Apesar dos esforços consideráveis para tratar feridas crônicas, o sucesso tem sido limitado. Os processos celulares e moleculares que interrompem a cicatrização normal e contribuem para a iniciação e desenvolvimento de feridas crônicas não são bem compreendidos. Como resultado, o desenvolvimento de tratamentos eficazes para essas feridas tem se mostrado um desafio. Isso se deve principalmente à falta de modelos animais que imitam feridas crônicas em humanos e porque a experimentação em humanos com feridas crônicas é limitada. Anteriormente, publicamos um modelo de camundongo para estudar feridas crônicas que compartilham muitas características com feridas crônicas diabéticas em humanos. Este modelo inclui a presença de biofilmes formados naturalmente a partir de bactérias encontradas na microbiota da pele e no meio ambiente, sem a necessidade de introduzir bactérias externas nas feridas. Portanto, esse modelo pode potencialmente avançar na compreensão fundamental de como as feridas se tornam crônicas. Aqui, apresentamos uma atualização do protocolo original para o desenvolvimento deste modelo de mouse. Nós nos concentramos em diminuir a mortalidade de camundongos de ~ 30% para ~ 5%. Também descrevemos como esse modelo tem sido usado para entender o início e a progressão da cronicidade da ferida usando abordagens transcriptômicas de última geração, elucidando a dinâmica da população bacteriana durante a infecção e o desenvolvimento do biofilme e demonstrando o valor de testar a eficácia dos tratamentos, incluindo pequenas moléculas. Até agora, este é o único modelo de ferida crônica que não cicatriza sem intervenção.
Artigo de método
Protocolo para Criar Feridas Crônicas em Camundongos Diabéticos - uma Atualização do Protocolo Publicado
Neste artigo
Resumo
Introdução
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Protocolo
ATUALIZAÇÕES:
Esta é uma atualização do protocolo apresentado anteriormente1
Todos os experimentos foram concluídos de acordo e em conformidade com os regulamentos federais e a política e os procedimentos da Universidade da Califórnia foram aprovados pela Universidade da Califórnia, Riverside IACUC.
1. Animais
Adicione a seguinte Nota à Etapa 1.1:
NOTA: Se camundongos diabéticos homozigotos forem comprados diretamente de fornecedores, aloje os camundongos em um biotério convencional para permitir a colonização da pele com flora normal da pele. Podem ser usados machos e fêmeas.
Adicione a seguinte seção após a Etapa 1.3:
1.4.Realizar genotipagem
NOTA: Realize a genotipagem após a criação do animal conforme descrito anteriormente até a etapa 1.31. O protocolo a seguir foi modificado a partir de um procedimento publicado anteriormente2. Camundongos machos e fêmeas podem ser genotipados em 14-21 dias durante o desmame.
1.4.1. Extracção de ADN bruto
1.4.1.1. Colete a biópsia por punção de orelha do camundongo e coloque a amostra de tecido em um tubo de microcentrífuga.
1.4.1.2. Adicionar 180 μl de NaOH a 50 mM, garantindo que a amostra está submersa.
1.4.1.3. Incubar a amostra a 95 °C durante 10 min, despressurizando e agitando o tubo de 5 em 5 min.
1.4.1.4. Arrefecer a amostra em gelo durante, pelo menos, 1 min.
1.4.1.5. Adicionar 20 μL de Tris HCl 1 M a pH 8,0 e vórtice.
1.4.1.6. Armazenar as amostras a -20 °C até à utilização.
1.4.2. Reação em cadeia da polimerase
1.4.2.1 Monte a seguinte mistura de primer em um tubo de microcentrífuga (Tabela de Primers).
NOTA: Os primers amplificam a região ao redor da mutação pontual de LepR.
1.4.2.2. Estabelecer 20 μl de reacções em cadeia da polimerase em tubos de PCR. Adicione 10 μL de mistura principal de 2x Taq polimerase (que contém Taq DNA polimerase, dNTPs, MgCl2 e KCI), 1 μL de mistura de primers (ver Tabela de Primers), 4 μL de extrato de DNA bruto e 5 μL de H2O.
1.4.2.3. Definir os parâmetros de termociclagem do seguinte modo: 94 °C durante 2 min; 40 ciclos de 97 °C por 30 s, 52 °C por 45 s e 72 °C por 45 s; seguido por 72 °C por 2 min e 10 °C para retenção infinita.
1.4.2.4. Após a conclusão da PCR, adicione 4 μL de 6x DNA Loading Dye aos produtos de PCR e separe em um gel de agarose a 2% (Figura 1).
NOTA: Cada reação de PCR gera 3 produtos de PCR: produto comum de 610 pb, produto do alelo T mutante de 406 pb e alelo G do tipo selvagem de 264 pb. O genótipo selvagem consiste nos produtos de 610 pb e 264 pb, o genótipo heterozigoto consiste em todos os três produtos e o genótipo db / db consiste nos produtos de 610 pb e 406 pb.
2. Biotério e criação
Substitua a Etapa 2.1 pela etapa a seguir e pela nota:
2.1 Alojar camundongos db/db em um biotério convencional (não uma barreira/instalação livre de patógenos específicos) para que uma microflora possa se estabelecer na pele de camundongos db/db . Para modelar especificamente humanos que sofrem de feridas crônicas, não tome precauções especiais para evitar a exposição a patógenos naturais encontrados no ambiente de camundongos, pois os patógenos essenciais do estudo podem ser perdidos com condições mais rígidas de limpeza do viveiro.
NOTA: Como esses camundongos são muito grandes e diabéticos, é melhor abrigar até 3 camundongos db/db por gaiola antes de usá-los para experimentos com feridas crônicas.
3. Requisitos para o desenvolvimento de feridas crônicas
Adicione a seguinte etapa após a Etapa 3.2
3.3. Mantenha a ferida coberta com penso de película transparente em todos os momentos para evitar a secagem do tecido da ferida.
5. Configuração do reagente
Adicione a seguinte nota após 5.2
NOTA: Use apenas ATZ da empresa listada na Tabela de Materiais. A ATZ de outras empresas não é compatível com esse modelo e aumentará a mortalidade.
6. Cirurgia
6.1. Tratamento e anestesia
NOTA: Um regime de anestesia atualizado é descrito abaixo.
6.1.5. Em um sistema aberto, administre isoflurano a 5% administrado com O2 ao camundongo a uma taxa de fluxo (2-3,5 L / min) para induzir a anestesia. Monitore continuamente o status do mouse.
NOTA: Quando o mouse estiver inconsciente ou não estiver mais se movendo, coloque-o em uma almofada cirúrgica branca e encaixe a cabeça com um cone de nariz preso ao vaporizador para permitir a administração contínua de isoflurano durante a cirurgia.
6.1.6. Em sistema aberto, administrar isoflurano a 1% na mesma vazão durante a cirurgia e ajustar o fluxo de isoflurano para manter a profundidade da anestesia.
6.3. Ferimentos
6.3.5. Interromper a administração de isoflurano a 1% ao camundongo no final do procedimento.
7. Tratamento pós-operatório e recuperação
Substitua a Etapa 7.1 no protocolo original pela seguinte etapa e observe:
7.1. Após a aplicação do curativo de filme transparente logo após a cirurgia, usando uma seringa de insulina, deposite MSA topicamente na parte superior da ferida criada no dorso do camundongo, penetrando no curativo de filme transparente com a agulha. Use 150 mg / kg de MSA em solução estéril de PBS dentro de 10 minutos após a cirurgia. Essa concentração foi determinada após extensa pesquisa bibliográfica, conforme explicado anteriormente 3,4.
NOTA: A MSA tende a precipitar se não for constantemente agitada. Certifique-se de que o MSA esteja completamente dissolvido na solução antes de aplicá-lo na ferida para administrar a dose calculada ao camundongo.
Substitua a etapa 7.4 no protocolo original pela seguinte etapa:
7.4. Administrar a segunda dose de Buprenex 6 h após a cirurgia. Em seguida, dose os camundongos periodicamente de acordo com as regras locais da IACUC nas primeiras 48 h.
NOTA: Não é recomendado o uso de formulações de liberação prolongada de analgésicos que devem ser administrados por via subcutânea neste modelo de camundongo. A buprenorfina ligada a lipídios pode ser suspensa no óleo de triglicerídeos de ácidos graxos de cadeia média (MCT). Embora o efeito do óleo MCT tenha sido testado em camundongos db / db muito jovens, os efeitos do MCT em camundongos db / db obesos mais velhos ou geriátricos não foram testados 5,6. Dado o peso dos camundongos, grandes volumes de analgésicos injetados por via subcutânea perto da ferida podem afetar significativamente os processos celulares e moleculares de cicatrização de feridas e iniciação e desenvolvimento crônico de feridas. Além disso, este analgésico se dissolverá nos altos níveis de gordura nesses camundongos e, portanto, pode não ser eficaz para matar a dor e pode se tornar tóxico.
8. Coleta de dados, manuseio dos camundongos após ferimentos, estratégias de sobrevivência e dicas adicionais
8.1 Coleta de dados
Adicione as etapas a seguir após a Etapa 8.1.3.
8.1.4. Assegurar que o tecido colhido para análise deve incluir apenas tecido que esteja a 2 mm de distância da margem da ferida, tanto em feridas de controlo como em feridas crónicas. As feridas podem ser coletadas por excisão em até 1-2 h após a aplicação de MSA.
8.1.5. Recolher o excesso de líquido acumulado na ferida, ou exsudado da ferida, com uma seringa estéril, perfurando o penso transparente. Conservar a -20 °C para estudos bacterianos ou a -80 °C para estudos químicos e moleculares.
8.1.6 Para coletar tecidos inteiros da ferida, incluindo biofilme, após 10 dias, aplique 4% de PFA em PBS na ferida, topicamente por 10 min antes de excisar com fórceps e tesoura. Ao remover o tecido, adicione uma margem adicional de 5 a 10 mm para que o tecido da ferida seja suportado com tecido normal adicional. Continue a fixação em PFA a 4% em PBS e lavagens subsequentes e preparação para incorporação.
NOTA: Feridas crônicas 10 dias após a cirurgia podem se tornar muito frágeis para serem coletadas para histologia.
8.5. Estratégias de sobrevivência
8.5.1. Forneça suporte extra de hidratação: Verifique se os camundongos ficam letárgicos e não comem ou bebem ativamente porque a cirurgia e a geração de cronicidade são estressantes. Administre solução salina morna (35-38 ° C) por via subcutânea ou intraperitoneal a um volume de 0,25 mL por 10 g de peso corporal durante as primeiras 48-72 h após a cirurgia. O suporte de hidratação pode ser necessário até 2-3 vezes ao dia, dependendo de quão letárgicos os ratos são. Além disso, pellets de comida e géis de água podem ser colocados na cama para facilitar o acesso, embora possam ser necessárias trocas de gaiola mais frequentes.
8.5.2. Fornecer suporte extra de calor: A sobrevivência pós-cirurgia é significativamente aumentada se os camundongos forem colocados em gaiolas em uma almofada aquecida por água circulante (93 oC) imediatamente após a cirurgia e quando no viveiro. Coloque a gaiola 1/2 e 1/2 fora da almofada para permitir que o animal se afaste do calor se ficar muito quente e se mova em cima da almofada se ficar frio.
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Resultados
Figura 1: Genotipagem para identificação de heterozigotos para criação de melhoristas. Um exemplo de gel mostra os resultados de 8 amostras de camundongos desconhecidas. As amostras 2 e 5 são heterozigotos, pois contêm 3 bandas (610 pb, 406 pb e 264 pb). As amostras 1, 3, 4, 6, 7 e 8 são tipos selvagens, pois contêm apenas 2 bandas (610 pb e 264 pb).
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Discussão
Achados usando este modelo de feridas crônicas:
Este modelo tem sido utilizado para realizar vários estudos na tentativa de compreender os mecanismos celulares e moleculares de iniciação e progressão da ferida crônica. Foi demonstrado que, ao inibir as enzimas antioxidantes, feridas crônicas podem ser criadas nos camundongos db / db. As feridas inicialmente continham uma comunidade polimicrobiana que, com o tempo, foi selecionada par...
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Punção de orelha de 1 mm | Fisherbrand | 13812201 | Diâmetro do orifício de 2 mm |
| 3-Amino-1,2,4-triazol (ATZ) | TCI | A0432 | |
| 70% etanol | |||
| Acu Punch Punção de biópsia de pele de 7 mm | Acuderm Inc. | Agarose P750 | |
| B6. BKS(D)-Leprdb/J | O Laboratório Jackson | 00697 | Homozigotos e heterozigotos disponíveis |
| Buprenex (buprenorfina HCl) | Henry Stein Animal Health | 059122 | 0,3 mg/ml, Classe 3 |
| Gel Loading Dye, Roxo (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Luvas | |||
| Loção Removedora de Pêlos com Aloe Calmante e Lanolina | Nair | um depilatório químico | |
| Terapia de Calor (água) Bomba HTP-1500 | Adroit MedicalSystems | ||
| Almofada de Aquecimento | Conair | Almofada de Aquecimento Úmida e Seca | |
| Adaptadores de Mangueira | Seringas de insulina Adroit MedicalSystems | ||
| BD | 329461 | 0,35 mm (28G) x 12,7 mm (1/2") | |
| Isoflurano | Henry Schein Animal Health | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
| Vaporizador de isoflurano | JA Baulch & Associados | ||
| Manta Kimwipes | |||
| Maxi-Therm Hyper-Hypothermia | Cincinnati Sub-Zero | Cat No. 247 22 | " 30 x " Almofada HeavyDuty Reutilizável |
| Ácido merpantossuccínico (MSA) | Aldrich | 88460 | |
| Cone | |||
| O tanque de oxigênio | deve ser compatível com o sistema de vaporização | ||
| Solução tampão fosfato (PBS) | autoclave esterilizada | ||
| Tesoura | |||
| pequenos recipientes de plástico | |||
| Hidróxido de sódio | |||
| Taq 2X Master Mix | New England Biolabs | M0270L | |
| Tegaderm | 3M | Ref: 1624W | Curativo de filme transparente (6 cm x 7 cm) |
| Espátula | |||
| Tri-HCl | |||
| de | |||
| cortar cabelo | Wahl Wahl | Lithium Ion Pro |
Referências
- Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. J Vis Exp. (151), e57656(2019).
- He, J. -F., Tan, T., Zhu, H. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacol Sin. 39 (1), 117-123 (2018).
- Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. J Diabetes Res. 2014 (562625), (2014).
- Kim, J., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nat Protoc Exch. , (2016).
- Martínez-Carrillo, B. E., et al. Changes in metabolic regulation and the microbiota composition after supplementation with different fatty acids in db/db mice. Int J Food Sci. , (2022).
- Zhang, Y., et al. Medium-chain triglyceride activated brown adipose tissue and induced reduction of fat mass in C57BL/6J mice fed high-fat diet. Biomed Environ Sci. 28 (2), 97-104 (2015).
- Basu, P., Kim, J. H., Saeed, S., Martins-Green, M. Using systems biology approaches to identify signalling pathways activated during chronic wound initiation. Wound Repair Regen. 29 (6), 881-898 (2021).
- Basu, P., Martins-Green, M. Signaling pathways associated with chronic wound progression: a systems biology approach. Antioxidants. 11 (8), 1506(2022).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS and skin microbiome are critical for initiation and development of chronic wounds in diabetic mice. Sci Rep. 9 (1), 19318(2019).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS create a microenvironment that significantly decreases the diversity of the microbiota in diabetic chronic wounds and promotes biofilm formation. Front Cell Infect Microbiol. 10 (259), (2020).
- Kim, J. H., et al. Pseudomonas aeruginosa activates quorum sensing, antioxidant enzymes and type VI secretion in response to OS to initiate biofilm formation and wound chronicity. Antioxidants. 13 (6), 655(2024).
- Kim, J. H., et al. Skin microbiota and its role in health and disease with an emphasis on wound healing and chronic wound development. , Elsevier eBooks. 297-311 (2022).
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- Jabbari, P., et al. Chronic wound initiation: single-cell RNAseq of cutaneous wound tissue during initiation of chronic wound development. Antioxidants. 14 (2), 214(2025).
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