Imunização Ativa para Induzir Miastenia Gravis de Quinase Músculo-Específica Autoimune (MuSK) em Camundongos

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo abrangente para um modelo experimental de camundongo de miastenia gravis autoimune de quinase específica do músculo (MuSK), com o objetivo de investigar a fisiopatologia e as possíveis estratégias terapêuticas para a doença.

Resumo

A miastenia gravis (MG) é uma doença autoimune que afeta a junção neuromuscular. Enquanto a maioria dos pacientes com MG produz autoanticorpos contra o receptor de acetilcolina (AChR), um subconjunto de pacientes exibe autoanticorpos direcionados à quinase específica do músculo (MuSK). A MG é caracterizada por fraqueza muscular grave, manifestações clínicas resistentes ao tratamento e crises miastênicas, muitas vezes necessitando de ventilação mecânica. Consequentemente, os pacientes frequentemente requerem uso prolongado de imunossupressores, que estão associados a efeitos adversos a longo prazo. Dada a gravidade e raridade do MuSK-MG, o desenvolvimento de um modelo animal experimental é crucial para o avanço de novas modalidades de tratamento e uma compreensão mais profunda dos mecanismos fisiopatológicos subjacentes. A miastenia gravis autoimune experimental (EAMG) serve como um modelo animal para MuSK-MG, imitando efetivamente, mas parcialmente, as características clínicas e imunológicas da MG humana. A indução de modelos animais autoimunes pode ser alcançada por meio de imunização ativa ou passiva. No protocolo experimental aqui apresentado, a imunização ativa foi empregada pela administração subcutânea do domínio extracelular purificado de MuSK humano emulsionado em adjuvante completo de Freund com Mycobacterium tuberculosis morto pelo calor. A imunização foi realizada em quatro locais, seguida de uma injeção de reforço de MuSK no 28º dia. Este adjuvante com M. tuberculosis permite a ativação do sistema imunológico através de TLR4 e fagocitose aumentada do antígeno administrado. Este artigo detalha de forma abrangente o desenvolvimento e a caracterização do MuSK-EAMG desde o início até a conclusão.

Introdução

A miastenia gravis (MG) é uma doença autoimune que se desenvolve por meio de mecanismos mediados por anticorpos dependentes de células T. É causada principalmente por anticorpos contra receptores nicotínicos de acetilcolina (AChR) na membrana pós-sináptica da junção neuromuscular (NMJ) em 80% -85% dos pacientes, e por anticorpos contra quinase específica do músculo (MuSK) em aproximadamente 5% dos pacientes, bem como outras proteínas NMJ. A MG tornou-se um protótipo para doenças autoimunes e um modelo para entender a função pós-sináptica¹. Os modelos animais de doenças autoimunes podem ser divididos em duas categorias principais: (1) Modelos espontâneos, nos quais os animais desenvolvem naturalmente uma doença autoimune, e (2) Modelos induzidos, onde a doença autoimune é artificialmente imitada e replicada. Estudos sobre miastenia gravis (MG) demonstraram que tanto a imunização ativa quanto a passiva podem induzir a doença, contribuindo significativamente para a compreensão das condições mediadas por anticorpos².

A transferência passiva é um método altamente eficaz para avaliar os efeitos agudos de doenças mediadas por autoanticorpos e tem sido amplamente utilizada para estudar anticorpos derivados de pacientes na MG. Essa abordagem tem sido benéfica para ampliar a compreensão dos fatores imunológicos subjacentes à doença. Por exemplo, estudos de transferência passiva mostraram o impacto patogênico da IgG4 anti-MuSK na redução de clusters de AChR³. No entanto, existem algumas limitações para o modelo de transferência passiva, como as diferenças funcionais entre IgG e sistemas imunológicos humanos e de roedores e a insuficiência do modelo de transferência passiva para imitar os mecanismos iniciais de ativação da autoimunidade anti-MuSK que ocorre em tecidos linfóides.

Por outro lado, uma limitação potencial dos estudos de imunização é a variabilidade imunogenética entre diferentes linhagens de camundongos⁴. Por exemplo, enquanto os camundongos C57BL / 6 (B6) são suscetíveis à imunização ativa com AChR, os camundongos AKR / J são resistentes. Portanto, ao criar um modelo animal EAMG, é crucial selecionar corretamente a espécie animal, o método de imunização e o conteúdo do protocolo para refletir com precisão a doença⁵.

Além disso, o uso do antígeno alvo como uma proteína inteira geralmente resulta em altos títulos de anticorpos. No entanto, nem todos os anticorpos podem reagir de forma cruzada com o antígeno do camundongo ou produzir epítopos causadores de doenças. Portanto, os modelos de imunização ativa nem sempre refletem com precisão a patologia humana. No entanto, quando eles criam com sucesso um fenótipo clínico e fisiológico apropriado, esses modelos fornecem uma plataforma de longo prazo para testar terapias experimentais.

Estudos clínicos indicam mecanismos de doença divergentes e requisitos terapêuticos para a MG-Mu, destacando a necessidade de identificação adicional das características patogênicas específicas desse subtipo de MG ^4,5,6. Estudos anteriores de MuSK EAMG baseados em imunização ativa mostraram envolvimento predominante de imunidade do tipo Th2 e IgG1 anti-camundongo na autoimunidade MuSK e identificaram uma série de modalidades de tratamento potenciais (por exemplo, teriflunomida, células-tronco mesenquimais, FCRLB shRNA) para MuSK MG humano ^7,8,9. Isso demonstrou a importância do modelo MuSK EAMG no teste de novos alvos terapêuticos e na investigação da fisiopatologia do MuSK MG.

Neste artigo, foram detalhados os procedimentos para indução do modelo animal, monitoramento da progressão da doença e validação da indução de EAMG. A avaliação clínica envolveu o monitoramento de peso, postura, força de preensão e escores clínicos por um observador. Os camundongos foram sacrificados 28 dias após a segunda imunização, e vários tecidos, incluindo sangue, músculo dos membros posteriores, baço e linfonodos axilares e inguinais, foram coletados para confirmar o estabelecimento da doença. Os anticorpos anti-MuSK foram quantificados em soros usando o método ELISA. Além disso, a coloração imunofluorescente foi realizada nos tecidos musculares para visualizar depósitos na junção neuromuscular. Para demonstrar e comparar as respostas clínicas e imunes em grupos de camundongos com diferentes suscetibilidade a MuSK EAMG, camundongos tratados com KCNS3 shRNA apresentaram ação pró-inflamatória (não publicada) e FCRLB shRNA mostrou ação anti-inflamatória⁹, conforme determinado em estudos anteriores.

Protocolo

O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética Local para Experimentos em Animais da Universidade de Istambul (HADYEK) com o número de decisão 2020/29. Em nossos estudos anteriores ^7,8,9, o modelo EAMG foi induzido em camundongos BALB/c ou B6 de 8 a 10 semanas de idade por meio de imunização ativa com a proteína MuSK. Este artigo apresenta dados exemplares obtidos de diferentes experimentos usando camundongos BALB/C imunizados com MuSK (4-8 camundongos por grupo). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Produção e preparação de MuSK humano para imunização

1. Clone os aminoácidos de domínio extracelular MuSK humano 24-495 (Sequência de Referência NCBI: NP_005583.1) no vetor pPIC9.
2. Secretar expressão no sistema de levedura Pichia pastoris (cepa GS115).
3. Induzir a expressão pela adição de metanol (2,5% v/v) no meio de cultura.
4. Adicione uma tag C-terminal 6xHIS para fins de purificação.
5. Expresse a proteína como uma proteína glicosilada secretada e purifique-a sob condições nativas. Dialisar o meio de cultura contra tampão fosfato 50 mM pH 8,0, NaCl 300 mM.
6. Continuar com a cromatografia de afinidade de íons de níquel usando Ni²⁺/nitrilotriacetato agarose (Ni-NTA). Conservar a proteína purificada após a adição de glicerol a 10% a -80 °C, onde é estável durante, pelo menos, dois anos¹⁰.
   NOTA: Os níveis de expressão, estimados após a purificação de Ni-NTA, são de aproximadamente 0,4 mg/L de cultura. Nenhuma outra impureza proteica foi detectada nas amostras analisadas por SDS-PAGE.
7. Antes da imunização, verificar a pureza do domínio extracelular isolado da proteína MuSK por eletroforese em gel (Figura Suplementar 1).
8. Preparar o MuSK para cada ratinho a uma concentração de 45 μg/100 μL de PBS.
9. Homogeneizar (emulsionar) o MuSK na proporção de 1:1 com PBS (100 μL) e adjuvante completo de Freund (CFA-100 μL) contendo Mycobacterium tuberculosis H37Ra (10 mg/10 mL) (o volume total da emulsão é de 200 μL por camundongo).

2. Procedimento de anestesia e imunização

1. Antes da imunização, dilua o propofol em PBS (proporção de 1:5).
2. Administrar por via intraperitoneal a 50 mg/kg por ratinho.
   NOTA: O isoflurano também pode ser usado para anestesia por inalação (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). A concentração inicial é normalmente definida em 3%-5% com uma taxa de fluxo de oxigênio de 1-2 L/min, enquanto a concentração de manutenção é geralmente de 1%-3% com uma taxa de fluxo de oxigênio de 0,5-1 L/min.
3. Primeira imunização: Injete um total de 45 μg / 200 μL de MuSK preparado em CFA por via subcutânea nos ombros e patas traseiras internas (aproximadamente 11,25 μg / 50 μL para cada parte).
4. Segunda imunização: Injete um total de 45 μg / 200 μL de MuSK preparado em CFA por via subcutânea nos ombros e quadris (aproximadamente 11,25 μg / 50 μL para cada parte).
   NOTA: Administre as injeções duas vezes em um intervalo de 28 dias para estabelecer o modelo. A administração intramuscular está associada à dor muscular, que pode interferir na avaliação da fraqueza clínica. Como a EAMG é uma doença muscular, o uso de injeção intramuscular pode induzir fraqueza não miastênica relacionada à dor e, assim, atuar como um fator de confusão. Recomenda-se um grupo controle imunizado apenas com CFA (sem MuSK).

3. Pontuação clínica

1. Exercite os camundongos arrastando-os suavemente 40 vezes pela grade superior de uma gaiola enquanto eles tentam segurar a grade para induzir a fadiga, pois os sintomas de miastenia gravis em camundongos se tornam mais pronunciados após o exercício e a fadiga.
2. Após o exercício, observe cuidadosamente os camundongos quanto a mudanças na atividade, peso e força muscular. Atribua pontuações apropriadas com base nessas observações para orientar os critérios de avaliação.
   NOTA: Pontuação 0: Os ratos permanecem ativos e continuam a explorar seu ambiente; Pontuação 1: Uma postura curvada é observada após o exercício, mas os camundongos retornam à atividade e sociabilidade normais. A limpeza da pele é geralmente mantida. Pontuação 2: Uma postura curvada é visível mesmo antes do exercício e se torna mais pronunciada após o exercício. Observa-se uma diminuição na auto-higiene e na atividade. Pontuação 3: Uma postura curvada dramática é observada antes e depois do exercício. Há uma diminuição significativa no movimento, sociabilidade e força muscular, acompanhada por uma perda de peso de 1-2 gramas a cada 2-3 dias. Ocorre desidratação, dificultando o acesso dos ratos à água e à comida. A desidratação é identificada pela pele que não retorna rapidamente após ser pinçada e alterações nas fezes. Ratos com dor são caracterizados por apertar os olhos e uma postura curvada. Camundongos que mostram sinais de dor intensa e perda de peso superior a 20% são sacrificados. Pontuação 4: O rato é encontrado morto na gaiola. O rato falecido deve ser removido imediatamente e a gaiola deve ser trocada⁵.
3. Verifique os camundongos diariamente, pois os sintomas progrediram rapidamente aproximadamente 10 dias após a segunda imunização. Realize pontuação clínica e medições semanalmente durante os primeiros 28 dias e depois duas vezes por semana.
4. Realize a medição do peso.
   NOTA: A medição do peso fornece um parâmetro crucial para rastrear a progressão da doença. Devido às altas taxas metabólicas dos camundongos, o peso corporal pode variar significativamente. É importante usar a mesma balança para todas as medições e realizar essas medições na mesma hora do dia para manter a consistência.
5. Realize a medição da força muscular. Use um dinamômetro horizontal com um fio de grade para medir a força muscular.
   1. Exercite os camundongos para pontuação clínica, arrastando-os suavemente sobre a gaiola 40 vezes para induzir a fadiga.
   2. Coloque imediatamente cada mouse na grade do dinamômetro e puxe suavemente pela cauda, certificando-se de que todas as patas estejam firmemente segurando a grade. Considere apenas medições em que os ratos seguram a grade com as quatro patas.
      NOTA: Tente aplicar uma quantidade igual de força durante cada medição, e é recomendável que o mesmo pesquisador conduza todas as medições para manter a confiabilidade e reduzir a variabilidade. Como a fatigabilidade é a marca registrada da fraqueza da MG, uma série de testes de força de preensão deve ser realizada sem medir a força de preensão. Em seguida, foram realizadas sete medições para cada camundongo, e os valores máximo e mínimo foram descartados. A média das cinco medições restantes é calculada para garantir resultados confiáveis.

4. Preparação de amostras de tecido

NOTA: Sacrifique os camundongos 28 dias após a segunda imunização seguindo os protocolos aprovados institucionalmente. A coleta de sangue, músculos, baço e gânglios linfáticos dos camundongos sacrificados será benéfica para investigações futuras.

1. Coleta de sangue cardíaco
   NOTA: Para coletar sangue cardíaco, anestesiar os camundongos usando um anestésico adequado (por exemplo, propofol) aprovado pelo comitê de ética. A punção cardíaca requer anestesia e é um procedimento terminal, o que significa que os animais devem ser sacrificados imediatamente depois.
   1. Depois de anestesiar profundamente o rato, coloque-o de costas, abra o abdômen e localize o coração, aproximadamente 1 cm acima da costela mais baixa e ligeiramente para a direita.
   2. Usando uma agulha de 25-35 G, retire o sangue cuidadosamente do ventrículo esquerdo em um ângulo de 45 graus, sem mover a seringa, para evitar complicações¹¹.
   3. Transfira as amostras de sangue para tubos secos para separação de soro e/ou para tubos EDTA para isolamento de RNA - se planejado.
   4. Separar o soro por centrifugação e manter as amostras de soro a -20 °C até à sua utilização.
2. Preservação e preparação de amostras musculares
   1. Colete o músculo tibial anterior 11,12,13. Enxágüe com PBS gelado.
   2. Coloque as amostras em criotubos, mergulhe imediatamente no isopentano resfriado a nitrogênio líquido a -20 ° C e armazene em um freezer a -80 ° C.
      NOTA: As amostras devem ser congeladas para obter resultados mais precisos nos experimentos.
   3. Coloque os tecidos verticalmente em um suporte de secção; Uma rolha pode ser usada. Incorpore as amostras para coloração de imunofluorescência em OCT (composto de temperatura de corte ideal).
   4. Deixe o tecido flutuar em isopentano resfriado com nitrogênio líquido. Conservar num congelador a -80 °C até seccionar com um criostato.

5. Avaliação das junções neuromusculares via marcação por imunofluorescência

1. Secção e fixação do criostato
   1. Corte os tecidos congelados embebidos em OCT a -24 °C até uma espessura de 7 μm usando um criostato.
   2. Fixar as secções em acetona arrefecida a -20 °C. Lave com PBS por 5 min.
   3. Lave novamente PBS contendo 0,4% Triton X (PBS-T) por 10 min.
      NOTA: Uma etapa de permeabilização pode ser realizada para corrigir a conformação das moléculas afetadas pela fixação, garantindo uma ligação mais precisa. A permeabilização envolveu tratamento com PBS contendo 1% de FBS por 10 min e PBS-T por mais 10 min.
   4. Bloqueie as seções com PBS-T contendo 10% de FBS por 30 min para evitar encadernação inespecífica.
2. Coloração de imunofluorescência
   NOTA: Para a coloração, os seguintes anticorpos podem ser usados: C3, IgG, marcador do receptor de acetilcolina α-bungarotoxina.
   1. Dilua os anticorpos selecionados em PBS-T contendo 1% de FBS.
   2. Incube no escuro em temperatura ambiente por 2,5 h.
   3. Lave as seções com PBS-T contendo 1% de FBS.
   4. Contracoloração com DAPI.
   5. Armazenar as secções até ao exame ao microscópio de fluorescência num ambiente escuro e húmido a 4 °C.
   6. Realize imagens e análises.
      NOTA: As junções neuromusculares positivas para bungarotoxina (BTX) em cada seção devem ser contadas usando um microscópio de fluorescência. Capture imagens com ampliação de 20x. Para análise, as junções neuromusculares BTX e C3 ou IgG positivas foram contadas manualmente ao microscópio. A porcentagem de junções duplamente positivas em relação ao total de junções marcadas com BTX em seções seriais deve ser usada para análise.

6. Mancha ocidental

1. Isolamento e quantificação de proteínas
   1. Use amostras de músculo que são congeladas.
   2. Prepare o tampão de lise com inibidores de protease e fosfatase.
   3. Adicione grânulos de óxido de zircônio de 0,5 mm igual ao peso da amostra e 2x o volume do tampão de lise.
   4. Homogeneizar amostras usando um homogeneizador.
   5. Centrifugar lisado a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
   6. Recolher o sobrenadante que contém o lisado de proteínas.
   7. Use um kit de ensaio BCA ou reagente de Bradford para quantificar a concentração de proteína.
   8. Prepare amostras de proteínas para a concentração desejada com tampão de lise. 25 μg de proteína por poço é eficiente para mostrar AChR.
2. Eletroforese em gel SDS-PAGE
   1. Misture amostras de proteína com 4x tampão Laemmli.
   2. Aquecer as amostras a 95 °C durante 5 min para desnaturar.
   3. Carregue quantidades iguais de proteína e uma escada de proteína em poços de um gel SDS-PAGE.
   4. Execute o gel a 200 V por 30 min (o tempo pode variar entre as diferentes fontes de alimentação).
3. Transferência de proteínas
   1. Para transferência semi-seca com membrana de nitrocelulose, umedeça todos os componentes com um tampão de transferência a frio.
   2. Configure o sanduíche de transferência: esponja, papel de filtro, gel, membrana, papel de filtro, esponja.
      NOTA: Certifique-se de que não haja bolhas entre as camadas. O programa de transferência deve ser selecionado de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
4. Bloqueio e incubação de anticorpos
   1. Bloqueie a membrana em leite em pó desnatado a 5% ou BSA em TBST por 1 h em temperatura ambiente com um balanço suave.
   2. Incubar a membrana com anticorpo primário (anti-AChR) diluído em tampão de bloqueio a 2,5% durante a noite a 4 °C com balanço suave.
   3. Lave a membrana 3 vezes por 10 min cada em TBST.
   4. Incubar a membrana com anticorpo secundário conjugado com HRP (IgG HRP) diluído em tampão de bloqueio a 2,5% por 1 h à temperatura ambiente.
   5. Lave a membrana 3 vezes por 10 min cada em TBST.
5. Detecção e imagem
   1. Aplique substrato ECL na membrana de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Capture o sinal quimioluminescente usando um sistema de imagem.
   3. Analise as bandas usando um software de imagem.
      NOTA: Sempre mantenha proteínas e reagentes no gelo para evitar a degradação. Garanta uma carga igual executando uma proteína de manutenção (por exemplo, beta-actina, alfa-tubulina ou GAPDH) como controle. Otimize as concentrações de anticorpos e os tempos de incubação para obter melhores resultados. Mostrar que a proteína AChR é menos expressa em camundongos imunizados com MuSK é crucial.

7. ELISA anti-MuSK IgG caseiro

1. Prepare o antígeno MuSK a uma concentração de 0,5 μg por poço em 100 μL de tampão carbonato de bicarbonato (revestimento de placa).
2. Dispensar 100 μL da solução de antigénio em cada alvéolo de uma placa de imunoensaio.
3. Incubar a placa durante a noite a 4 °C.
4. Lave a placa com PBS contendo 0,5% de Tween 20 (solução de lavagem).
5. Incube a placa com PBS contendo 5% de FBS (solução de bloqueio) por 90 min a 4 ° C para bloquear locais de ligação inespecíficos (bloqueio).
6. Como os estudos de otimização mostraram altos níveis de MuSK-IgG, diluir as amostras de soro 1/50.000 em solução bloqueadora.
7. Sem lavar após o bloqueio, adicione as amostras de soro diluídas aos poços.
8. Incubar a placa a 37 °C durante 90 min.
9. Lave a placa três vezes com a solução de lavagem.
10. Diluir anticorpo secundário IgG de camundongo conjugado com HRP (ab97023) 1/5000 em solução de bloqueio.
11. Adicione 100 μL do anticorpo secundário diluído a cada poço.
12. Incubar a placa a 37 °C durante 90 min.
13. Lave a placa três vezes com a solução de lavagem.
14. Adicione 100 μL de substrato TMB a cada poço e observe a mudança de cor.
15. Pare a reação em um momento apropriado usando 2 M H₂SO_4.
16. Medir a densidade óptica a 450 nm com um espectrofotómetro.
17. Execute todas as amostras em duplicatas e na mesma placa para consistência.
    NOTA: Os valores de densidade óptica devem ser usados para análise, pois não havia diluições padrão da amostra disponíveis. Não deve haver mudança de cor nos poços de controle negativo (em branco). Espera-se uma rápida mudança de cor, portanto, a solução de parada deve ser mantida próxima para interromper imediatamente a reação nos poços.

Resultados

Ao avaliar e validar o modelo MuSK Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis (EAMG), vários parâmetros-chave e resultados experimentais são críticos para demonstrar a indução e caracterização bem-sucedidas do modelo da doença. Abaixo estão os resultados representativos que confirmam o estabelecimento do modelo MuSK EAMG.

Pontuação clínica
Os camundongos são monitorados e pontuados quanto aos sintomas clínicos de miastenia gravis usando um sistema de pontuação clínica padron...

Discussão

O MuSK-EAMG murino imita o MuSK-MG humano tanto em seus aspectos clínicos quanto imunopatogênicos em termos de fraqueza muscular, perda de peso devido à fraqueza muscular bulbar, anticorpos anti-MuSK circulantes e redução da AChR muscular. Quanto aos marcos e cronograma previsto para este modelo MuSK-EAMG, os sinais clínicos de fraqueza muscular devem aparecer na primeira semana após a segunda imunização. Aproximadamente 5% dos camundongos podem desenvolver sinais da doença após a primei...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
125I-α-bungarotoxina	Invitrogen	BTX T1175
2-Metilbutano	Sigma-Aldrich	M32631
40 μ m Filtro de células	NEST	258369
placa Maxisorp de 96 poços	Sigma-Aldrich	M9410
Adjuvante incompleto	Becton Dickinson & Co.	263910
Anti-AChR alfa1	Alomone	ANC-001
Anti-mouse IgG HRP	Abcam	ab97023
Liquidificador de Balas Storm	Next Advance		Homogeneizador de tecidos
C3	Novus	NB200-540G
Tampão de carbonato-bicarbonato	Merck	C3041
Cryostat	Leica	CM1860
Dinamômetro Imada DST-50N	Muromachi	MK380Si
Microscópio de fluorescência	Leica	DM4M
Seringa de vidro com trava luer ISOLAB		094.92.005
IgG	Abcam ab96871
Fotômetro de microplaca, Multiskan FC	Thermo Scientific	51119000
Kit cirúrgico de mouse	Kent Scientific Corparation	INSMOUSEKIT
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	Becton Dickinson & Co.
de AGR1180		Científica de Ágar Composto	OCT
, 1 mL	Becton Dickinson & Co.
Seringas, 2 mL	B. Braun	7389
Limitador de animais universal	Merck	Z756911-1EA
Kit de detecção de manchas Western Sirius-Western	Advansta	K-12043-D10	ECL