Estabelecendo um modelo de câncer de bexiga superficial murino por meio de uma técnica de administração de células intravesical

Resumo

Este protocolo descreve um método único para construir um modelo ortotópico de câncer de bexiga superficial.

Resumo

Este estudo apresenta um método inovador para estabelecer um modelo ortotópico de tumor de bexiga murina com alta eficiência e localização precisa do tumor. Após anestesiar camundongos C57BL / 6J fêmeas em decúbito dorsal, uma agulha intravenosa 24 G é inserida na bexiga para evacuar seu conteúdo. Uma agulha dispensadora de 34 G é então introduzida através do cateter, girada cinco vezes para criar uma lesão focal na mucosa da cúpula da bexiga e, posteriormente, removida. A suspensão de células MB49 é aspirada e conectada a uma agulha dispensadora de 30 G, que é inserida na bexiga através do cateter. As células tumorais são injetadas submucosalmente na bexiga sob pressão. Essa técnica resulta em trauma mínimo para os camundongos, uma alta taxa de captura do tumor e uma localização fixa do tumor. Caracteriza-se pela simplicidade e excelente reprodutibilidade. Este modelo fornece uma plataforma experimental ideal para o desenvolvimento de terapias intravesicais para o câncer de bexiga, facilitando o avanço e a otimização das estratégias de tratamento para essa malignidade.

Introdução

O câncer de bexiga representa um fardo significativo para a saúde global, com notáveis disparidades específicas de sexo na incidência e no prognóstico. Essa malignidade é caracterizada por subtipos moleculares distintos, cada um associado a diversas vias patogênicas. As características moleculares e patológicas diferem significativamente entre o câncer de bexiga não invasivo do músculo (NMIBC) e o câncer de bexiga invasivo do músculo (MIBC)^1,2. O NMIBC é responsável por aproximadamente 75% dos casos, apresentando tumores de origem epitelial transicional que permanecem localizados sem metástase ou disseminação. Por outro lado, o MIBC é caracterizado pela infiltração de células cancerígenas na camada muscular da bexiga, acompanhada de um alto risco de disseminação, frequentemente necessitando de cistectomia na prática clínica³.

Na pesquisa pré-clínica, modelos que representam com precisão o estágio superficial da doença são essenciais para avaliar as terapias medicamentosas. O estabelecimento de um modelo in situ de carcinoma superficial da bexiga é, portanto, de suma importância, servindo como uma ferramenta de pesquisa crítica para o desenvolvimento de medicamentos clínicos e terapias inovadoras de instilação.

O desenvolvimento de modelos de câncer de bexiga ortotópico murino tradicionalmente enfrenta desafios. Os modelos quimicamente induzidos geralmente começam como tumores superficiais, mas podem evoluir para formas invasivas, com variabilidade que limita sua utilidade em experimentos de grande escala⁴. Os modelos tradicionais de implantação ortotópica, que dependem da injeção de células tumorais através da parede da bexiga⁵, lutam para reproduzir fielmente o câncer superficial da bexiga. Métodos alternativos, incluindo lesão da mucosa combinada com instilação de células tumorais 6,7,8,9,10, foram tentados, mas são limitados por altas taxas de mortalidade e baixas taxas de absorção de tumores, dificultando sua aplicação mais ampla.

Este estudo tem como objetivo desenvolver um novo método para a construção de um modelo de câncer de bexiga superficial que demonstre maior estabilidade, menor mortalidade e posicionamento fixo do tumor em comparação com os modelos existentes. Ao alcançar uma representação mais precisa da doença em seus estágios iniciais, o modelo atual está pronto para aprimorar a avaliação rigorosa das intervenções preventivas e terapêuticas, avançando assim no tratamento do câncer de bexiga.

Protocolo

Todos os protocolos e procedimentos experimentais em animais foram aprovados pelo Comitê de Revisão Ética para Experimentação Animal da Universidade Médica de Tianjin, Tianjin, China (número de aprovação SYXK: 2020-0010). Camundongos C57BL/6J fêmeas de seis a oito semanas de idade foram usados para este estudo. Os animais foram alojados em condições ambientais controladas, incluindo um ciclo claro-escuro de 12 horas, temperaturas variando de 21-25 °C, níveis de umidade ajustáveis entre 30%-70% e acesso irrestrito a comida e água, a menos que especificado de outra forma. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação celular

1. Cultive a linha celular de câncer de bexiga murina MB49 em meio de Eagle modificado completo de Dulbecco (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) para apoiar o crescimento ideal.
2. Manter as culturas de células em condições normais a 37 °C numa incubadora humidificada com 5% de CO₂. Atualize a mídia a cada 2-3 dias para garantir a saúde e a viabilidade da célula.
3. Colha as células usando um procedimento padronizado de digestão de tripsina. Pipetar suavemente para desalojar as células do frasco de cultura após a aplicação de tripsina e incubação durante um breve período.
4. Conte as células colhidas usando um hemocitômetro para determinar a densidade celular exata. Prepare uma suspensão de célula única ressuspendendo as células a 2 x 10³ / μL em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Mantenha esta suspensão no gelo para manter a viabilidade celular.

2. Preparação animal

1. O grupo abriga os camundongos (5 camundongos por gaiola) em gaiolas de policarbonato ventiladas individualmente.
2. Deixe os camundongos se aclimatarem por 7 dias antes do início do estudo.

3. Geração de modelo de tumor ortotópico animal

1. Administre anestesia aos camundongos por injeção intraperitoneal usando uma solução de Avertin a 2,5% (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
2. Espere até que os camundongos atinjam um nível adequado de anestesia para a cirurgia, conforme indicado por uma diminuição na frequência respiratória com o aumento da profundidade, ausência de reflexos palpebrais e corneanos, redução do tônus muscular e respostas reflexas e nenhuma reação a um beliscão da cauda.
3. Posicione o mouse anestesiado em decúbito dorsal para facilitar o procedimento.
4. Use um cateter intravenoso 24 G com o estilete agulha removido para o procedimento de cateterismo uretral. Aplique ampla lubrificação no cateter para minimizar o desconforto e facilitar a inserção suave.
5. Identifique a uretra, situada imediatamente posterior às pregas vulvares e anterior à vagina, mantendo o camundongo em decúbito dorsal.
   1. Comece o cateterismo aproximando-se da uretra em um ângulo de 45 graus para navegar abaixo do osso púbico. Ajuste para um ângulo mais raso para guiar o cateter através da uretra e para a bexiga.
6. Evite aplicar força excessiva contra a resistência, pois isso pode levar à perfuração uretral ou da bexiga. Confirme a localização do cateter dentro do lúmen da bexiga verificando se há urina dentro do cateter.
7. Aplique pressão suavemente na parte inferior do abdômen do camundongo para facilitar a drenagem da urina da bexiga. Certifique-se de que a bexiga esteja completamente esvaziada para se preparar para as etapas subsequentes do procedimento.
8. Empurre suavemente o cateter intravenoso 24 G em direção ao topo da bexiga. Certifique-se de que a ponta do cateter entre em contato com o ápice da bexiga.
   1. Assim que o contato for confirmado, solte o cateter, permitindo que ele se retraia ligeiramente. Mantenha o cateter em uma posição fixa em relação ao mouse para garantir a estabilidade e evitar o deslocamento.
9. Insira a agulha dispensadora 34 G modificada ao longo do cateter 24 G. Avance a agulha até atingir o topo da bexiga.
   1. Uma vez posicionada, gire a agulha seis vezes para criar uma lesão localizada na mucosa no ápice da bexiga. Depois de completar a rotação, retire cuidadosamente a agulha ao longo do cateter.
10. Conecte a agulha dispensadora de 30 G ao topo de uma seringa de 1 mL. Garanta uma conexão segura entre a agulha e a seringa.
    1. Uma vez conectado, puxe a suspensão de células MB49 de 2 x 10³/μL pré-preparada para dentro da seringa, puxando suavemente o êmbolo para trás. Verifique se a suspensão celular é aspirada para dentro da seringa sem bolhas de ar.
11. Insira a agulha dispensadora de 30 G ao longo do cateter de 24 G. Certifique-se de que a agulha esteja devidamente alinhada e presa dentro do cateter.
    1. Uma vez posicionado, aplique pressão no êmbolo da seringa de 1 mL para injetar o conteúdo (preparado na etapa 1). Mantenha uma pressão constante no êmbolo por 60 s para garantir que o conteúdo seja fornecido sem redução significativa de volume.
    2. Após 60 s, retire cuidadosamente a seringa e a agulha dispensadora de 30 G do cateter.

4. Acompanhamento pós-operatório

1. Coloque o mouse anestesiado em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento até que o reflexo de endireitamento retorne.
2. Certifique-se de que o animal não seja deixado sozinho até que tenha recuperado a consciência suficiente.
3. Não devolva o animal à companhia de outros animais até que ele esteja totalmente recuperado.

Resultados

A eficácia das injeções submucosas foi inicialmente avaliada através da administração de Trypan Blue. Após a injeção, a distribuição do corante na camada submucosa foi claramente visualizada, confirmando a entrega precisa e controlada das substâncias injetadas (Figura 1).

O desenvolvimento do tumor foi meticulosamente rastreado. Aproximadamente 14 dias após o implante, foi observada uma incidência notável de hematúria, um sintoma crítico indicativo de neoplasia vesical. Os tumores foram identificados como firmemente estabelecidos na camada submucosa da bexiga. O padrão de crescimento inicial desses tumores foi caracterizado por expansão expansiva e não invasiva, consistente com a classificação de NMIBC. O exame histológico confirmou a ausência de invasão muscular, com tumores confinados à camada submucosa, alinhando-se com os critérios para CBNMI (Figura 2).

Observações macroscópicas corroboraram ainda mais o processo de formação do tumor. Os tumores eram visualmente distintos, exibindo crescimento papilar com uma variedade de tamanhos e formas (Figura 3). Além disso, os tumores cresceram relativamente lentamente, proporcionando tempo suficiente para a pesquisa no experimento (Figura 4).

Neste estudo, para verificar a localização do tumor e a ausência de semeadura uretral, utilizamos células MB49-luc para implantação, seguidas de imagens de pequenos animais. A Figura 5 mostra as imagens de bioluminescência in vivo tiradas 35 dias após a injeção das células tumorais, demonstrando claramente que o tumor está localizado na bexiga sem evidência de disseminação ectópica, como na uretra.

O tecido tumoral geralmente se torna detectável 14 dias após o implante. Em nossa experiência, 70% ou mais dos camundongos apresentam hematúria no dia 14. O procedimento geralmente não resulta em mortalidade. Sem intervenção, a eutanásia torna-se necessária no dia 60. Os critérios de eutanásia incluem letargia, caquexia, pêlo eriçado, curvatura, comportamento não responsivo ou perda de ≥20% do peso corporal inicial.

Figura 1: Eficácia da injeção submucosa com azul de tripano. Demonstração da eficácia da injeção submucosa usando Trypan Blue. As setas indicam os locais de injeção onde o Trypan Blue residual permanece visível mesmo após três lavagens com PBS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Confirmação histológica do implante tumoral. Confirmação histológica do implante tumoral na submucosa por meio da coloração H&E. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Visualização direta de tumores de bexiga. Visualização direta dos tumores de bexiga, destacando a proliferação vascular evidente na base do tumor. Barra de escala: 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Status do tumor no dia 35 pós-implante. Avaliação do estado do tumor no dia 35 pós-implantação. A parede da bexiga na base do tumor exibe vasos sanguíneos aumentados e desorganizados, acompanhados por uma base tumoral amplamente extensa. Barra de escala: 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagem de bioluminescência in vivo de câncer de bexiga. Imagens de bioluminescência in vivo de camundongos 35 dias após a implantação com células de câncer de bexiga MB49-LUC. As imagens são codificadas por cores para representar a intensidade da fluorescência: vermelho indica alta fluorescência (alta atividade tumoral) e azul indica baixa fluorescência (baixa atividade tumoral). Regiões de interesse (ROI) foram selecionadas na área da bexiga para quantificar o sinal de bioluminescência específico do tumor. Os resultados demonstram que os tumores estão localizados na bexiga sem evidência de disseminação ectópica, como na uretra. As regiões de baixo sinal podem ser devidas a sinais dispersos de áreas de alta intensidade que penetram no tecido e não indicam necessariamente a presença de células tumorais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Diagrama da administração intravesical de células cancerígenas. Representação esquemática da administração intravesical de células cancerígenas para construir o modelo ortotópico do câncer de bexiga superficial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Configuração de agulhas dispensadoras modificadas. Configuração de agulhas dispensadoras modificadas dentro do cateter 24 G. (A) Fotografia da agulha dispensadora 34 G dentro do cateter 24 G. (B) Fotografia da agulha dispensadora de 30 G dentro do cateter de 24 G. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A pesquisa sobre câncer de bexiga depende de modelos animais, que são indispensáveis tanto para a pesquisa básica quanto para a aplicada. Para melhor mimetizar o ambiente de crescimento tumoral, os modelos ortotópicos de tumor de bexiga fornecem uma abordagem superior em comparação com os modelos de tumor subcutâneo¹¹.

Atualmente, os modelos ortotópicos de câncer de bexiga podem ser categorizados com base em propósitos experimentais em dois tipos principais: aqueles que utilizam camundongos imunodeficientes, como modelos de xenoenxerto derivado do paciente (PDX)¹ e modelos de xenoenxerto derivado de linhagem celular (CDX)⁵, e aqueles que utilizam camundongos imunocompetentes, como modelos de enxerto singênico¹².

O modelo PDX envolve a implantação de tecidos tumorais derivados de pacientes em camundongos imunodeficientes, permitindo uma avaliação personalizada da resposta do tumor a drogas quimioterápicas. No entanto, a falta de um sistema imunológico intacto nesses camundongos apresenta limitações significativas para o estudo de mecanismos relacionados ao sistema imunológico. Da mesma forma, o modelo CDX, que usa linhagens de células tumorais derivadas de humanos, oferece altas taxas de formação de tumores, mas também sofre com a ausência de um microambiente imunológico⁵.

No contexto de camundongos imunocompetentes, o método primário para a construção de tumores ortotópicos da bexiga envolve a injeção de linhagens celulares MB49 derivadas de murinos na parede da bexiga para formar tumores de bexiga in situ ¹². Este procedimento requer laparotomia e injeção intravesical de células tumorais, apresentando desafios como potencial vazamento de células tumorais e semeadura do trato da agulha. Consequentemente, é difícil criar tumores superficiais da bexiga, o que dificulta a replicação precisa da progressão do câncer de bexiga humano de estágios não invasivos do músculo para estágios invasivos do músculo¹³.

Para estabelecer tumores ortotópicos superficiais da bexiga, as técnicas tradicionais de modelagem geralmente envolvem a indução de lesão da mucosa com agentes como soluções ácido-base ou eletrocautério, seguida da instilação intravesical de suspensões de células tumorais, com tempos de retenção de 2 h ou mais ^8,14. No entanto, essas metodologias apresentam várias limitações significativas. Em primeiro lugar, eles não conseguem garantir uniformidade no número e localização dos implantes tumorais dentro da bexiga, comprometendo assim a reprodutibilidade do modelo. Além disso, essas técnicas geralmente resultam em danos graves à bexiga, levando a altas taxas de mortalidade. A cicatrização da bexiga resultante e a capacidade reduzida representam obstáculos substanciais para estudos sobre novos agentes terapêuticos que requerem instilações intravesicais repetidas. Isso não apenas prejudica a confiabilidade dos resultados experimentais, mas também levanta preocupações éticas em relação ao bem-estar animal.

Portanto, o desenvolvimento de um modelo animal que possa simular com precisão o câncer superficial de bexiga humana forneceria uma plataforma experimental melhor para entender a proliferação e progressão do tumor. Tal modelo seria inestimável para pesquisar novos agentes terapêuticos intravesicais e avançar nosso conhecimento da biologia do câncer de bexiga.

Este estudo delineia um método de implantação in situ que emprega uma agulha dispensadora de ponta romba para injetar células tumorais submucosas sob pressão (Figura 6). O estudo utiliza a linhagem celular MB49 e camundongos fêmeas C57BL / 6J para construir um modelo de tumor in situ .

Durante a construção deste modelo, a camada protetora na superfície normal da mucosa da bexiga representa um desafio significativo para a instilação direta de células tumorais, muitas vezes impedindo a formação efetiva de tumores⁸. Consequentemente, é necessário induzir lesão localizada na cúpula da bexiga usando uma agulha romba de 34 G para criar um "solo" adequado para o implante de células tumorais.

As agulhas dispensadoras de 34 G e 30 G utilizadas neste estudo sofreram modificações parciais. A ponta da agulha 34 G foi presa para criar uma extremidade ligeiramente irregular, aumentando sua capacidade de causar danos à mucosa. Os pontos de conexão das agulhas 34 G e 30 G foram aparados para garantir que as porções expostas no cateter 24 G sejam de 0,3 mm a 0,5 mm (Figura 7A) e 1 mm a 1,5 mm (Figura 7B), respectivamente.

Todo esse procedimento pode ser concluído em 10 minutos, eliminando a necessidade de laparotomia ou ligadura uretral prolongada para instilação intravesical. No entanto, essa abordagem também tem limitações. Devido às múltiplas etapas técnicas envolvidas neste método de modelagem - como inserir o cateter de demora através da uretra na bexiga e girar a agulha romba 34 G para atingir o grau apropriado de lesão da mucosa sem perfurar a parede da bexiga - os experimentadores devem praticar para aumentar a taxa de sucesso da implantação do tumor. Além disso, se for usada força excessiva durante a lesão da mucosa ou injeção de células tumorais, pode levar à perfuração da bexiga ou implantação do tumor na camada muscular.

Em conclusão, essa técnica oferece vantagens significativas em relação aos métodos tradicionais, incluindo redução do tempo de procedimento, menor mortalidade e melhor consistência na localização e crescimento do tumor, sem a necessidade de procedimentos invasivos ou retenção intravesical prolongada. Esses benefícios o tornam uma ferramenta valiosa para estudos pré-clínicos destinados a avaliar novos agentes terapêuticos para o câncer de bexiga.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agulha dispensadora de 34 G	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
Agulha dispensadora de 30 G	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
Avertin	Sigma-Aldrich LLC	T48402
Trypan blue	Sigma-Aldrich LLC	302643