética, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla

Neste artigo

Resumo

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para realizar imagens ao vivo da divisão assimétrica de células-tronco germinativas (GSCs) no nicho ovariano de Drosophila. Usamos uma linhagem transgênica que expressa de forma ubíqua uma fusão de proteína fluorescente verde (GFP) da proteína do espectrossomo Par-1.

Resumo

Os métodos de imagem ao vivo permitem a análise de processos celulares dinâmicos em detalhes e em tempo real. O ovário de Drosophila representa um excelente modelo para explorar a dinâmica de uma miríade de processos de desenvolvimento, como divisão celular, estaminalidade, diferenciação, migração, apoptose, autofagia, adesão celular, etc., ao longo do tempo. Recentemente, implementamos uma cultura ex vivo estendida e imagens ao vivo do nicho feminino de Drosophila GSC. Usando uma linhagem de Drosophila que abriga um transgene GFP::P ar-1 como exemplo, este método permite a visualização da divisão assimétrica das GSCs dentro de seu nicho e a descrição das mudanças na morfologia do espectrossomo ao longo do ciclo celular. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a cultura ex vivo de Drosophila germaria, permitindo a visualização prolongada do nicho feminino do GSC. É importante ressaltar que este protocolo é amplamente aplicável a GSCs de imagem ao vivo com várias proteínas de interesse marcadas com fluorescência que estão disponíveis em centros de estoque e / ou na comunidade de pesquisa de Drosophila.

Introdução

Imagens ao vivo de processos biológicos são fundamentais para obter evidências experimentais diretas. A combinação de microscopia confocal avançada e a otimização de metodologias permite a exploração de múltiplos eventos biológicos com alta precisão. A otimização de etapas em protocolos como manipulação e dissecção de tecidos, preparação e preservação de amostras e configurações de aquisição de microscopia é fundamental para maximizar a confiabilidade e a robustez dos resultados obtidos. Aqui, apresentamos um protocolo para monitorar amostras para imagens estendidas, que é especialmente focado em ovários de Drosophila melanogaster. O ovário de Drosophila melanogaster é um excelente sistema modelo para a análise de uma ampla gama de processos de desenvolvimento. Entre muitos outros, este órgão reprodutor da mosca da fruta Drosophila melanogaster contém um nicho de células-tronco adultas muito bem definido. Este nicho GSC sustenta o desenvolvimento dos gametas femininos durante a idade adulta. Os ovários de Drosophila são compostos por aproximadamente 18 ovaríolos, onde as câmaras de ovos são desenvolvidas no germarium. Na ponta de cada germário, 2-4 GSCs são mantidas em um nicho celular somático formado principalmente por um filamento terminal de 8-10 células, uma roseta de 5-8 células de capa e 2-3 células de escolta anterior (Figura 1A). Esse nicho somático fornece aos GSCs sinais essenciais e suporte físico para manter sua stemness, controlar a proliferação e evitar a diferenciação1,2,3,4,5.

As GSCs normalmente se dividem assimetricamente para gerar uma nova célula-tronco que mantém contato com o nicho somático e uma célula-filha, o cistoblasto (CB), que perde o contato direto com as células do capuz somático e se diferencia. As GSCs e CBs contêm uma organela altamente dinâmica e citoplasmática, o espectrossomo, cuja principal função é a orientação correta do fuso mitótico durante a mitose6. O CB se divide 4 vezes com citocinese incompleta para desenvolver cistos de 16 células, onde uma das células germinativas se especifica no oócito e as outras 15 células se tornam células enfermeiras. O espectrossomo CB cresce em uma estrutura ramificada chamada fusome, que conecta as células germinativas interconectadas de 16 células. O espectrossomo é enriquecido em pequenas vesículas e proteínas esqueléticas, como a serina-treonina quinase Par-1 e o componente de membrana Hu-li tai shao (Hts)7. Durante o ciclo celular do GSC, o espectrossomo cresce pela adição de novo material e muda sua forma, permitindo a identificação das fases G1, S, G2 e M (Figura 1B)8,9.

Recentemente, implementamos um método de cultura ex vivo do germário Drosophila que permite a aquisição de imagens de GSCs vivas por até 16 h. Como essas células se dividem uma vez a cada 15,5 h em média8, esse método permite a filmagem de grandes porções do ciclo celular do GSC. Assim, em combinação com outras ferramentas, nosso método de cultura permitiu a descrição da morfologia do espectrossomo durante o ciclo celular do GSC e a análise da duração das diferentes fases do ciclo celular in vivo8 (Figura 1C). Aqui, fornecemos um protocolo detalhado desse método de imagem ao vivo estendido apoiado por um vídeo guiado passo a passo que descreve a metodologia (Figura 2).

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Protocolo

NOTA: A etapa 1.4 deve ser feita com pelo menos 2 dias de antecedência. Os passos 2.1 e 2.2 podem ser feitos com 1 dia de antecedência.

1. Configuração pré-experimental I

  1. Prepare alíquotas de 100 μL de mistura de antibióticos estreptomicina/penicilina (10.000 U/mL de penicilina e 10 mg/mL de estreptomicina) e armazene a -20 °C até o uso.
  2. Prepare 15 mL das seguintes soluções usando água pura autoclavada, armazene-as a 4 ° C e use-as dentro de um mês: Bicarbonato de sódio (NaHCO3) 0,1 M pH 8,0 e 0,1% Tween 20.
  3. Preparar o meio de cultura e a solução a seguir indicados numa capela de fluxo laminar para evitar contaminação. Use pontas e tubos de filtro esterilizados.
    1. Preparar alíquotas de 2 ml de soro fetal bovino não diluído (FBS) e conservar a -20 °C até à utilização em condições assépticas.
    2. Prepare o meio Drosophila de Schneider suplementado com 15% de FBS e 0,6% de mistura de antibiótico estreptomicina/penicilina. Preparar alíquotas de 7 ml e conservar a 4 °C. Uma alíquota é suficiente para duas placas MatTek (consulte a seção 2).
      1. Prepare a solução de Ringer (NaCl 128 mM, KCl 2 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 4 mM, Sacarose 35,5 mM, Hepes 5 mM em água pura autoclavada; pH 6,9). Preparar alíquotas de 1 ml e conservar a -20 °C até à utilização.
  4. Colete moscas de 1-2 dias expressando constitutiva e ubíquamente a proteína Par-1 fundida à GFP (linha poli Ubiquitina-mGFP6: :p ar-1) em um novo tubo com comida de mosca suplementada com fermento em pó. Cultive-os por 2 dias a 25 °C em uma estufa antes da dissecação.
    NOTA: Esta etapa pode ser feita com qualquer repórter de interesse marcado com fluorescência.

2. Revestimento e preparação da placa de fundo de vidro

  1. Coloque uma gota de 3 μL de um adesivo Cell-Tak específico (doravante denominado adesivo para células e tecidos) no centro da lamínula de uma placa revestida de poli-D-lisina de 35 mm (prato de fundo de vidro, consulte Tabela de Materiais) sem espalhamento manual. Use pontas estéreis.
    NOTA: O adesivo para células e tecidos deve ser armazenado a 4 °C. No caso de experimentos com duas condições genéticas (normalmente, condições de controle e mutantes), coloque duas gotas individuais e bem separadas do adesivo na mesma placa de fundo de vidro. Isso garantirá que ambos os fundos genéticos sejam visualizados nas mesmas condições.
  2. Imediatamente após, adicione um volume igual (3 μL nesta configuração de protocolo) de 0,1 M NaHCO3 pH 8,0 cuidadosamente na gota adesiva de 3 μL conforme recomendado pelo fabricante e misture por pipetagem.
  3. Para evaporação completa, incubar a placa à temperatura ambiente (RT) durante 20 min e depois mantê-la a 4 °C durante a noite para ser utilizada no dia seguinte. Em alternativa, incubar a placa preparada a 37 °C durante 25 min até à evaporação completa e passar directamente para o passo seguinte. Em ambos os casos, mantenha a placa com sua tampa. Use pontas estéreis.
  4. Deixe o prato de fundo de vidro preparado atingir o RT, colocando-o na bancada por 15-20 min antes de usar.
  5. Lave 3 vezes o prato preparado com cuidado. Evite tocar e perturbar a(s) camada(s) adesiva(s). Em cada lavagem, adicione 6 μL de água pura autoclavada e, em seguida, remova a água usando uma ponta limpa para cada uma das três lavagens para eliminar os resíduos da solução de NaHCO3.
  6. Deixe a evaporação completa da água colocando a placa limpa e preparada em RT enquanto disseca por 5-10 min com a tampa para evitar partículas de poeira.

3. Dissecção do ovário de Drosophila e isolamento e montagem do ovário

NOTA: A dissecção do ovário é realizada em solução de Ringer (em vez de meio de Schneider) sem FBS para evitar a presença de proteínas que possam interferir na aderência do tecido da amostra ao adesivo.

  1. Limpe um prato de dissecação de três poços, fórceps e agulhas de dissecção com etanol a 70% antes de começar.
  2. Adicione um volume suficiente (~ 200 μL) de solução de Ringer em cada um dos três poços.
  3. Dissecar os ovários de 5 fêmeas alimentadas com leveduras em 200 μL de solução de Ringer no primeiro poço com a ajuda de dois pares de pinças seguindo os procedimentos padrão10,11. Pegue a fêmea Drosophila na interseção do tórax e abdômen com uma das pinças. Em seguida, rasgue suavemente a cutícula na parte posterior do abdômen e puxe a cutícula do abdômen até que os dois ovários fiquem expostos.
  4. Transfira os ovários dissecados para o segundo poço para reduzir a contaminação com restos de outros tecidos ou detritos resultantes da dissecção.
  5. Remova a bainha muscular de 15-20 ovaríolos com a ajuda de um estereomicroscópio (zoom 8X-13,5X) com iluminação de diodo emissor de luz (LED) e pinça de ponta fina. Use um par de pinças para ancorar todo o corpo do ovário e use a segunda para agarrar suavemente uma câmara de ovos em estágio avançado e alongar suavemente até que o músculo se quebre e fique para trás.
    NOTA: É essencial evitar danos à germária apenas reduzindo o contato com esta parte dos ovários. Remova as câmaras de ovos anteriores aos estágios 8-9.
  6. Transfira um a um os 15-20 ovaríolos livres de bainha muscular usando a pinça para o terceiro poço contendo 200 μL de meio de Ringer.
  7. Pré-umedeça uma ponta de 20-200 μL com 0,1% de Tween 20 por pipetagem. Isso evita a adesão dos ovaríolos às paredes de plástico da ponta.
  8. Transferir 6 μL de solução de Ringer contendo os ovaríolos sem bainha muscular usando uma ponta pré-umedecida para a placa adesiva preparada (mantida em RT).
    NOTA: Evite todo o contato entre a ponta e a camada adesiva para evitar o descolamento da germária após a deposição do ovaríolo (próximo passo). Aproximadamente 30% dos germários não aderem conforme o esperado.
  9. Para garantir que os ovaríolos transferidos adiram à superfície adesiva, pressione-os cuidadosamente até a parte inferior da gota de Ringer até que entrem em contato com a superfície adesiva usando uma agulha de dissecção ou fórceps.
    NOTA: Não tente reorganizar os ovaríolos depois que eles se assentarem.
  10. Encha a placa MatTek cuidadosamente com 3 mL de meio Schneider suplementado com a mistura de antibiótico 15% FBS e estreptomicina/penicilina 0,6% (etapa 1.3). Para evitar o descolamento dos ovaríolos, adicione lentamente 1 mL de cada vez ao redor da borda externa da placa.
  11. Transportar a placa contendo os ovaríolos sem bainha muscular em uma superfície plana para a estação de microscópio.

4. Imagens ao vivo usando um microscópio confocal

  1. Coloque a placa na objetiva 63x de um microscópio de disco giratório ou um microscópio confocal (equipamento semelhante pode ser usado) e focalize a amostra. Selecione o plano z do meio para cada germarium.
  2. Configure os seguintes parâmetros experimentais: tipo de captura: lapso de tempo 3D, ajuste a potência do laser de 70/100, comprimento de onda de excitação: 488 nm, alcance da pilha z: 30 μm e distância entre pilhas Z: 1,2 μm, duração: 17 h, intervalo entre pontos de tempo: a cada 10 min.
  3. Se disponível, usando uma opção de várias posições, redefina as coordenadas XY das amostras e selecione um plano Z no meio de cada germarium, pois as pilhas z serão centralizadas nessa posição. Inicie a aquisição.
    NOTA: Como a largura normal de um germário é de 30 μm, cada pilha Z terá ~ 25-27 seções. Dependendo do confocal, pelo menos 25 germários podem ser fotografados dentro dos intervalos de 10 minutos. Normalmente, são usadas objetivas corrigidas por planapo de imersão em óleo de 40x/1,30 NA ou 63x/1,40 NA.
  4. Analise as imagens no tempo e no eixo Z para visualizar mudanças específicas na morfologia do espectrossomo usando o software Imaris ou ImageJ (Fiji12,13. Horários específicos em sua observação são exibidos (Figura 1B'). Para montar os filmes, selecione manualmente o melhor plano Z em cada ponto de tempo.

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Resultados

Com este protocolo expandido de imagem em tempo real, podemos registrar a mitose assimétrica das CSGs femininas dentro de seu nicho sem distúrbios biológicos aparentes. Para tanto, utilizamos germários que expressam ubiquitamente a proteína GFP::Par-1, a qual discrimina entre cinco morfologias distintas do espectrossomo ao longo do ciclo celular das CSGs: Redondo, Tampão, Barra, Fusão e Ponto de Exclamação (Figura 1B,C). Em uma descrição mais detalhada, observamos que o sina...

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Discussão

Aqui apresentamos um protocolo para monitorar o nicho GSC de Drosophila melanogaster por um período prolongado de tempo, até 16 h. A maioria dos protocolos para filmar processos biológicos de Drosophila ex vivo concentra-se em janelas de tempo mais curtas e vários exemplos podem ser encontrados para discos de asas imaginárias 15,16,17, gônadas embrionárias 18,19

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos a Acaimo González Reyes e María Olmedo López pelos comentários úteis sobre o manuscrito. Este estudo foi apoiado por PID2021-125480NB-I00 (H. S-G), "Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor" da Junta de Andalucía (J. G-M), "Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos" do VI e VII PPIT-Universidade de Sevilha (P. R-R) e "Contrato de Acesso de I+D+i" do VI PPIT-Universidade de Sevilha (P. R-R). Estendemos nossos agradecimentos à Company of Biologists Ltd por gentilmente fornecer os direitos de compartilhar imagens adaptadas da publicação original (doi: 10.1242 / DEV.199716).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de vidro de 9 poçosCorning 7220-85n/a
Cloreto de cálcio di-hidratadoSigma AldrichC3881CaCl2· 2H2O; Para preparar a solução de Ringer
Cell-TakCorning 354240Adesivo para células e tecidos usado para fixar células ou seções de tecido a muitos tipos de superfícies, incluindo plástico, vidro, metal, polímero FEP e materiais biológicos.
Fórceps Dumont #5 Pinça Finescience11252-20n/a
Dumont #55 Finescience11255-20Dimensões 0.05 mm x 0.02 mm e comprimento 11 cm
Soro Fetal BovinoGibco10500-064Qualificado, inativado pelo calor, aprovado pela UE, Origem na América do Sul 
Pratos de fundo de vidroMatTekP35GC-1.5-10-CPrato de 35 mm, Nº 1.5 Lamínula, Diâmetro do Vidro de 10 mm,  HEPES Revestido com Poli-D-Lisina
Sigma AldrichH4034Para preparar a solução de Ringer
Cloreto de magnésio Sigma AldrichM1028MgCl2; Para preparar a solução de Ringer
Porta-agulhasRoboz RS-6061Peso leve, cabo oco de aço inoxidável; 4 3/4" de comprimento.
Binóculo Nikon SMZ18 Nikonhttps://www.microscope.
healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18
Penicilina-EstreptomicinaThermo Fisher Scientific1514012210.000 U/mL
Cloreto de potássioSigma AldrichP3911KCl; Para preparar a solução de Ringer
, o Drosophila Medium da SchneiderBiowest L0207Meio de cultura de células para células de insetos
Bicarbonato de sódioSigma AldrichS8875 NaHCO3; ≥ 99,5%, cloreto de
sódioSigma AldrichS9888NaCl; Para preparar a solução de Ringer
SacaroseSigma AldrichS9378≥ 99,5% (GC); Para preparar a solução de Ringer
Agulha de Dissecção de TungstênioRoboz RS-60640,25 mm, Ultra Fino, Ponta de 1 Mícron (Pk 10)
Tween 20Sigma AldrichP9416para biologia molecular, líquido viscoso
Levedura em póSigma Aldrich51475n/a
em pó

Referências

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