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Artigo de método

Ensaio quantitativo baseado em PCR para medir a sinalização Sonic Hedgehog em modelo celular de ciliogênese

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DOI:

10.3791/67407

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31 de janeiro de 2025

 , 
1CellBio Lab, Institute of Health Sciences, Presidency University

Neste artigo

Resumo

O estudo demonstra um ensaio quantitativo baseado em PCR para ativação da via de sinalização Sonic Hedgehog (SHH) mediada por cílios primários usando agonista de SHH em um modelo celular de ciliogênese.

Resumo

A ciliopatia refere-se a uma coleção de doenças e distúrbios humanos multissistêmicos e poligênicos que surgem devido à aberração da estrutura ou função dos cílios móveis ou imóveis (primários) que são protrusões celulares baseadas em microtúbulos. Os cílios primários (PC) estão presentes na maioria dos tecidos epiteliais e endoteliais humanos e servem como um centro para a transdução de sinais fisiológicos, incluindo a sinalização Sonic Hedgehog (SHH). Várias situações exigem o exame da função do PC, o que pode ser alcançado medindo a via de sinalização canônica do SHH que é quase exclusivamente mediada pelo PC. Aqui, uma técnica baseada em PCR quantitativo (qPCR) é desenvolvida para medir o nível transcricional de genes da via SHH em células hTERT-RPE1 (ou RPE1) quiescentes que contêm principalmente PC. A quiescência nas células RPE1 é alcançada pela falta de soro por 48 h, enquanto a ativação da via SHH é promovida por um agonista específico. Este ensaio baseado em cultura de células é fácil de seguir e sensível. A demonstração bem-sucedida deste ensaio em células RPE1 ciliadas indica seu imenso potencial como um ensaio in vitro para examinar a função adequada do PC após a alteração genética ou epigenética de um ou vários genes, que podem estar associados a várias ciliopatias.

Introdução

Um cílio é uma protrusão baseada em microtúbulos e revestida por membrana da superfície celular, que é montada em um corpo basal1. Nos vertebrados, dois tipos de cílios, ou seja, móveis e imóveis, são observados. Os cílios móveis estão localizados em tecidos especializados e conferem motilidade. Os cílios primários (PC) imóveis estão presentes na maioria das células de vertebrados e desempenham funções sensoriais e transduzem sinais críticos do meio extracelular para o interior das células2. Uma vez montado, o alongamento ciliar é auxiliado pela maquinaria de transporte intraflagelar (IFT), que é um sistema de transporte bidirecional que transporta carga impulsionada por cinesinas (movimento anterógrado) e proteínas motoras dineína-II (movimento retrógrado)3,4. Defeitos estruturais ou funcionais em cílios móveis ou primários podem levar a uma infinidade de doenças humanas multissistêmicas que são conhecidas coletivamente como ciliopatias 5,6.

O PC serve como centro para vários processos de sinalização de desenvolvimento, como sinalização sem asas (Wnt), receptores acoplados à proteína G (GPCR), receptores-tirosina quinases (RTKs), β do fator de crescimento transformador (TGFβ) e sinalização do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) 7,8. Em mamíferos, a sinalização Sonic Hedgehog (SHH) é crítica, que é quase exclusivamente transduzida por PC em células contendo PC 9,10,11. A estrutura ou função aberrante do PC leva a vias de sinalização atenuadas que estão associadas a doenças como defeitos cardíacos congênitos, doença renal policística, anormalidades craniofaciais, distrofia retiniana e algumas doenças raras, como Síndrome de Bardet-Biedl (SBB), Síndrome de Joubert (JBTS), Síndrome de Alström, Displasia Torácica Asfixiante Jeune (JATD)12,13,14,15. A maioria destas são doenças poligênicas dos tecidos epiteliais ou endoteliais, o que torna os desafios no diagnóstico e tratamento precoce dessas doenças. Determinar como essas mutações contribuem para a sinalização atenuada mediada por PC em um modelo de cultura de células pode não apenas fornecer informações sobre a complexidade molecular dessa via de sinalização, mas também facilitar o diagnóstico de várias ciliopatias e sugerir intervenções terapêuticas. Com essa noção, um ensaio quantitativo baseado em PCR (qPCR) é desenvolvido para determinar a alteração na via de sinalização SHH mediada por PC em células epiteliais pigmentares da retina imortalizadas da telomerase humana (hTERT) (hTERT-RPE1, referida aqui como RPE1). As células RPE1 são células humanas quase diplóides e não transformadas que são amplamente utilizadas como modelo celular para ciliogênese, uma vez que aproximadamente 75% -80% dessas células montam PC após a falta de soro (incubação de células em meio livre de soro) por 24-48 h, em comparação com apenas 15% -18% de ciliação em uma cultura de crescimento assíncrono de células RPE116.

A sinalização do ouriço (HH) é conservada entre os vertebrados para o desenvolvimento embrionário17. Em mamíferos, três tipos diferentes de sinalização Hedgehog são testemunhados: Sonic (SHH), Indian (IHH) e Desert (DHH), dos quais SHH e IHH mostram funções sobrepostas no nível do tecido11. A sinalização de SHH desempenha papéis importantes durante o desenvolvimento embrionário, regulando a padronização dos membros e a especificação do tipo de célula no sistema nervoso e mantendo a homeostase do tecido adulto 10,11,18. Embora a sinalização de SHH seja complexa, há evidências crescentes que sugerem que a sinalização canônica de SHH depende de PC 7,11,19, que é mediada por funções coletivas de fatores de transcrição de Gli (Gli1, Gli2 e Gli3). Foi sugerido que a sinalização HH e o PC coevoluíram, com componentes críticos de sinalização concentrados no volume compacto na ponta do cílio para permitir respostas eficazes a baixas taxas de ligantes11.

Na ausência de ligantes SHH, o Patched1 (Ptch1), que está localizado na membrana do PC, inibe a atividade do Smoothened (Smo) por meio de um mecanismo pouco compreendido que provavelmente envolve o transporte lipídico, mantendo assim a via reprimida 7,20. O GPR161 ciliar constitutivamente ativo, que é um receptor de proteína acoplado a G e um regulador negativo do sistema, garante que a repressão seja mantida preservando altos níveis de AMP cíclico ciliar (cAMP) que aumenta a atividade da proteína quinase A (PKA)21 e mantendo a localização ciliar de PKA7. A atividade da PKA, juntamente com a caseína quinase 1 (CK1) e a glicogênio sintase quinase 3 β (GSK3β), fosforila múltiplos resíduos das proteínas Gli, Gli2 e Gli3, dentro do PC. Gli2 e Gli3 podem atuar como ativadores e repressores da transcrição de genes-alvo. A fosforilação mediada por PKA causa inibição da função ativadora de Gli2, enquanto Gli3 fosforilada é clivada por proteases para produzir a forma repressora Gli3R22. No geral, a expressão de genes-alvo SHH é reprimida em tais condições.

Quando o ligante SHH está presente, Ptch1 se liga a ele, e GPR161 deixa PC, e Smo, sendo fosforilado pelo receptor acoplado à proteína G (GPCR) quinase 2 (GPRK2) e CK1, é trafegado para PC, juntamente com β-arrestina e o motor de microtúbulos KIF3A23. Em conjunto, a localização de Gli2/3, Supressor de Fundido (SUFU) e Kif7 na ponta ciliar é promovida e está ligada à diminuição da clivagem de Gli2/3, aumentando assim a função ativadora de Gli2/324,25. Uma vez ativado, Gli2/3 induz a expressão de Gli1, que só pode funcionar como um ativador e, assim, amplifica a resposta da via SHH22. A ligação de SHH a Ptch1 é facilitada por oncogenes relacionados a CAM / regulados negativamente por oncogenes (CDO), irmão de CDO (BOC), interrupção de crescimento específica 1 (GAS1) e proteína 2 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP2). Por outro lado, a proteína de interação com ouriço (HHIP) pode sequestrar SHH interagindo diretamente com ela e também compete com Ptch1 de interagir com SHH26. É importante ressaltar que GLI1, HHIP e PTCH1 são transcritos na ativação da via SHH, enquanto os dois últimos participam da regulação negativa da via SHH.

Estudos anteriores demonstraram que os níveis de transcrição dos genes-alvo SHH podem ser medidos para avaliar a via SHH, embora possam variar significativamente em diferentes tipos de células27,28. Essa variação na resposta da via SHH pode ser atribuída a diferentes combinações de sinalização SHH mediada por PC e sinalização SHH mediada pela membrana celular, provavelmente na ausência de PC. SAG é um agonista de Smo que é usado neste método para imitar a ativação da sinalização SHH em células RPE1 carentes de soro que são majoritariamente ciliadas. Os níveis de transcrição de genes-alvo SHH, como HHIP, GLI1 e PTCH1 e um gene não-alvo SMO, foram medidos usando qPCR em células de controle e tratadas com SAG e foram comparados para determinar a ativação da via SHH. A demonstração bem-sucedida deste ensaio sensível baseado em cultura de células para medir a sinalização de SHH mediada por PC sugere sua aplicação promissora em pesquisas biomédicas associadas à função primária dos cílios.

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Protocolo

1. Cultura de células

  1. Passagem de um frasco de cultura de células T-25 quase confluente de células RPE1 na diluição de 1:5 da cultura original em um frasco de cultura de células T-25 fresco contendo 5 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), mistura de penicilina-estreptomicina a 1% (concentração final - 100 U/mL de penicilina G e 100 μg/mL de estreptomicina). Este meio é referido como o meio completo. Cultive células a 37 °C na presença de 5% de CO2.
    NOTA: As células RPE1 são células não transformadas comumente usadas para estudar a regulação molecular da montagem e desmontagem do PC em cultura de células. Aproximadamente 80% das células RPE1 montam PC após a falta de soro, que é novamente desmontada após a readição do soro16.
  2. Preparar as lamínulas redondas de vidro de 12 mm, incubando-as em 50 ml de HCl 1 N num copo de vidro coberto durante a noite, sem agitar a 60 °C em banho-maria ou em incubadora.
  3. No dia seguinte, usando uma pipeta de 25 mL, pipete a solução ácida e descarte-a adequadamente em um recipiente de risco químico. Em seguida, lave as lamínulas 3x em 100 mL de água destilada, incubando por 15 min com agitação ocasional, seguida de pipetagem.
  4. Repita as etapas de lavagem com etanol 70% e etanol 95%. Seque as lamínulas colocando-as individualmente em um mata-borrão de laboratório em um armário de biossegurança. Depois de seco, esterilize com radiação UV por 60 min.

2. Crescimento celular, fome de soro e tratamento SAG

  1. Ressuspenda as células no frasco T-25 em um meio completo pré-aquecido após desalojar as células pela atividade enzimática da solução pré-aquecida de tripsina-EDTA a 0,25%. Determine a densidade celular da suspensão contando as células usando um hemocitômetro.
  2. Preparar duas placas de cultura de células de 35 mm e colocar duas lamínulas estéreis de 12 mm em cada uma delas. Passe 2 x 105 células RPE1 de crescimento assíncrono em cada prato de 35 mm contendo lamínulas e cresça as células em 2 mL de meio completo por 24 h.
  3. Após 24 h, remova o meio de crescimento de células RPE1 e lave as células 1x com 1 mL pré-aquecido de tampão DPBS. Adicione 2 mL de meio DMEM pré-aquecido contendo 1% de penicilina-estreptomicina, mas desprovido de FBS (meio sem soro) a cada placa e incube as células por 24 h a 37 ° C na presença de 5% de CO2.
  4. Após 24 h, substituir o meio por um meio isento de soro contendo SAG até uma concentração final de 250 nM ou DMSO como solvente de controlo e incubar as células durante mais 24 h. Um diagrama de desenho animado do protocolo de cultura de células é mostrado na Figura 1A.

3. Coleta de células

  1. Transfira as lamínulas para uma placa de 24 poços com uma lamínula em cada poço. Adicione 0,5 mL de metanol resfriado a cada poço e incube a placa a -20 ° C por 10 min para fixar as células nas lamínulas. Imediatamente após, lave as lamínulas 3x com 0,5 mL de tampão de lavagem (1x PBS contendo 0,5 mM MgCl2 e 0,05% Triton-X 100).
  2. Descarte o meio e adicione 0,5 mL de reagente trizol diretamente em cada prato. Deixe distribuir uniformemente e mantenha por 5 min. Pipete para cima e para baixo algumas vezes para fazer uma mistura homogênea e colete-a em tubos de microcentrífuga sem nuclease de 1,5 mL.

4. Preparação de RNA total e cDNA

  1. Adicione 0,1 mL de clorofórmio a cada tubo contendo células lisadas e incube por 2-3 min. Centrifugue cada amostra por 15 min a 12.000 x g a 4 °C. Transferir a fase aquosa que contém o ARN para tubos de microcentrífuga frescos.
  2. Adicione 0,25 mL de isopropanol à fase aquosa e incube por 10 min. Centrifugue por 10 min a 12.000 x g a 4°C. O precipitado de RNA forma uma pelota branca semelhante a um gel. Usando uma micropipeta, descarte o sobrenadante.
  3. Ressuspenda o pellet de RNA em 0,5 mL de etanol a 75% recém-diluído. Vortex as amostras brevemente e, em seguida, centrifugue por 5 min a 7500 x g a 4 ° C. Descarte o sobrenadante com uma micropipeta.
  4. Seque ao ar o pellet de RNA por 10 min e ressuspenda em 25 μL de água livre de nuclease. Determinar a concentração de RNA total medindo a absorvância a 260 nm com um espectrofotómetro de microvolume.
  5. Use 1-3 μg de RNA total de ambas as amostras para preparar cDNAs seguindo as instruções do fabricante para um kit de síntese de cDNA. Armazenar cDNAs a -20 °C.

5. PCR quantitativo

  1. Defina as reações de qPCR (em triplicado, Tabela 1) usando cDNAs diluídos 1:5 de cada amostra com conjuntos de primers de GLI1, PTCH1, HHIP, SMO e β-ACTIN (como gene de manutenção; Tabela 2) genes com uma mistura principal de qPCR contendo DNA polimerase, dNTPs e tampão adequados, em uma placa de PCR sensível à fluorescência de vários poços adequada.
  2. Cubra a placa com um selante adequado, coloque-a em um instrumento de qPCR adequado e execute um programa de qPCR padronizado com 40 ciclos de amplificação e uma etapa de análise da curva de fusão no final do programa. O programa padronizado de qPCR de 40 ciclos, incluindo uma análise da curva de fusão, é mostrado esquematicamente na Figura 1B.
  3. Quando o programa de qPCR estiver concluído, verifique a curva de fusão de cada amplicon para um único pico na temperatura desejada.
    NOTA: No final dos ciclos de amplificação, a análise da curva de fusão associada mede a temperatura de fusão do amplicon aumentando a temperatura de cada poço de 65 ° C para 95 ° C, com incremento de 0.5 ° C por etapa de 5 s de duração.
  4. Exporte os dados de amplificação para uma planilha e calcule a expressão relativa (método 2−ΔΔCT) de cada transcrito, normalizando em relação ao gene β-ACTINA para cada amostra. Plote o gráfico e calcule a significância estatística das mudanças na expressão relativa de cada transcrito usando um teste T não pareado.

6. Imunocoloração e aquisição de imagem por microscopia de fluorescência

  1. Incubar as células fixas em lamínulas em 200 μL de tampão de bloqueio (2% BSA e 0,1% TritonX-100 em 1x PBS) por 30 min.
  2. Incube as células com uma mistura de anticorpos primários (normalmente um anti-camundongo contra α-tubulina acetilada do axonema PC e anticorpos anti-coelho contra membrana ciliar e centríolo, respectivamente) diluídos em tampão de bloqueio (consulte a Tabela de Materiais para diluição final) durante a noite a 4 ° C em uma câmara umidificada.
    1. Faça uma câmara umidificada colocando uma toalha de papel molhada na metade inferior de uma caixa vazia de ponteira de pipeta de 1 mL. Coloque uma tira de filme transparente na superfície do rack e coloque uma gota (20 -25 μL) da solução de anticorpos no filme, uma para cada lamínula a ser incubada. Coloque uma lamínula nas gotículas para que as células fiquem imersas e feche a tampa da caixa de pontas.
  3. No dia seguinte, inverta as lamínulas novamente e coloque-as de volta no prato de 24 poços. Lave as lamínulas com o tampão de lavagem e, em seguida, incube-as em 150 μL de mistura de anticorpos secundários com uma diluição pré-padronizada de anticorpos (aqui, anti-camundongo conjugado com corante fluorescente verde e anti-coelho conjugado com corante fluorescente vermelho diluído em tampão de bloqueio) e reagentes de coloração de DNA nuclear por 1 h à temperatura ambiente. Lave as lamínulas 3x.
  4. Localize uma gota (aproximadamente 3-5 μL) da solução de montagem contendo reagente antidesbotamento em uma lâmina de microscópio de vidro. Coloque uma lamínula, com o lado da célula voltado para baixo, na solução de montagem. Limpe o excesso de líquido pressionando suavemente um lenço limpo. Aplique esmalte transparente ao longo da borda da lamínula para selá-la no slide.
  5. Coloque uma lâmina no microscópio (consulte a Tabela de Materiais) anexada a uma platina motorizada e uma câmera capaz de imagens digitais. Use uma objetiva de imersão em óleo Plan Apo de 60x (com uma abertura numérica de 1,4) para adquirir as imagens de células RPE1 carentes de soro à temperatura ambiente, para visualizar o PC nas células, conforme marcado pelos anticorpos mencionados.
  6. Adquira imagens das diferentes amostras em lamínulas separadas usando tempo de exposição idêntico para diferentes fluoróforos ao longo do eixo Z usando um pacote de software de imagem de microscopia digital. Conte o número de células contendo PC de pelo menos 500 células para determinar a porcentagem de ciliação em 48 h de falta de soro.

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Resultados

A ativação da via de transdução de sinal SHH mediada por PC é uma forma de entender a função adequada do PC7. Aqui, a expressão relativa dos genes-alvo da via SHH é medida usando o ensaio RT-qPCR após a ativação mediada por SAG da via SHH em células RPE1 que são principalmente ciliadas. As saídas transcricionais diretas da via SHH GLI1 e PTCH1 são frequentemente empregadas para avaliar a atividade dessa via11. Este protocolo também inclui o transcrito HHIP, que é regulado p...

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Discussão

Examinar a funcionalidade do CP é um passo crucial para entender a dinâmica da ciliação e doenças ou distúrbios associados à disfunção do CP. Além de examinar a ciliação por imunocoloração para marcadores ciliares ou componentes estruturais ciliares marcados com fluoróforo, a função do PC é comumente determinada pelo ensaio da ativação da via canônica de SHH, medindo a translocação ciliar de Smo em tecidos e células usando microscopia de fluorescência27,31

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado pela bolsa Ramalingaswami para SM pelo Departamento de Biotecnologia (DBT), Govt. da Índia, e bolsa de pesquisa do Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (SERB), Govt. da Índia para SM (CRG / 2020 / 004042). A Fellowship of PH é patrocinada pela University Grant Commission (UGC), Govt. da Índia. Os autores agradecem sinceramente ao Dr. Chandrama Mukherjee e ao Sr. Avik Mukherjee, do RNABio Lab do Instituto de Ciências da Saúde, Universidade da Presidência, pelo acesso ao instrumento qPCR e treinamento no instrumento, respectivamente.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMSO, filtrado estérilSigmaD2650
Burro, anti-Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21202
Burro, anti-Coelho IgG (H+L) Alexa Fluor 568ThermoFisher ScientificA10042
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco, ThermoFisher Scientific41965039
Dulbecco's phosphate-buffered salina (DPBS)Gibco, ThermoFisher Scientific14190144
Fetal bovine serum (FBS)HimediaRM1112
Microscópio de Fluorescência equipado com objetiva 60XCarl Zeiss Axio observador colibri 5
células hTERT-RPE1ATCCCRL-4000
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad Laboratories1708891
Mouse, anticorpo monoclonal anti-tubulina acetiladaMilipore Sigma-AldrichT7451Diluição final 1:1000
Penicilina-estreptomicina, 100XGibco, ThermoFisher Scientific15140122
Máquina de PCR quantitativa, CFX 96Bio-Rad Laboratories
Coelho, anticorpo policlonal Arl13BProteinTech17711-1-APDiluição final 1:250
Coelho, anticorpo policlonal Cep135ProteinTech24428-1-APDiluição final 1:500
SlowFade gold Antifade moutantThermoFisher ScientificS36940
Suavizado Agonista (SAG) AbmoleM4865Solução de estoque: em DMSO, 5 mM
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725271
TRIzol ReagentInvitrogen15596026
TrypLEGibco, ThermoFisher Scientific12605028

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