Uma plataforma de matriz de múltiplos eletrodos para modelagem de epilepsia usando conjuntos cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes humanas

Summary

Este protocolo visa colocar de forma estável assembleias dorsais-ventrais fundidas em matrizes de múltiplos eletrodos para modelagem de epilepsia in vitro.

Abstract

Os organoides do cérebro humano são estruturas tridimensionais (3D) derivadas de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) que recapitulam aspectos do desenvolvimento do cérebro fetal. A fusão de organoides cerebrais dorsais com ventrais especificados regionalmente in vitro gera assembleides, que possuem microcircuitos funcionalmente integrados com neurônios excitatórios e inibitórios. Devido à sua complexidade estrutural e população diversificada de neurônios, os assemblóides tornaram-se uma ferramenta in vitro útil para estudar a atividade de redes aberrantes. Os registros de matriz de múltiplos eletrodos (MEA) servem como um método para capturar potenciais de campo elétrico, picos e dinâmica de rede longitudinal de uma população de neurônios sem comprometer a integridade da membrana celular. No entanto, a adesão de assemblóides aos eletrodos para gravações de longo prazo pode ser um desafio devido ao seu grande tamanho e área de superfície de contato limitada com os eletrodos. Aqui, demonstramos um método para colocar assemblóides em placas MEA para registrar a atividade eletrofisiológica durante um período de 2 meses. Embora o protocolo atual utilize organoides corticais humanos, ele pode ser amplamente adaptado a organoides diferenciados para modelar outras regiões do cérebro. Este protocolo estabelece um ensaio eletrofisiológico longitudinal robusto para estudar o desenvolvimento de uma rede neuronal, e esta plataforma tem potencial para ser usada na triagem de drogas para o desenvolvimento terapêutico na epilepsia.

Introduction

Os organoides cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) são estruturas 3D espacialmente auto-organizadas que espelham a arquitetura do tecido e as trajetórias de desenvolvimento in vivo. Eles são compostos por vários tipos de células, incluindo progenitores (células neuroepiteliais, glia radial, progenitores neuronais, progenitores gliais), neurônios (neurônios excitatórios corticais e interneurônios inibitórios) e células gliais (astrócitos e oligodendrócitos)^1,2. Os assemblóides representam a próxima geração de organoides cerebrais, capazes de integrar várias regiões cerebrais e/ou linhagens celulares em uma cultura 3D. Eles fornecem uma ferramenta útil para modelar conexões entre várias regiões do cérebro semelhantes às contrapartes in vivo, capturando interações entre neurônios e astrócitos para melhor imitar redes neurais maduras e complexas e para estudar a montagem de circuitos neurais. Portanto, os assemblóides estão se tornando uma ferramenta amplamente utilizada para recapitular as características da fisiopatologia da epilepsia, na qual medidas funcionais são necessárias para interrogar redes neurais aberrantes que podem estar subjacentes à causa da doença 3,4,5,6.

Para modelar as interações entre neurônios glutamatérgicos corticais e interneurônios GABAérgicos, vários grupos desenvolveram organoides separados semelhantes ao cérebro dorsal e ventral e, em seguida, os fundiram em um assembloide multirregional 7,8,9,10. Aqui, um protocolo de cultura de assembloides descrito anteriormente com subtipos neurais regionalmente específicos^{foi aplicado 9}. No entanto, uma barreira significativa é a falta de ensaios funcionais reprodutíveis para monitorar a atividade da rede neural durante o neurodesenvolvimento. Muitos testes funcionais das redes em organoides produzem resultados que apresentam alta variabilidade entre lotes de diferenciações e linhagens celulares. Técnicas que envolvem fatiar ou dissociar organoides alteram suas redes inerentes cortando a conectividade sináptica⁸.

Os arranjos de múltiplos eletrodos (MEA) fornecem uma visão em larga escala da atividade da rede ao longo do tempo com alta resolução temporal para caracterizar as propriedades eletrofisiológicas dos organoides sem interromper as condições de cultura ou a integridade da membrana celular¹¹. Em comparação com a eletrofisiologia do patch clamp, o MEA permite a aquisição de dados de alto rendimento com base em grandes populações de neurônios, em vez de células únicas. As plataformas MEA variam em sua densidade de eletrodos, atendendo a diferentes necessidades na pesquisa de organoides cerebrais¹². Os sistemas amplamente utilizados, como mostrado neste protocolo, registram de 8 a 64 eletrodos por poço 13,14,15. MEAs de alta densidade com até 26.400 eletrodos por poço permitem maior resolução espacial e temporal, quantificação da velocidade de propagação do potencial de ação e combinação com estimulação optogenética 14,16,17. Portanto, o MEA serve como uma ferramenta poderosa para modelar a epilepsia in vitro e um paradigma translacional para a triagem de medicamentos anticonvulsivantes.

Um grande desafio é estabilizar os conjuntos de grande porte em uma superfície metálica hidrofóbica para gravações de longo prazo. Este protocolo descreve uma metodologia detalhada para plaquear assénios intactos em placas MEA para registro longitudinal de longo prazo junto com ensaios farmacológicos. As vantagens exclusivas do protocolo incluem a fixação estável de assemblóides à superfície do eletrodo sem perder a atividade elétrica, o uso de meios basais neurofisiológicos disponíveis comercialmente para acelerar a maturação da rede funcional após o plaqueamento, a viabilidade de conduzir ensaios funcionais a jusante, como tratamento medicamentoso, e ampla aplicação a organoides gerados com outros protocolos específicos da região.

O objetivo é fornecer um ensaio funcional com alta resolução temporal para investigar a atividade da rede, examinar alterações específicas da doença e testar drogas com potencial terapêutico na epilepsia. Instruções em vídeo são fornecidas para as etapas mais desafiadoras deste protocolo, mostrando as técnicas de plaqueamento de assembleias em placas MEA, bem como gravações representativas dessas culturas.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais demonstrados abaixo foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas do Conselho de Revisão Institucional da Faculdade de Medicina da Universidade de Michigan e do Comitê de Supervisão de Pesquisa com Células-Tronco Pluripotentes Humanas. As linhagens iPSC usadas neste protocolo e os experimentos representativos foram derivados de fibroblastos de prepúcio humano obtidos de uma fonte comercial. Os detalhes das linhagens celulares, reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Derivação de organoides cerebrais específicos do destino de iPSCs

NOTA: Este protocolo contém informações para preparar 3 poços na placa de cultura de micropoços a partir de 5 poços confluentes (~85%) de uma placa de 6 poços. O protocolo de manutenção do iPSC varia de acordo com as linhagens celulares.

1. Preparar cada meio de cultura celular utilizando a composição descrita no quadro 1. Conservar protegido da luz a 4 °C até 2 semanas.
2. Enxágue todos os poços a serem usados na placa de cultura de micropoços com 1 mL de DMEM/F-12 uma vez. Adicione 1 mL / poço mTeSR plus + 50 μM Y-27632 e gire a placa a 2000 x g por 5 min em temperatura ambiente para remover bolhas de ar dos micropoços. Armazenar a placa numa incubadora a 37 °C 5% CO₂ .
3. Limpe as regiões de iPSCs diferenciadas com uma ponta de pipeta P10 estéril sob o microscópio em uma bancada limpa de fluxo laminar. Lave os detritos celulares da monocamada com 1 mL / poço PBS sem cálcio ou magnésio.
4. Dissocie a monocamada em células individuais adicionando 1 mL / poço de reagente de dissociação celular pré-aquecido e colocando a placa em uma incubadora de CO₂ a 37 ° C a 5% por 4-7 min (dependendo das características e confluência das linhagens celulares) até que a maioria das células decole, com agitação suave a cada 2-3 min.
5. Adicione 4 mL de DMEM/F-12 a cada poço para diluir o reagente de dissociação celular e triture moderadamente com uma pipeta sorológica de 10 mL. Colete a suspensão celular de todos os poços da mesma linha em um tubo cônico de 50 mL.
6. Gire a 200 x g por 4 min em temperatura ambiente, aspire o sobrenadante usando uma pipeta sorológica de 10 mL e ressuspenda as células em 2 mL de mTeSR mais + 50 μM Y-27632. Retire a suspensão de células de 10 μL, misture 1:1 (v/v) com azul de tripano e conte as células com um contador de células automatizado.
7. Placa 3 x 10⁶ células vivas por poço, 3 poços por linha. Adicione mTeSR plus + 50 μM Y-27632 conforme necessário para trazer o volume total para 2 mL / poço. Gire a placa a 100 x g por 3 min em temperatura ambiente e coloque-a de volta na incubadora.
   NOTA: A placa de cultura de micropoços usada aqui contém 300 micropoços por poço, portanto, o revestimento de 3 x 10⁶ células resulta em 10.000 células/micropoço.
8. No dia seguinte, execute uma troca de meio volume removendo suavemente 1 mL de mídia e adicionando lentamente 1 mL de mTeSR mais mídia (sem Y-27632) com uma ponta de pipeta P1000. Mantenha a ponta perto da superfície do meio e aspire o mais lentamente possível, para não perturbar as células agregantes na parte inferior.
9. Verifique em um microscópio invertido um dia após a troca do meio e um contorno claro de cada agregado pode ser visto. Remova a mídia original de cada poço com pontas de pipeta P1000.
10. Pulverize moderadamente 0,5 mL de meio de indução neural (NIM) com dorsomorfina (DM) e SB-4321542 (SB) em cada poço com pontas P1000 cortadas estéreis. Pipetar imediatamente os agregados suspensos no meio e transferi-los para uma placa de cultura suspensa estéril de 10 cm. Repita até que todos os agregados sejam transferidos. NÃO triturar.
11. Adicione NIM + SB / DM adicionais conforme necessário para trazer o volume total para 10 mL / prato. Colocar a placa num agitador orbital numa incubadora a 37 °C 5% CO₂ para evitar a fusão espontânea dos agregados. Marque a data de transferência como Dia 0 da cultura organoide.
12. Do dia 1 até o final, siga a receita de mídia na Tabela 1 e a linha do tempo de alteração de mídia⁹ na Figura 1. Notavelmente, os organoides são divididos em duas placas de cultura em suspensão designadas como "dorsal" e "ventral" no Dia 4.
    NOTA: Vários pontos de tempo importantes a serem lembrados: a expansão organoide começa no dia 6, quando a mídia é alterada para o meio de diferenciação neural (NDM) com EGF / FGF. A diferenciação neuronal é suportada a partir do dia 25 por NDM + BDNF / NT3, e os organoides são mantidos em NDM sem fatores de crescimento a partir do dia 46.

2. Rotulagem viral e geração de assemblóides

NOTA: A marcação viral ^7,9 é recomendada para reconhecer a identidade de cada organoide específico de cada região em um assembloide e atribuir atividade eletrofisiológica de eletrodos específicos a regiões assembloides. É ideal se apenas um único organoide for revestido para cada poço MEA. Este protocolo também pode ser aplicado ao revestimento de organoide único.

1. Calcule os volumes de estoque de vírus e meios de diluição a serem usados: 200 μL de meio com vírus são necessários para cada organoide a ser rotulado. Os organoides dorsais são marcados com pAAV1-CAG-tdTomato, normalmente em uma proporção de diluição de 1:1000 (v/v), ou aproximadamente 2 x 10¹⁰ vg/mL. Para organoides ventrais, 1:300 (v/v) ou 2 x 10¹¹ vg/mL pAAV1-mDLX-GFP vírus é usado.
   NOTA: As diluições devem ser tituladas para o efeito desejado e são afetadas pelo título viral.
2. Aquecer a quantidade adequada de meios a 37 °C. Descongele o estoque de vírus armazenado a -80 °C no gelo. Rotule placas de 48 poços suficientes para acomodar todos os organoides rotulados.
3. Coloque um copo contendo 10% de água sanitária no capô. Expulsar para o copo todos os materiais em contacto com vírus. Diluir os vírus totalmente descongelados em meios de cultura em tubos cônicos separados de 15 mL, rotulados como "dorsal" e "ventral".
4. Mova os organoides do Dia 56 de placas de cultura para placas de 48 poços. Recomenda-se um organoide por alvéolo para evitar a fusão espontânea em cultura estática. Remova o máximo possível de meios de cultura residuais.
5. Adicione 200 μL de mistura de vírus e meio a cada poço, respectivamente. Colocar as placas de volta na incubadora de CO₃₇ °C 5% 2. Incline as placas em uma placa vazia estéril para ajudar a concentrar as partículas virais no fundo do poço e otimizar a eficiência da transdução.
   NOTA: As partículas virais tendem a afundar no fundo do tubo cônico de 15 mL, portanto, inverter frequentemente o tubo para misturar vírus com meios antes de adicioná-los a cada poço é muito importante para garantir uma eficiência de transdução uniforme para todos os organoides.
6. No dia seguinte (dia 57), adicione mais 800 μL de meio de cultura a cada poço para trazer o volume total para 1 mL / poço.
7. Três dias depois (dia 60), faça uma troca completa de mídia nos organoides marcados. Alvejar todos os materiais em contato com partículas virais.
8. Três dias depois (dia 63), verifique a expressão de fluorescência em um microscópio invertido de epifluorescência. Se o sinal for forte, comece a gerar assemblóides (consulte a etapa 2.9).
9. Enxágue todos os organoides marcados com 1 mL / poço de PBS duas vezes para evitar a contaminação cruzada por partículas virais remanescentes durante a fusão do organoide. Use uma ponta de pipeta P1000 cortada para transferir um organoide ventral para cada poço dorsal (ou vice-versa) e rotule novamente a placa assembloide de acordo. Incline as placas como na etapa 2.5 para melhor fusão.
10. Execute cuidadosamente uma troca de meio volume 3 dias após o procedimento de fusão (Dia 66) sem interromper os conjuntos. Geralmente, leva cerca de uma semana para formar assembleide estável (dia 70).

3. Colocação de assemblóides em placas MEA pré-tratadas

NOTA: Leva pelo menos 4 dias para concluir os procedimentos de preparação da superfície das placas MEA antes de revestir os conjuntos. Para economizar tempo, a fusão de organoides dorsais e ventrais (ou seja, etapa 2.9) e o pré-tratamento MEA podem ser realizados em paralelo.

1. Prepare reagentes para pré-tratamento e revestimento de superfície.
   1. Para preparar a solução detergente/enzimática a 1%, dissolva 0,5 g de enzima/detergente em pó em 50 mL de água deionizada. Vortex completamente até que o pó esteja totalmente dissolvido. Esterilize a solução com um filtro de vácuo superior de tubo estéril no gabinete de biossegurança antes de adicioná-la aos poços MEA. Faça fresco antes de cada uso.
      NOTA: O detergente/enzima esteriliza a superfície do MEA, remove quaisquer óleos residuais do processo de fabricação do MEA e garante que a superfície seja hidrofílica o suficiente para promover interações com o composto hidrofílico polietilenoimina (PEI)¹⁸.
   2. Para preparar uma solução de PEI a 0,07%¹⁹, comece fazendo uma solução estoque de PEI a 7% misturando 1 mL de solução de PEI a 50% em um tubo cônico de 15 mL com 6 mL de tampão de borato 1x. Dilua 1 mL de solução estoque de PEI a 7% em 99 mL de tampão borato 1x para atingir a concentração final de trabalho. Para esterilização, filtre através de uma unidade de filtro de 0.22 μm no gabinete de biossegurança antes de usar.
      NOTA: O PEI, um polímero carregado positivamente, é usado no processo de revestimento primário para facilitar a fixação de um revestimento secundário carregado negativamente com a Matriz de Membrana Basal (BMM) e os assemblóides²⁰. Retire 1 mL de PEI a 50% despejando em vez de pipetar no tubo cônico, pois a solução estoque é muito viscosa. A quantidade necessária pode ser medida mais facilmente pesando-a em um tubo cônico, e a solução de PEI a 50% tem uma densidade de 1,08 g/mL. A solução de PEI a 7% pode ser armazenada em alíquotas de 1 mL a -20 °C por até um mês. Execute todas as etapas subsequentes no gabinete de biossegurança.
2. Em consideração ao tamanho de cada conjunto, placas MEA de 6 poços com 64 eletrodos por poço são usadas para acomodar um conjunto por poço. Calcule o número de placas MEA necessárias para os experimentos para garantir réplicas biológicas suficientes.
3. Adicione 1 mL de solução detergente/enzimática a 1% a cada poço de uma placa MEA estéril. Tenha cuidado para não danificar os eletrodos com a ponta da pipeta. Se estiver usando um aspirador a vácuo para lavagens, não permita que a ponta toque no feixe de eletrodos. Incubar numa incubadora a 37 °C durante 2 h.
4. Remova o detergente/enzima e lave cada poço cinco vezes com 1,5 mL de água deionizada estéril. Como o detergente/enzima não é biocompatível, é importante garantir que os produtos químicos restantes sejam completamente lavados.
5. Encha cada poço com 1 mL de meio de cultura para pré-condicionamento. Coloque as placas de volta na incubadora de 37 °C 5% CO₂ por 2 dias. A exposição da superfície MEA às condições de cultura de células promove a fixação celular.
6. Remova o meio de cultura e cubra os eletrodos MEA em cada poço com 50 μL de solução de PEI a 0,07% para revestimento primário. Incubar a 37 °C durante 1 h.
7. Aspirar completamente a solução de PEI. Lave cada poço com 1 mL de água deionizada estéril. Realize 3 lavagens rápidas no total. Seque as placas em temperatura ambiente por 15 min no armário de biossegurança com a tampa aberta.
8. Cobrir a área do eletrodo em cada poço com 50 μL de BMM 1:20 (v/v) diluído em meio de cultura para revestimento secundário. Volte a colocar as placas MEA na incubadora a 37 °C durante a noite. Adicione água estéril aos compartimentos ao redor dos poços para garantir umidade suficiente durante todo o revestimento.
9. No dia seguinte, aspire o BMM diluído com vácuo, deixando uma fina camada na superfície. Se uma camada espessa se formou, pulverize com força a área de contato do eletrodo com meio de cultura usando uma ponta de pipeta P1000. Lave quantas vezes forem necessárias para remover quaisquer pedaços grossos.
   NOTA: O BMM espesso residual pode interferir no contato do eletrodo com as células.
10. Colete um assembloide com uma ponta P1000 amplamente cortada e coloque-o em cima dos eletrodos em um poço enquanto transfere o mínimo de mídia possível.
11. Em uma capela de fluxo laminar sob um escopo de dissecação, empurre cuidadosamente o assembloide com uma agulha de dissecção estéril ou ponta P20 para o local desejado, onde os organoides dorsal e ventral podem ser cobertos principalmente por eletrodos. Use uma ponta P20 para remover o líquido ao redor do conjunto. Repita isso para todos os conjuntos ou um subconjunto, o que pode ser feito em alguns minutos.
    NOTA: Tente NÃO tocar ou arranhar a superfície MEA com a ponta da pipeta e/ou agulha. Tente NÃO cutucar ou rasgar o assembloide com pontas de pipeta. Termine o revestimento o mais rápido possível para evitar que o organoide seque completamente.
12. Incubar os assemblóides a 37 °C durante 10 min (sem meio). Transfira as placas da incubadora para uma capela de fluxo laminar e aplique 2-3 pequenas gotas de BMM 1:50 diluídas em meios de cultura no topo dos conjuntos sob um escopo de dissecação. Incubar a 37 °C por mais 30 min.
13. Adicione cuidadosamente 3 gotas de meios de cultura perto dos assemblóides sob um escopo de dissecação. Isso mantém os organoides hidratados. Incubar a 37 °C durante 1 h.
    NOTA: Se o assembloide se mover ou flutuar em qualquer etapa subsequente, o revestimento deve ser reiniciado a partir da etapa 3.11.
14. A cada hora, adicione cuidadosamente 20-50 μL de meio de cultura celular a cada poço sob um escopo de dissecação. Isso pode ser feito ao longo de um dia. O objetivo é atingir pelo menos 250 μL de volume total no final do dia.
15. No dia seguinte, verifique se todas as assembleias estão assentadas e estabilizadas sob o escopo de dissecação. Adicione 750 μL extras de meios de cultura para atingir um volume total de 1 mL/alvéolo. Deixe as placas intactas por pelo menos 2 dias.
16. Realize cuidadosamente as mudanças semanais de meio, retirando 500 μL de meio de cultura e adicionando 700 μL de meio basal neurofisiológico. O volume adicional de mídia adicionado é responsável pela evaporação e pode ser ajustado dependendo da quantidade de evaporação da placa MEA que está sendo usada. Adicione água estéril ao redor dos poços conforme necessário para minimizar a evaporação dos poços MEA.

4. Registro e análise de dados do MEA

1. Comece a registrar o MEA cerca de uma semana após a mudança para a mídia basal neurofisiológica (geralmente por volta do dia 78).
2. Aguarde até que a câmara de registro atinja a temperatura definida (geralmente 37 °C). Transfira uma placa para o dispositivo e deixe-a equilibrar por pelo menos 5 minutos antes da gravação.
3. Configurações dinâmicas de hardware
   1. Defina a frequência de amostragem, ou seja, a taxa na qual os dados brutos de tensão são registrados. A configuração padrão (12.5 kHz) é recomendada.
   2. Especifique o modo analógico (geralmente Neural Spikes, como neste caso) para configurar a largura de banda e o ganho de hardware para aplicativos específicos. Para monitoramento visual da atividade durante a gravação, use os módulos Spike Detector e Burst Detector .
      NOTA: As configurações analógicas afetam como o volume brutotage os dados são gravados e não podem ser alterados após o registro dos dados.
   3. (Opcional) Aplique um filtro digital de hardware aos dados de gravação. As opções de filtro passa-baixo incluem uma janela Kaiser de 2 kHz ou 3 kHz. As configurações padrão podem ser modificadas após selecionar as configurações analógicas.
   4. Defina como referenciando por mediana (padrão), o que é altamente recomendado para gravação neural, como neste caso. A referência melhora a qualidade dos sinais de baixa amplitude, reduzindo a interferência de ruído comum a grupos de canais.
      NOTA: Os parâmetros acima podem ser ajustados conforme necessário, dependendo da atividade observada nas assembléias, mas devem ser mantidos consistentes para todas as gravações em um determinado experimento.
4. Adicione mapas e descrições de placas (se necessário). Importe o mapa da placa da gravação anterior para a mesma placa para garantir a consistência e facilitar o processamento de dados em lote. Certifique-se de que os arquivos estejam nomeados corretamente.
5. Se os sinais parecerem bons (ruído e artefato mínimos), registre os dados brutos. Geralmente, 2-5 minutos de gravação são suficientes para uma amostra representativa.
6. Registre longitudinalmente a atividade elétrica uma ou duas vezes por semana, durante 5-15 min, dependendo do projeto experimental. Aguarde pelo menos 24 horas após cada troca de mídia antes de iniciar a próxima rodada de gravação, pois a atividade elétrica diminui imediatamente após cada troca de mídia.
7. (Opcional) Se a atividade elétrica precisar ser localizada e distinguida entre organoides dorsais e ventrais, ou se a atividade de cada eletrodo precisar ser analisada separadamente, obtenha uma imagem de cada assembloide sob campo claro e epifluorescência (Figura 2B) após cada registro.
8. Ao analisar os dados, aplique uma configuração de análise, incluindo um detector de pico/intermitência e um compilador de estatísticas. Use um limite adaptativo definido como 5,5-6 desvios padrão da linha de base para detecção de picos. Identifique rajadas como uma atividade com ≥5 picos em 100 ms¹³. Defina a atividade da rede quando mais de 25% do total de eletrodos ativos disparam em 100 ms com um mínimo de 50 picos por rajada de rede^13,14.
   NOTA: Esses parâmetros são modulados dependendo das características de disparo de um experimento específico. Para aumentar a sensibilidade para picos de baixa amplitude, o limiar adaptativo para detecção de picos pode ser reduzido. Para detecção de explosão, vários métodos podem ser usados e os parâmetros podem ser adaptados para detectar rajadas de picos que diferem significativamente da atividade em segundo plano. Os parâmetros de atividade da rede podem ser modulados para uma porcentagem menor de eletrodos, especialmente quando os conjuntos não cobrem todo o campo de eletrodos. Todos os parâmetros devem permanecer coerentes durante a duração de uma experiência, a fim de permitir comparações longitudinais.
9. Execute o módulo Compilador de Estatísticas para processamento em lote enquanto reproduz os dados gravados. Exporte métricas avançadas e/ou arquivos de saída de pico para análise avançada.
   NOTA: A saída de métricas avançadas contém .csv arquivo com médias de eletrodo, poço e grupo para disparo médio, ruptura e sincronia. A saída de pico (arquivo .spk) inclui traços de forma de onda para todos os picos, que podem ser importados para outras plataformas para análise avançada, por exemplo, classificação de pico.

5. Ensaio farmacológico de ponto final e reciclagem de placas

NOTA: Os ensaios de tratamento medicamentoso podem ser realizados após os assemblóides estarem maduros o suficiente e a atividade elétrica atingir o pico. O registro da atividade basal/pré-tratamento e da atividade pós-tratamento precisa ser realizado no mesmo dia.

1. Adicione 1-10 μL de solução do medicamento bem em cima do assembloide e gire suavemente a placa para garantir uma mistura uniforme. Recomenda-se um tempo de incubação mais longo em meios contendo medicamentos em alguns casos, por exemplo, ensaios de tratamento medicamentoso relacionados à sinapse com agonistas/antagonistas do receptor de glutamato / GABA (Figura 2E) (consulte a seção Resultados para obter detalhes).
   NOTA: Recomenda-se adicionar uma pequena quantidade de solução de medicamento a cada poço para atingir uma concentração final de trabalho, pois uma grande mudança de volume diminuirá temporariamente a atividade elétrica em geral. É importante garantir que a adição de um veículo no qual os medicamentos de interesse são dissolvidos não provoque alterações significativas nos parâmetros eletrofisiológicos.
2. Realize lavagens suficientes de PBS (normalmente 3) e lave os medicamentos após a gravação pós-tratamento. Realize um registro adicional no dia seguinte após a eliminação do medicamento para ver se a atividade elétrica retorna ao nível basal.
3. Opcionalmente, pipete com força os meios para separar os assemblóides da placa MEA no final das gravações para realizar outros experimentos, por exemplo, imagens ao vivo, fixação com paraformaldeído a 4% para imunocoloração de montagem total ou lise para extração de RNA ou proteína.
4. Para fins de análise, use pelo menos três réplicas técnicas e biológicas para cada condição. Expresse dados eletrofisiológicos como uma média de n ≥ 3 repetições.
5. Para reciclar a placa no final dos experimentos, aspire o meio restante após remover os conjuntos anexados. Lave uma vez com PBS estéril. Cubra totalmente a área metálica com 200 μL/poço de tripsina-EDTA a 0,25% e coloque a placa de volta em uma incubadora a 37 °C durante a noite.
6. No dia seguinte, aspire tripsina, lave duas vezes com etanol estéril a 70% e três vezes com água deionizada estéril.
7. Seque a placa ao ar no armário de biossegurança por 15 min com a tampa aberta ou até que esteja completamente seca. Feche a placa limpa em um saco plástico e guarde-a em temperatura ambiente até o uso futuro.
   NOTA: Uma placa MEA bem limpa pode ser reutilizada três vezes sem perder significativamente a qualidade da gravação.

Results

Os conjuntos dorsais-ventrais humanos foram plaqueados em uma placa MEA de 6 poços (n = 6 por diferenciação, 3 diferenciações), com cada poço contendo 64 eletrodos (Figura 2A). Nove em cada dez assemblóides planejados para registro longitudinal foram firmemente fixados aos eletrodos por mais de 50 dias in vitro (Figura 2D). 6 dos 8 assemblóides designados para ensaios farmacológicos foram resolvidos com sucesso através da fase de wash-out com atividade de rede apropriada ao estágio de desenvolvimento ( Figura 2E ). Imagens de contraste de fase e fluorescência de um poço representativo são mostradas (Figura 2B), nas quais os organoides dorsais marcados com AAV-CAG-tdTomato e AAV-mDLX-GFP são facilmente distinguidos ^7,9.

A atividade dos neurônios em um MEA pode ser analisada para avaliar a excitabilidade celular geral e a atividade da rede, por meio de uma variedade de parâmetros. As taxas gerais de disparo em toda a cultura fornecem informações sobre a excitabilidade celular e da rede, enquanto a frequência de rajadas sincronizadas em vários eletrodos indica o alcance de redes sinapticamente ativas de neurônios. Múltiplos picos repetidos ocorrendo em eletrodos espacialmente distintos durante um curto período de tempo (estouro de rede) podem servir como um correlato biológico para a atividade semelhante a convulsões, embora os assemblóides em MEAs permaneçam limitados em comparação com um organismo inteiro que pode ter convulsões de boa-fé . A Figura 2C ilustra os padrões de estouro de rede de assemblóides cultivados em meios neurofisiológicos basais disponíveis comercialmente nos dias 84 e 91, com aumento da duração do estouro no ponto de tempo posterior, provavelmente devido à maturação funcional dos neurônios. Nesse caso, a atividade celular e de rede aumenta gradualmente a partir do dia em que os assemblóides são plaqueados, geralmente atingindo o pico no dia 92 e quase desaparecendo no dia 125 (Figura 2D). O aumento da maturação no estágio posterior provavelmente contribui para a duração da explosão sincronizada estendida no ponto de tempo de gravação posterior.

A bicuculina, um antagonista do receptor_{GABA A} , aumenta a atividade da rede sincronizada dos conjuntos, conforme mostrado por taxas de disparo significativamente mais altas e frequências de explosão (rede) após a adição do medicamento no dia 108 ( Figura 2E ). Isso é semelhante ao que foi demonstrado anteriormente em registros de eletrofisiologia de células únicas²¹. Uma análise de poder para o ensaio farmacológico foi conduzida usando a base G * Power3 em um tamanho de efeito de 0,94 e um alfa de 0,05. Uma amostra total de 15 assembleides, com três grupos de tamanhos iguais de n = 5, foi necessária para atingir um poder de 0,8 (Figura 2E). Um controle do veículo é incluído para verificar se a resposta é um evento de sinalização verdadeiro e não apenas uma mudança na intensidade do sinal que pode surgir da adição de uma pequena quantidade de mídia (Figura 2E).

Figura 1: Visão geral do estudo. Protocolo para a geração e plaqueamento de conjuntos duplamente marcados na linha do tempo MEA do protocolo de diferenciação detalhando estágios críticos e suplementos de moléculas pequenas correspondentes (para obter informações adicionais sobre a composição, consulte a Tabela 1 e a Tabela de Materiais). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Registro de assembléias MEA. (A) Mapa de calor da atividade média de queima de uma única placa MEA (n = 6 poços) no dia 82, ou seja, pós-plating Todos os poços representam culturas da mesma condição e genótipo. (B) Imagens representativas de contraste de fase e confocais do assemblóide, com o assembloide dorsal marcado com vermelho e ventral com verde. As pontas das setas brancas indicam interneurônios GABAérgicos migrados do lado ventral para o dorsal. Barra de escala = 500 μm. (C) Gráficos raster representativos ao longo de 120 s de tempo de gravação de um único poço. As rajadas de rede são destacadas com uma caixa roxa. Dois pontos de tempo separados, Dia 78 (1 semana após o revestimento, dia inicial do registro) e Dia 92 (3 semanas após o revestimento, também quando a atividade atinge o pico), são demonstrados. (D) Quantificação das taxas médias de disparo, frequência de burst e frequência de bursting de rede do dia 78 ao dia 127 (n = 3 diferenciações, 3 assembleias / diferenciação). Cada curva indica um conjunto individual, compilado a partir de 3 diferenciações (codificadas por cores). A curva vermelha demonstra o valor médio. (E) Quantificação dos resultados do ensaio de bicuculina (n = 6 assemblóides/condição). O gráfico de barras foi exibido como média ± EPM. Cada ponto representa um conjunto, compilado a partir de 3 lotes de diferenciação (codificados por cores). Foi realizado um teste não paramétrico de Friedman. **p < 0,01; ns, não significativo. MEA, matrizes de vários eletrodos. O mapa de calor e os gráficos raster são gerados usando o software analítico Neural Metric Tool. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Componentes da mídia em vários estágios de diferenciação. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussion

Métodos baseados em MEA para registros eletrofisiológicos da atividade de rede em assembleias derivadas de iPSC têm sido usados para modelagem in vitro de epilepsia^22,23. Esta plataforma proposta integrando conexões sinápticas excitatórias e inibitórias tem o potencial de abordar mecanismos de hiperexcitabilidade neuronal e o papel dos interneurônios corticais no processo de epileptogênese. Além disso, esta plataforma permite a estabilização de assembleias e a coleta de dados eletrofisiológicos longitudinais por cerca de 50 dias in vitro, mesmo na presença de perturbações farmacológicas, fornecendo assim uma abordagem para testar compostos com potenciais alvos terapêuticos.

Estabilizar assembleias maduras e relativamente grandes em uma superfície hidrofóbica por um longo período in vitro tem sido tecnicamente desafiador. Para superar esse obstáculo, a estratégia de revestimento duplo é aplicada com produtos químicos carregados inversamente para facilitar a aderência de curto e longo prazo dos organoides à superfície do eletrodo. Este protocolo otimiza o método usado anteriormente²⁴ , trocando os reagentes de revestimento de placa de poli-L-ornitina (PLO)/laminina para PEI/BMM, obtendo uma fixação sólida com altas taxas de sucesso e baixa toxicidade. Além disso, esse sistema de cultura estabilizado de longo prazo tem o potencial de produzir dados de alto rendimento. Por exemplo, a pré-rotulagem com vírus duplos pode complementar a classificação de pico por eletrodos individuais para localizar e comparar a atividade de diferentes regiões. A plataforma proposta também fornece uma ferramenta estável para registrar potenciais de campo locais, que é altamente relevante para a função interneural sem interromper a estrutura intacta das assembleias²⁵. A principal limitação deste protocolo é que os assemblóides são achatados após o revestimento, o que levanta preocupações sobre se as estruturas 3D iniciais são preservadas ou não. O cultivo de organoides ao redor dos eletrodos usando plataformas MEA mais avançadas que envolvem um organoide com eletrodos²⁶ poderia potencialmente superar a limitação.

Um dos principais obstáculos dos métodos baseados em MEA para registro eletrofisiológico de organoides é a variabilidade e reprodutibilidade dos achados experimentais em protocolos de diferenciação e até mesmo em lotes de diferenciação. Estudos anteriores mostram que a atividade da rede de neurônios medida pelo MEA depende do estado de maturação neuronal dos organoides dorsais e ventrais²⁷. A gravação de assemblóides em um ponto de tempo posterior com neurônios e circuitos relativamente maduros é uma maneira de melhorar a consistência. Além disso, a escolha de sistemas MEA de vários poços que geram dados de alto rendimento permitirá comparações estatísticas à luz da variabilidade experimental. Se a atividade eletrofisiológica de uma cultura for inconsistente com o que é esperado em um determinado momento, a coleta da cultura intacta da plataforma funcional para medidas de controle de qualidade, incluindo análise imunocitoquímica e transcriptômica, será importante e útil.

O mais importante para a plataforma proposta é integrar funcionalmente neurônios corticais excitatórios especificados regionalmente no lado dorsal e interneurônios inibitórios no lado ventral. Os protocolos para a geração de organoides específicos da região cerebral encontrados na literatura diferem extensivamente em relação às condições do meio, ao tempo das culturas, ao rendimento e aos perfis de maturação, entre outros fatores²⁸. Embora este protocolo seja específico da eminência córtex e ganglionar em sua capacidade de gerar neurônios excitatórios e interneurônios GABAérgicos, técnicas de diferenciação bem estabelecidas podem ser usadas para gerar neurônios derivados de iPSC exibindo outras identidades, como neurônios motores²⁹ e células de Purkinje³⁰. Assim, a plataforma proposta tem o potencial de modelar circuitos neurais entre o córtex cerebral e a medula espinhal / cerebelo. Após alguma otimização relacionada ao tempo de plaqueamento e visualização dos tipos de células com marcação viral, esse método pode ser traduzido para outros modelos de doenças além da epilepsia, como a Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA)¹⁷.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pratos de cultura não tratados com TC Corning de 10 cm	Corning	08-772-32	Para cultura em suspensão no shaker
100 mL Beaker	Fisher Scientific	FB100100
100% Etanol	Fisher Scientific	BP28184-4L
2-Mercaptoetanol (β-ME)	Thermo Fisher	21985023	Concentração de trabalho 100 μ
Placa de cultura de células M de 48 poços	Fisher Scientific	50-202-140
Placa de cultura de células de 6 poços	Fisher Scientific	07-200-83
Aggrewell 800	Fisher Scientific	501974754
Allegra X-14R Centrífuga Refrigerada	Beckman Coulter	BE-AX14R
Allopregnanolone	Cayman	16930	Suspendeu 5mg em DMSO para obter solução estoque de 1 mM. Alíquota e congelamento em &menos; 80 ° C. Diluir a 1:10.000 para uso. Concentração de trabalho 100 nM.
Contador de células automatizado	Thermo Fisher	AMQAX2000
Axion CytoView MEA placas de 6 poços	Axion Biosystems	M384-tMEA-6B
Axion Maestro MEA plataforma Axion	Biosystems	Maestro	Com controle ambiental temporário
Suplemento B-27 (regular, com Vitamina A)	Suplemento Thermo Fisher	21985023
B-27 (sem Vitamina A)	Thermo Fisher	12587010
Matriz de membrana basal- Geltrex	Thermo Fisher	A1569601
Banho de contas	Fisher Scientific	10-876-001
Microscópio de bancada invertido	Isotemp Olympus	CKX53	Mantido em fluxo laminar limpo bancada
Bicuculline	Sigma-Aldrich	14340	Concentração de trabalho 10 μ M
Bleach	CLOROX	67619-26
Tampão de borato 20x	Thermo Fisher	28341	Concentração de trabalho em 1x
mídia BrainPhys	Reagente	StemCell Technologies 5790
(StemPro Accutase)	Thermo Fisher	A1110501
Celltron agitador orbital	HT-Infors	I69222
Detergente/enzima (Terg-A-Zyme)	Sigma-Aldrich	Z273287	Concentração de trabalho 1% m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamina	Thermo Fisher	113300
DMSO	Sigma-Aldrich	67685
Dorsomorfina	Sigma-Aldrich	P5499	Dissolva 5 mg em DMSO para obter uma solução estoque de 10 mM. Alíquota e congelamento em &menos; 20 °C. Diluir a 1:2000 para uso. (concentração de trabalho 5 μ M)
D-PBS sem cálcio ou magnésio	Thermo Fisher	14190144
Neurotrófico derivado de linha de células gliais (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolve 100 μ g em 1mL de PBS para 100 μ g/mL. Alíquota e congelamento em &menos; 20 ° C. Diluir a 1:5000 para uso. (concentração de trabalho 20 ng/mL).
Suplemento GlutaMAX	Thermo Fisher	35050061
Hemacitômetro	Eleição Microscopia Ciências	63510-20
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Heraguard ECO Clean Bench	Thermo Fisher	51029692
Incubadora de cultura de células com umidade controlada	Thermo Fisher	370	definido para 37 ° C, 5% CO2
IWP-2	Selleckchem	S7085	Alíquota e congelar em &menos; 80 ° C. Ele irá precipitar se descongelado à temperatura ambiente. As alíquotas congeladas devem ser colocadas diretamente em 37 ° C antes de usar.
Reposição de soro knockout (KOSR)	Thermo Fisher	10828010
mTeSRplus (meio + suplementos)	StemCell Technologies	100-0276	cGMP, meio estabilizado sem alimentador para células iPSC humanas
Suplemento N2	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal A	Thermo Fisher	21103049
Aminoácidos não essenciais (NEAA)	Thermo Fisher	11140050
NT3	Peprotech	450-03	Dissolver 100 μ g em 1mL de PBS para 100 μ g/mL. Alíquota e congelamento em &menos; 20 ° C. Diluir a 1:5000 para uso. (concentração de trabalho 20 ng/mL).
NuFF Fibroblastos de prepúcio neonatal humano	MTI-GlobalStem	GSC-3002
Parafilm	PARAFILM	P7793
Penicilina/Estreptomicina	Thermo Fisher	15140122
Pipeta (P10, P200, P1000)	Eppendorf	EP4926000034	Corte autoclavado P1000 pontas para coleta de organoides
Poli (Etilenoimina) (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Diluir o estoque em tampão de borato estéril. Concentração de trabalho 0,07%. Veja detalhes no manuscrito.
Fator de crescimento epidérmico humano recombinante (EGF)	R& D Systems	236-EG-200	Suspenso em PBS. Alíquota e congelar a -20 °C.
Fator de crescimento de fibroblastos humanos recombinantes (FGF) - básico	Peprotech	100-18B	Suspenso em PBS. Alíquota e congelar a -20 °C.
Fator neurotrófico recombinante derivado do cérebro humano (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrífuga brevemente antes da reconstituição. Dissolva 100 μ g em 1 mL de PBS para 100 μ g/mL. Alíquota e congelamento em &menos; 20 ° C. Diluir a 1:5000 para uso. (concentração de trabalho 20 ng/mL).
Ácido retinóico (RA)	Sigma-Aldrich	R2625	Dissolva 100 mg em 3,3 mL de DMSO para obter uma solução estoque de 100 mM. Alíquota do estoque 100 μ L/tubo e congelar em &menos; 80 ° C. Pegue 200 μ L de estoque de 100 mM e diluir 10x (adicionar 1,8 mL de DMSO) para fazer estoque de 10 mM. Alíquota 50 μ L/tubo e armazene em &menos; 80 °C. Diluir a 1:100.000 para uso. (concentração de trabalho 100 nM).
Inibidor de ROCK Y-27632	Tocris	1254	1:200 de estoque de 10 mM
SAG (agonista suavizado)	Selleckchem	S7779	Alíquota e congelamento em − 80 °C. Concentração de estoque 1mM. Use na diluição de 1:10.000 (concentração de trabalho 100 nM).
SB-431542	Tocris	1614	Dissolva 5 mg em 1,3 mL de DMSO para obter uma solução estoque de 10 mM. Alíquota e congelamento em &menos; 80 ° C. Diluir a 1:1000 para uso. (concentração de trabalho 10 μ M)
Enchedor de pipetas sorológico	Fisher Scientific	14-387-166
Filtro superior de tubo de vácuo Steriflip	Sigma-Aldrich	SE1M179M6
Capas de cultura de células estéreis	Baker Company	SG-600
Solução de azul de tripano (0,4%)	Thermo Fisher	15250061
Tripsina-EDTA (0,25%)	Thermo Fisher	25200056
Estereomicroscópio Zoom	Olympus	SZ61/SZ51	Mantido em bancada limpa de fluxo laminar