Artigo de método

Imagem tridimensional de tecidos aórticos na aterosclerose

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DOI:

10.3791/67400

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25 de outubro de 2024

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1Division of Vascular Surgery, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Institute for Cardiovascular Prevention (IPEK), Ludwig-Maximilians-University, 3Institute of Precision Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich Heart Alliance

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos protocolos otimizados de limpeza de tecido para obter imagens da aorta murina em três dimensões (3D). Delineamos procedimentos de última geração para imunocoloração, limpeza óptica e imagem com a intenção de definir a proximidade anatômica do sistema nervoso periférico com placas ateroscleróticas e a adventícia na aterosclerose.

Resumo

Pesquisas recentes avançaram na compreensão da aterosclerose como uma doença inflamatória crônica transmural envolvendo todas as três camadas da parede arterial, incluindo a placa íntima, a média e a adventícia, que forma o revestimento externo do tecido conjuntivo das artérias. Nossos estudos recentes têm sugerido que a adventícia é utilizada pelo sistema nervoso periférico como um canal para atingir todas as células teciduais. Verificamos também que o sistema nervoso periférico, ou seja, o sistema nervoso sensorial e simpático, sofre grandes processos de remodelação envolvendo a neogênese de redes axônicas adjacentes às placas ateroscleróticas. Nesse contexto, a compreensão da estrutura da rede neural e suas interações com os componentes vasculares das artérias doentes traz grandes promessas para uma melhor compreensão da patogênese das doenças cardiovasculares. Para atingir esses objetivos, são necessários métodos para visualizar a arquitetura subcelular das artérias intactas saudáveis e doentes, juntamente com seus compartimentos perivasculares circundantes. A limpeza do tecido permite imagens intactas de tecidos profundos de compartimentos de tecido maiores que, de outra forma, seriam inacessíveis. Ele permite imagens volumétricas de artérias intactas por meio da integração de ferramentas de rotulagem, limpeza, imagens microscópicas avançadas e processamento de imagens. Aqui, descrevemos duas abordagens distintas, mas complementares, de limpeza passiva de tecidos, ou seja, limpeza de 2, 2-tioodietanol (TDE) de base aquosa e imagem tridimensional habilitada para imunomarcação à base de solvente de limpeza de órgão limpo por solvente (iDISCO) para obter imagens de segmentos aórticos isolados ou aorta inteira in situ em todo o camundongo.

Introdução

As técnicas histológicas fornecem uma compreensão básica das amostras biológicas por meio da secção de tecidos/órgãos. No entanto, o delineamento de interações anatômicas complexas célula/célula e tecido/tecido em três dimansion (3D) tem sido - até recentemente - difícil de alcançar. Essa necessidade não atendida foi particularmente evidente no contexto do sistema cardiovascular em condições saudáveis e doentes. A imagem de tecidos intactos foi um desafio no passado devido à absorção e dispersão de luz, tornando-os intrinsecamente opacos. A limpeza do tecido torna a amostra biológica intacta transparente, minimizando essas limitações. Desenvolvimentos recentes nas técnicas de limpeza de tecidos permitem imagens 3D de alta resolução de tecidos transparentes não seccionados para fornecer informações consideráveis sobre a microarquitetura celular e estrutural de órgãos inteiros com resolução micrométrica, permitindo assim a definição de redes de conectividade anatômica.

A aterosclerose envolve três camadas da parede arterial, incluindo a camada íntima interna, a camada média média e a camada externa de tecido conjuntivo, que é denominada adventícia. As placas ateroscleróticas na camada interna das artérias têm sido um alvo convencional de pesquisa há décadas 1,2. No entanto, a camada de adventícia contém vasos sanguíneos, vasos linfáticos e fibras nervosas do sistema nervoso periférico. Além disso, a adventícia está ligada ao tecido adiposo perivascular e aos componentes do tecido neuronal, incluindo nervos periféricos e gânglios perivasculares 3,4. Sabe-se que os nervos periféricos usam a adventícia como condutos para alcançar tecidos-alvo distantes e, de fato,células5. Nossos estudos recentes avançaram no progresso na compreensão das interações em várias camadas dos principais sistemas biológicos, que incluem o sistema imunológico, o sistema nervoso e o sistema cardiovascular. Denominamos essas interações de interfaces neuroimunes-cardiovasculares 6,7. Durante a aterogênese, os componentes da parede arterial passam por uma reestruturação e remodelação robustas. Por exemplo, adjacente à progressão da placa aterosclerótica na íntima, formam-se agregados de células imunes e a neogênese do axônio neuronal ocorre na adventícia aórtica murina 6,8,9. À medida que a aterosclerose progride, os agregados de células imunes se desenvolvem em órgãos linfóides terciários (ATLOs) de artérias bem estruturados com áreas distintas de células T, células B e plasmócitos10. No entanto, para delinear essas mudanças em 3D, a imagem de alta resolução do tecido intacto tem sido um desafio devido à permeabilização insuficiente da membrana e ao espalhamento de luz inerente11. As abordagens de limpeza de tecidos superaram as principais limitações das abordagens histológicas convencionais 11,12,13,14,15 com maior penetração de anticorpos para atingir profundamente tecidos ou órgãos intactos, ajustando uniformemente o índice de refração (IR), levando a imagens de resolução em escala micrométrica com maior profundidade de imagem em voxels. Os RIs das amostras podem ser combinados com glicerol (RI 1.46) ou óleo de imersão (RI 1.52), reduzindo bastante a dispersão de luz e as aberrações esféricas, permitindo alta resolução. Avanços recentes nas técnicas de limpeza de todo o órgão ou tecido de corpo inteiro, como 2,2-tioodietanol (TDE) à base de água e imagem 3D habilitada para imunomarcação de órgãos limpos com solvente (iDISCO), respectivamente, juntamente com técnicas de imagem volumétrica (incluindo imagens de microscopia confocal, multifotônica e de folha de luz) permitiram reconstruções da microanatomia da arquitetura vascular construindo seu atlas de conectividade11,16. A visualização dessas conexões celulares e estruturais em 3D pode fornecer novos insights para responder a perguntas biológicas até então não respondidas.

Protocolo

O presente estudo foi realizado de acordo com as diretrizes do comitê local e nacional de uso e cuidados com animais. Camundongos Apoe-/- machos hiperlipidêmicos com fundo C57BL/6J mantidos em uma dieta padrão de ração para roedores que desenvolvem espontaneamente aterosclerose durante o envelhecimento foram usados no presente estudo.

1. Imagem de montagem total da aorta isolada e limpeza de TDE

  1. Preparação de tecidos
    1. Prepare o anestésico a 150 mg / kg de cetamina e 30 mg / kg de xilazina (ver Tabela de Materiais) por camundongo. Anestesie profundamente os camundongos por injeção intraperitoneal e confirme isso pela falta de reação ao teste de dor profunda.
      NOTA: A concentração e o volume da injeção são os seguintes: Cetamina 100 mg/mL; xilazina 20 mg/mL; Volume de injeção 50:50 mistura por volume de cetamina e xilazina a 3 μL / g.
    2. Coloque o mouse em uma placa de espuma coberta com toalhas de papel cirúrgico e fixe os braços e as pernas em decúbito dorsal com fitas. Desinfete o tórax com etanol a 75% (ver Tabela de Materiais) e retire sangue pelo ventrículo esquerdo com uma seringa descartável de 1 mL para remover o sangue para melhor perfusão.
      NOTA: A coleta de sangue cardíaco por toracotomia também pode ser usada.
    3. Faça uma incisão na linha média do tórax para expor o coração e uma pequena incisão no átrio direito para permitir a perfusão transcardíaca. Perfunda o camundongo através do ventrículo esquerdo com 10 mL de ácido etilenodiaminotetracético 5 mM (EDTA; ver Tabela de Materiais) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 5 min, seguido por 20 mL de PBS por 5-10 min até que o sangue seja eliminado. Por fim, perfunda com 10 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% por 20 min.
      NOTA: Todos os procedimentos podem ser realizados com uma bomba de perfusão peristáltica com pressão de 100-125 mm Hg à temperatura ambiente (RT). A agulha de perfusão é inserida no coração do camundongo através do mesmo orifício da extração de sangue.
    4. Remova órgãos internos, incluindo baço, fígado, pulmão e órgãos gastrointestinais e reprodutivos, usando instrumentos cirúrgicos. Mantenha o coração, a aorta e os rins intactos in situ.
      NOTA: Os instrumentos cirúrgicos usados para dissecção e remoção de órgãos são tesouras de dissecação, tesouras de íris finas, tesouras de mola, pinças rombas, pinças curvas e pinças finas curvas.
    5. Exponha toda a aorta da aorta ascendente à bifurcação ilíaca sob o estereomicroscópio de dissecação (aumento de 30-40x). Remova cuidadosamente o timo e o tecido adiposo sem lesão da aorta.
      NOTA: Tenha cuidado para não cortar a aorta. Para camundongos Apoe-/- , mantenha o mínimo de tecido adiposo perivascular circundado da aorta para a estrutura conectada.
    6. Colha toda a aorta em uma placa de Petri cheia de PBS. Separe a aorta em diferentes segmentos e divida toda a aorta longitudinalmente usando uma íris ou tesoura de mola para expor a superfície intimal seguindo a sequência e a direção indicadas na Figura 1A para clareamento do TDE.
    7. Prenda a aorta na face frontal na placa de cera preta plana em forma de Y, conforme indicado na Figura 1A. Fixe-o em 4% de PFA durante a noite a 4 °C.
      NOTA: Prenda a aorta na placa de cera antes da fixação para evitar dobrar e enrolar nas etapas a seguir.
    8. Solte a aorta e transfira-a para PBS. Lave bem a aorta por 5 min por 5 vezes.
      NOTA: Transfira a aorta para diferentes tubos cheios de PBS a cada vez para lavar.
  2. Coloração de anticorpos para aorta facial
    NOTA: Todas as etapas de incubação são realizadas em tubos de trava segura de 2 mL com rotação suave ou agitação em RT.
    1. Transfira a aorta fixa para uma solução de bloqueio por 2 h para bloqueio e permeabilização.
      NOTA: A solução de bloqueio varia de acordo com os anticorpos primários e secundários. Por exemplo, solução de bloqueio: 0,5 mg / mL CD16 / 32 (1: 100), 10% de soro de burro normal, 2% de Triton X-100 em PBS (ver Tabela de Materiais)
    2. Incube a aorta com anticorpos primários na solução de bloqueio acima (etapa 1.2.1), por exemplo, CD3e (diluição 1:100), NF200 (diluição 1:200) e B220 (diluição 1:200) por 24 h (ver Tabela de Materiais). Lave a aorta em PBS por 5 min por 5 vezes.
    3. Incubar a aorta com anticorpos secundários em soro de burro normal a 10% (diluição 1:300) e 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1 mg/mL) para coloração nuclear durante a noite (ver Tabela de Materiais). Lave a aorta em PBS por 5 min 5 vezes e armazene a aorta em PBS a 4 ° C até o procedimento de limpeza do tecido.
      NOTA: Transfira a aorta para diferentes tubos cheios de PBS a cada vez para lavar. Cubra os tubos com papel alumínio para mantê-los no escuro para a etapa 1.2.3.
  3. Limpeza de tecido TDE
    NOTA: Todas as etapas de incubação são realizadas em tubos de trava segura de 2 mL, girando suavemente em RT e cobertos com papel alumínio no escuro. As soluções de trabalho TDE (ver Tabela de Materiais) são altamente permeáveis e devem ser manuseadas com cuidado em uma capela de exaustão. Colete e descarte os resíduos de acordo com os regulamentos locais.
    1. Transfira a aorta corada para soluções de trabalho TDE a 20% e incube por 1 h.
    2. Transferir a aorta para soluções de trabalho TDE a 47% e incubar durante 12 h. Transfira a aorta para soluções de trabalho TDE a 60% e incube por 24-36 h até que as amostras se tornem transparentes na luz visível para corresponder ao IR.
    3. Armazene a aorta em TDE 60% em RT no escuro até a imagem.
      NOTA: Atualize as soluções de trabalho a cada 30 minutos para o curto prazo de incubação (por exemplo, etapa 1.3.1) e a cada 4 h para longo prazo de incubação (por exemplo, etapa 1.3.2). O tempo de incubação para cada etapa pode ser ajustado dependendo do tamanho do tecido para obter uma melhor penetração de anticorpos ou transparência de limpeza. Para a aorta de camundongo Apoe-/- cercada por tecido adiposo, o tempo de incubação deve ser estendido adequadamente.
  4. Imagem da aorta de limpeza do TDE usando microscópio confocal de varredura a laser (CLSM)
    1. Use poços espaçadores de imagem retangulares pegajosos de dupla face disponíveis comercialmente com uma espessura de 0,2 mm (consulte a Tabela de Materiais). Cole o poço em uma lâmina de vidro limpa e transfira a aorta limpa. Certifique-se de que a adventícia aórtica da face esteja voltada para a lamínula.
      NOTA: Bata suavemente na aorta da face com o lado abluminal da aorta na parte superior usando uma pinça angular. Empilhe vários poços espaçadores de imagem para corresponder ao tamanho do tecido, se necessário.
    2. Monte a aorta com gotas de solução TDE a 60%. Prenda cuidadosamente uma lamínula ao poço, evitando bolhas de ar entre a amostra e a lamínula.
      NOTA: Remova cuidadosamente as bolhas com uma agulha antes da lamínula. Não use uma quantidade excessiva de solução de montagem, pois o sample pode flutuar.
    3. Use um instrumento CLSM invertido (consulte a Tabela de Materiais) equipado com uma objetiva de imersão (multi) 20x (NA: 0.75).
      NOTA: O CLSM permite imagens volumétricas de até 70 μm de profundidade com uma resolução mais alta, o que é necessário para a análise do diâmetro do nervo e da interação nervo-célula imune na adventícia aórtica.
    4. Selecione a objetiva de imersão (óleo) de 20x/0,75. Ajuste os detectores de diodo híbrido com base nos corantes corados. Ajuste as configurações de exibição e selecione o formato XY de 1024 x 1024 pixels para geração de imagens.
      NOTA: Uma lente objetiva de imersão em óleo captura sinais melhor do que a água.
    5. Coloque o óleo de imersão (com glicerol) uniformemente ao longo da aorta na lamínula. Mova a objetiva de 63x grosseiramente em direção à amostra até que ela toque o óleo de imersão/lamínula.
    6. Mova a objetiva 63x finamente sob o microscópio para localizar a região de interesse. Adquira a pilha Z do lado adventício da aorta face em tamanho de passo de 2-4 μm até 60 μm de profundidade para imagens 3D.
    7. Nomeie o arquivo com detalhes da amostra, detalhes da verificação e salve os dados.
  5. Imagem da aorta de limpeza de TDE usando um microscópio multifotônico
    1. Siga os passos 1.4.1-1.4.2 para montar a aorta en face no slide.
    2. Use um microscópio multifotônico vertical (consulte a Tabela de Materiais) equipado com uma objetiva de 20x (imersão em água, NA: 1,00, distância de trabalho = 2 mm), permitindo imagens volumétricas de até 1,5 mm de profundidade.
    3. Adquira pilhas Z do lado abluminal em tamanho de passo de 10-15 μm até 700 μm de profundidade. Nomeie o arquivo e salve os dados como na etapa 1.4.7.

2. Imunocoloração de corpo inteiro e limpeza de tecidos iDISCO

  1. Preparação de tecidos
    1. Siga as etapas 1.1.1-1.1.3 acima para anestesia, fixação do mouse e perfusão.
    2. Remova a pele e os órgãos internos, incluindo baço, fígado, pulmão e órgãos gastrointestinais e reprodutivos, usando instrumentos cirúrgicos. Mantenha o coração, a aorta e os rins intactos in situ.
    3. Dissecar a parte do corpo acima do nível do diafragma e fixar a parte inferior do corpo com PFA a 4% durante 1-2 dias (s) a 4 °C.
      NOTA: Realize a fixação, lavagens e incubações em tubos de 50 mL em um agitador giratório suave. Atualize a solução em novos tubos por 2-3 vezes.
    4. Lave bem a amostra por 10 min 3 vezes em RT.
      NOTA: Transfira a aorta para diferentes tubos cheios de PBS a cada vez.
    5. Incube a amostra em coquetéis de imagem cérebro/corpo 20% transparentes e desobstruídos e solução de análise computacional (CUBIC) por 48 h para descoloração.
      NOTA: Para solução CUBIC a 20%, dissolva 25 g de uréia em 15 mL de Triton X-100 e 28 mL de Quadrol e adicione PBS ao volume final de 100 mL. Prepare-o no exaustor, pois os ingredientes são estimulantes (ver Tabela de Materiais).
    6. Lavar bem a amostra durante 1 h cinco vezes em PBS à RT.
  2. Coloração de anticorpos
    NOTA: Todas as etapas de incubação são realizadas em tubos de trava segura de 50 mL com rotação suave ou agitação a 4 °C.
    1. Incube a amostra em solução de PBS-gelatina-Triton X-100-serum (PGST) durante a noite para permeabilização e bloqueio.
      NOTA: A solução de bloqueio varia de acordo com os anticorpos. Por exemplo, solução de bloqueio: PBS-gelatina-Triton X-100-soro (PGST, consulte a Tabela de Materiais) solução: 0,2% de gelatina de pele suína, 0,5% de Triton X-100 e 5% de soro de cabra em PBS.
    2. Incubar a amostra com anticorpos primários em solução de PGST, por exemplo, NF200 (diluição 1:200, ver Tabela de Materiais) a 4 °C e agitar suavemente durante 10-12 dias. Em seguida, lavar bem a amostra em PGST durante 1 h 5 vezes à RT.
    3. Incubar a amostra com solução de anticorpos secundários (diluição 1:300) e DAPI (1 mg/ml) em PGST a 4 °C durante 7 dias.
    4. Lave bem a amostra em PGST por 1 h 5 vezes em RT. Transfira a amostra para PBS e armazene a aorta em PBS a 4 ° C para etapas posteriores.
      NOTA: Cubra os tubos com papel alumínio para mantê-los escuros para as etapas 2.2.3-2.2.4.
  3. Limpeza de tecido iDISCO modificada
    NOTA: Durante a limpeza, os tubos devem ser cobertos com papel alumínio para evitar branqueamento/extinção do sinal devido à exposição direta à luz natural/artificial. Todos os reagentes orgânicos usados na limpeza do DISCO são prejudiciais e todas as etapas de limpeza devem ser feitas em uma capela de exaustão. Use jaleco, luvas e máscara ao lidar com os reagentes para evitar a inalação e o contato com a pele e os olhos. Colete e despeje os resíduos de limpeza em recipientes de lixo apropriados no exaustor.
    1. Transfira as amostras coradas da etapa 2.2.4 para uma série de concentrações aumentadas de soluções de trabalho de tetrahidrofurano (THF, consulte a Tabela de Materiais) para desidratação, ou seja, 50%, 70%, 90% e 100% (duas vezes 100%). Incubar durante 12 h por concentração.
      NOTA: Dilua o reagente THF (99%-100%) em água destilada para soluções de trabalho de diferentes concentrações no exaustor. Atualize as soluções de trabalho a cada 6 h.
    2. Transfira a amostra para solução de diclorometano absoluto (DCM, consulte a Tabela de Materiais) por 3 h para remoção de lipídios.
    3. Transfira a amostra para a solução de trabalho de benzil-álcool-benzilbenzoato (BABB) correspondente ao RI (consulte a Tabela de Materiais). Incube por 3-6 h até que o tecido fique translúcido e quase transparente à luz visível.
      NOTA: Para preparar a solução de trabalho BABB, misture 1 parte de álcool benzílico e 2 partes de benzoato de benzila (1:2) em um frasco de vidro. Agite suavemente por 5 min no capô.
  4. Imagem do tecido de limpeza iDISCO usando um microscópio de folha de luz
    NOTA: Visualize a amostra limpa assim que uma transparência ideal for alcançada. Um microscópio de folha de luz, como um ultramicroscópio-II (consulte a Tabela de Materiais), é usado para imagens. Encha o reservatório de imagem com a solução de limpeza final, a solução BABB. Tenha cuidado para não derramar BABB no instrumento para evitar danos ao instrumento.
    1. Use uma objetiva de ar 1x para imagens de baixa ampliação cobrindo toda a largura de toda a amostra. Transfira suavemente a amostra da solução de limpeza para um pano de papel e seque-a brevemente.
      NOTA: Use uma pinça romba para evitar apertar a amostra.
    2. Selecione um porta-amostras de tamanho apropriado com base no tamanho da amostra/tecido e prenda a parte traseira da amostra ao porta-amostras com supercola.
      NOTA: Aguarde 1-2 minutos até que a amostra esteja firmemente presa ao suporte de amostra.
    3. Encha o reservatório de imagem do microscópio de folha de luz com solução BABB e coloque suavemente a amostra nele. Ajuste o porta-amostras para garantir que a amostra esteja perpendicular à folha de luz e iluminada corretamente.
    4. Abaixe a objetiva para focar a amostra e ajuste as configurações de exibição enquanto foca para visualizar a amostra corretamente. Selecione a(s) folha(s) de luz adequada(s) no software do microscópio e ajuste sua largura para iluminar uniformemente todo o viewcampo.
      NOTA: Em um sistema de ultramicroscópio com iluminação a laser de ambos os lados, comece alinhando e focalizando o laser em um lado. Depois que ambos os lados estiverem definidos, ative os lasers de ambos os lados para observar uma imagem de varredura mesclada de ambas as iluminações.
    5. Selecione um canal vermelho distante (680 nm) para obter imagens de estruturas neuronais coradas com NF200 e um canal de autofluorescência (488 nm) para obter imagens de aorta e tecidos conjuntivos não corados. Ajuste a potência do laser dependendo da intensidade do sinal fluorescente para obter uma relação sinal-ruído ideal, o tempo de exposição e a largura da(s) folha(s) de luz.
    6. Selecione o modo de varredura x-y-z. Defina a varredura z-stack com um passo z de 2-8 μm e selecione 25%-60% de sobreposição ao longo do eixo y longitudinal das varreduras de ladrilhos (16 bits) cobrindo as superfícies ventral e dorsal das amostras para obter imagens de todo o volume da amostra (até 6-8 mm de profundidade).
    7. Nomeie a varredura com informações detalhadas, incluindo a data da varredura, nome da amostra, o anticorpo usado, objetiva, fator de zoom, etapas z e lasers usados. Salve os dados.
    8. Mude para uma ampliação maior (2x ou 4x) por meio da função de zoom para obter imagens de regiões específicas do corpo de interesse.
    9. Siga as etapas 2.4.4-2.4.7 acima para obter imagens e salve os dados.

3. Processamento e análise de imagem

NOTA: É necessária uma estação de trabalho de processamento de alta potência para o processamento. Garanta o backup dos dados imediatamente após o processamento devido ao alto volume de imagens (5 a 100 GB por imagem).

  1. Processamento de imagens CLSM e multifotônicas
    1. Carregue as imagens lado a lado Z-stack de microscópios CLSM e multifótons para a estação de trabalho de processamento de imagem equipada com o software Las X, Imaris (software de análise de imagem) ou Fiji para visualização, segmentação e quantificação 3D e bidimensional (2D).
    2. Para codificar por cores a profundidade do volume de uma célula ou estrutura, use um software de restauração de imagem (consulte Tabela de Materiais) para deconvolir a imagem bruta e gerar uma projeção de intensidade máxima dos dados desconvoluídos usando o código de cores temporal em Las X ou Fiji.
  2. Processamento de imagens de folha de luz
    1. Carregue a série de imagens TIFF lado a lado da pilha Z no software Fiji. Costure imagens com o plug-in de costura de Fiji e salve imagens costuradas no formato TIFF.
      NOTA: Se necessário, compacte as imagens unidas no formato LZW para permitir o processamento rápido com software diferente.
    2. Carregue as imagens unidas no software de visualização 3D (consulte Tabela de materiais) para segmentação de imagens. Rastreie manualmente as estruturas neuronais e vasculares no eixo xyz. Para rastreamento manual de pequenas fibras nervosas, selecione manualmente os sinais NF200+ pixel por pixel em cada plano z ao longo de todo o caminho da fibra nervosa entre a aorta e os gânglios.
    3. Carregue imagens pré-processadas no software de análise de imagem (consulte a Tabela de Materiais) para geração de vídeo, visualização 2D e 3D das imagens.
    4. Use a autofluorescência para segmentar a aorta e os tecidos conjuntivos, incluindo linfonodos e músculos, no software de análise de imagem. Aplique pseudocores separadas no software de análise de imagem para visualizar segmentos aórticos distintos, como parede aórtica e placa.
    5. Use a função de equalização de histograma adaptativo com limitação de contraste (CLAHE) no software Fiji para aprimorar o contraste local sobre o fundo das imagens processadas.

Resultados

Para demonstrar a microanatomia da aorta intacta saudável e doente e revelar as conectividades físicas entre o sistema imunológico, o sistema nervoso e o sistema cardiovascular em modelos de aterosclerose em camundongos, usamos duas abordagens complementares de limpeza de tecidos: limpeza TDE da aorta isolada e limpeza iDISCO de todo o camundongo (Figura 1). Após a imunocoloração total, a aorta da face foi limpa com uma série de soluções de trabalho TDE. O IR é combinado em 1,4-1,5, dependendo da concentração de TDE da etapa final, para obter a transparência ideal do tecido aórtico sem alterar seu volume (Figura 1A). Ao contrário da limpeza de TDE, o protocolo de limpeza iDISCO inclui etapas de descoloração e permeabilização antes da imunocoloração de montagem total, seguida de deslipidação e desidratação usando diferentes solventes químicos e a correspondência de RI em 1,56 (Figura 1B). A limpeza iDISCO permite a visualização de tecido de tamanho grande e até mesmo de todo o corpo do camundongo devido ao encolhimento do tecido.

A imagem 3D confocal e multifotônica da aorta facial inteira com TDE permite a visualização de estruturas, incluindo placas íntimas, celularidade da adventícia e projeções neuronais da adventícia, entre outras estruturas, enquanto a imagem de folha de luz do camundongo iDISCO permite a visualização e a reconstrução da árvore arterial junto com o tecido adiposo perivascular, linfonodos renais e os componentes neurais associados, incluindo nervos e gânglios (Figura 1C). Por exemplo, a imagem confocal da aorta aterosclerótica eliminada por TDE detectou múltiplas células T coradas com CD3e na placa e extensa neogênese de fibras nervosas coradas com NF200 de diferentes diâmetros em ATLOs, enquanto a imagem multifotônica de aorta abdominal doente de montagem inteira de camundongos Apoe-/- envelhecidos mostrou territorialidade do brotamento de axônios que expressam NF200 em áreas de células T B220 negativas dentro de ATLOs (Figura 2A). Por outro lado, a imagem de folha de luz do abdômen inteiro do camundongo limpo pelo iDISCO visualizou a relação espacial entre a aorta e os gânglios simpáticos adjacentes. A segmentação de imagens 3D e o rastreamento de axônios individuais dos gânglios até a superfície da aorta revelaram uma reestruturação neuronal robusta, incluindo axônios corados com NF200 recém-formados na adventícia da aorta adjacente à placa aterosclerótica (Figura 2B).

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Figura 1: Fluxo de trabalho do estudo. (A) Limpeza de TDE aquosa da aorta enfaced . (B) Limpeza iDISCO à base de solvente de todo o mouse. (C). 3D imagens volumétricas e processamento de imagens de aorta isolada opticamente limpa ou amostras inteiras de camundongos. Essa figura foi modificada com permissão de Sun et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Exemplo de imagens 3D de tecidos limpos de TDE e iDISCO. (A) Imagem 3D de TDE limpa na aorta da face . Painel superior: Imagens confocais mostraram células T CD3e+ (vermelho, seta) na placa intimal e axônios nervosos NF200+ (verde) na adventícia aterosclerótica da aorta (ATLO); Painel inferior: Imagens multifotônicas mostraram axônios nervosos NF200+ (verde, pontas de setas), células B B220+ (vermelho, triângulo aberto), geração de segundo harmônico derivada de colágeno (SHG, branco) em ATLOs de camundongos Apoe-/- machos de 78 semanas de idade. Sytox (azul) e DAPI (azul) mostraram os núcleos. (B) Imagens reconstruídas e segmentadas em 3D do abdômen de camundongo iDISCO limpas inteiras. Reconstrução, segmentação e rastreamento 3D de folha de luz de nervos e axônios NF200+ (setas, verde) e sua relação espacial com os gânglios simpáticos (pontas de setas) da aorta abdominal intacta. O triângulo aberto indicava um axônio recém-formado adjacente às placas ateroscleróticas. A autofluorescência (auto) foi usada para obter imagens da aorta e do tecido conjuntivo, incluindo placa (ciano) e linfonodo renal (RLN, azul). GC, gânglios celíacos, SycG, gânglios da cadeia simpática. Essa figura foi modificada com permissão de Mohanta et al.6 e Sun et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A aterosclerose pode ser vista como uma doença inflamatória transmural das artérias envolvendo todas as três camadas da parede arterial. Além disso, as artérias são circundadas pelos tecidos adiposos e neuronais perivasculares. Durante a progressão da aterosclerose, cada um desses tecidos sofre alterações celulares e estruturais consideráveis, o que requer métodos para adquirir acesso óptico subcelular aos tecidos intactos que circundam as artérias saudáveis e doentes. Esses métodos são fornecidos aqui para entender melhor as interações célula-célula e célula-tecido e para avançar na compreensão da patogênese das doenças cardiovasculares. A limpeza do tecido e a subsequente imagem microscópica 3D permitem a aquisição de imagens de compartimentos de tecido intactos em grande escala, até então inacessíveis, revelando reconstruções detalhadas das artérias. Aqui, apresentamos protocolos para técnicas de limpeza de tecidos TDE e iDISCO, destacando sua eficácia e simplicidade em obter transparência quase completa do tecido, imagens eficientes com microscopia confocal/multifotônica ou de folha de luz e, ao mesmo tempo, manter a integridade estrutural.

A limpeza de TDE usa um reagente solúvel em água para obter a transparência do tecido ajustando o RI, preservando efetivamente os sinais de fluorescência no tecido. Representa um método eficiente de limpeza de tecidos para vasos sanguíneos de tamanho menor, ou seja, volume de tecido de tamanho micrométrico a milimétrico sem encolhimento do tecido. No entanto, requer maior tempo de processamento para tecidos maiores, ou seja, volumes de tecido de milímetro a centímetro. É importante ressaltar que o procedimento pode ser adaptado à necessidade do usuário, ajustando a concentração dos reagentes e o tempo de incubação. Por outro lado, o iDISCO usa uma série de solventes orgânicos para remover lipídios e água, levando a uma melhor transparência do tecido para tecidos maiores, órgãos inteiros ou o camundongo inteiro ou tecidos humanos maiores. Ele oferece as vantagens exclusivas de tempos de processamento curtos e adequação para grandes volumes de tecido. No entanto, leva ao encolhimento das amostras limpas, extinção dos sinais de fluorescência e remoção de lipídios, o que é uma grande limitação para tecidos ateroscleróticos ricos em lipídios. Além disso, a microscopia de folha de luz, ao contrário da microscopia confocal ou multifotônica, não pode visualizar detalhes subcelulares no nível micrométrico e visualizar projeções neuronais de pequeno diâmetro, como axônios únicos e suas conexões com outras células vasculares.

A inervação vascular desempenha um papel significativo no desenvolvimento da aterosclerose 6,7,18. Investigar a distribuição dos nervos periféricos ao longo da árvore arterial e suas alterações ajudará a entender a progressão da doença. Devido à sua capacidade de processamento eficiente, o iDISCO é comumente usado para imagens de rede vascular inteira em modelos de aterosclerose em ratos e camundongos 12,19,20,21, fornecendo imagens tridimensionais de alta resolução. O TDE, por outro lado, é adequado para estudos que requerem a preservação de marcadores fluorescentes, como a observação de marcadores neuronais específicos, revelando com precisão a estrutura fina e as alterações na inervação vascular6. Ambos os protocolos de limpeza de tecido são necessários, pois a limpeza de TDE não envolve encolhimento e pode gerar imagens de lipídios, enquanto o iDISCO leva ao encolhimento do tecido devido à desidratação e deslipidação. Além disso, o protocolo iDISCO modificado pode ser usado para limpeza tecidual de tecidos cardiovasculares humanos22,23. Ambas as técnicas de clareamento oferecem vantagens complementares ao estudo do remodelamento arterial na aterosclerose. Ao combinar os pontos fortes de ambos os métodos, uma compreensão mais abrangente e aprofundada dos mecanismos patológicos da aterosclerose pode ser alcançada.

Divulgações

SKM, CJY e AJRH são cofundadores da Easemedcontrol R & D GmbH e Co. KG.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) SFB1123/Z1, Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular (DZHK) DZHK 81X2600282 e uma bolsa da fundação Corona (S199/10087/2022) para SKM; e ERA-CVD (PLAQUEFIGHT) 01KL1808 e uma subvenção do governo para a AJRH na Easemedcontrol R & D GmbH and Co. KG.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2,2'-tiodietanol (TDE)Sigma 166782Reagente de limpeza
AmiraThermo Fisher Software de visualização 3D científico; Software de processamento de imagem usado para segmentação manual e rastreamento em imagens 3D
Álcool benzílicoSigma W213713Reagente de limpeza
Benzoato de benzilaSigmaB6630Reagente de limpeza
CD16/32eBioscience14-0161-82Solução de bloqueio
Microscópio confocal de varredura a laser Leica MicrosystemsTCS- SP8 3XDispositivo de imagem para imagens multidimensionais de alta resolução de tecidos biológicos intactos ou seções com alta especificidade em resolução subcelular.
DAPIInvitrogenD3571Marcador de Núcleos
Diclorometano (DCM)Sigma 270997Reagente de limpeza
Dissecando cera pan-preta Thermo Scientific S17432Dissecção e fixação da aorta 
Estereomicroscópio de dissecçãoLeica Microsystems Stemi 2000Dissecção de órgãos de camundongo
Etanol DeserçãoSigmaE7023
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Roth 8040.1Tampão de perfusão 
Fiji(ImageJ, NIH)Software de processamento de imagem de código aberto para imagens 2D e 3D
IgG anti-hamster de cabra, Cy3Dianova 127-165-099Anticorpo secundário
IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 680Thermo Fisher Scientific / InvitrogenA-21109Anticorpo secundário 
IgG anti-rato de cabra, Cy5Dianova712-175-150Anticorpo secundário
para hamster anti-CD3e BD Bioscience145-2C11 Marcador de célula Pan-T
Huygens ProfessionalScientific Volume Imaging, HolandaVersão 19.10Software de restauração de imagem; Software de processamento de imagem usado principalmente para deconvolução de imagens 2D e 3D
Estação de trabalho de processamento de imagemMIFCOM MIFCOM X5equipada com todos os softwares de processamento de imagem, incluindo Leica application suite X, Fiji e Imaris para pós-processamento de imagens adquiridas por microscópios confocais, multifotônicos e de folha de luz Software
ImarisBitplaneversão 8.4; Software de processamento de imagem usado para segmentação automatizada de imagens 3D
Incubadora e rotador Marshall Scientific Innova 4230Dispositivo de incubação e rotação durante a limpeza do tecido
iSpacerSunjin LabIS4020Retangular bem como o suporte de amostra
KetamineLivistoAnestésico
Leica Application Suite X (LAS-X) Leica MicrosystemsVersão 3.5Software de processamento de imagem para as imagens adquiridas com o microscópio Leica
Microscópio de luzLeica MicrosystemsDM LBDispositivo de imagem para imagem de campo brilhante
Folha de luzLaVision BioTechUltramicroscope IITécnica de imagem para imagens rápidas e de alta resolução de grandes espécimes biológicos ou camundongos inteiros com baixa exposição à luz, adquirindo rapidamente imagens de seções ópticas finas.
Microscopia multifotônicaLeica MicrosystemsTCS-SP5II MP Modalidade de imagem para imagens multidimensionais e de alta resolução de tecidos biológicos intactos e viáveis em nível subcelular e molecular por períodos prolongados de tempo, profundamente na amostra e com invasão mínima.
Soro de cabra normal SigmaG9023Solução de bloqueio
de paraformaldeído (PFA) Sigma P-6148 Fixação 
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Sigma P4417-100TAB Tampão de lavagem
Gelatina para pele suínaSigma G1890Tampão de incubação
QuadrolSigma122262Reagente de limpeza CUBIC
Rabbit Anti-NF200SigmaN4142Marcador pan-neuronal
Rato Anti-B220 BD BioscienceRA3-6B2Marcador de células Pan-B
SucroseSigma 90M003524V Desidratação 
SytoxThermo Fisher ScientificS11380Marcador de núcleos
TetrahidrofuranoSigma 401757Reagente de limpeza 
Triton X-100Roth 3051.1
Penetração UreiaSigma U5128Reagente de limpeza CUBIC
Xileno Fisher Chemical x/0250/17 Anestésico 
Estação de trabalho de processamento de imagem de análise de imagem microscópio

Referências

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  3. Yin, C., Mohanta, S. K., Srikakulapu, P., Weber, C., Habenicht, A. J. Artery tertiary lymphoid organs: Powerhouses of atherosclerosis immunity. Front Immunol. 7, 387(2016).
  4. Mohanta, S. K., et al. Artery tertiary lymphoid organs contribute to innate and adaptive immune responses in advanced mouse atherosclerosis. Circ Res. 114 (11), 1772-1787 (2014).
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  7. Mohanta, S. K., et al. Cardiovascular brain circuits. Circ Res. 132 (11), 1546-1565 (2023).
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  23. Mai, H., et al. Scalable tissue labeling and clearing of intact human organs. Nat Protoc. 17 (10), 2188-2215 (2022).

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