Este artigo apresenta um método para monitoramento quantitativo em tempo real das concentrações de íons cálcio (Ca2+) em células usando imagens de Ca2+ de célula única com o corante Fura-2/AM. Essa técnica permite o carregamento eficiente de corantes e o cálculo preciso dos níveis de Ca2+ por meio de taxas de intensidade de fluorescência, tornando-a uma abordagem simples e rápida para aplicações de pesquisa.
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Artigo de método
Imagem de cálcio de célula única para estudar a ativação de canais de íons de cálcio
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imagem de Ca2+ de célula única é essencial para o estudo dos canais de Ca2+ ativados por vários estímulos, como temperatura, voltagem, composto nativo e produtos químicos et al. Ele se baseia principalmente na tecnologia de imagem de microscopia e no indicador Ca2+ relacionado Fura-2 / AM (AM é a abreviatura de éster acetoximetílico). Dentro das células, Fura-2 / AM é hidrolisado por esterases em Fura-2, que pode se ligar reversivelmente ao Ca2+ citoplasmático livre. O comprimento de onda máximo de excitação muda de 380 nm para 340 nm (quando saturado com Ca2+) após a ligação. A intensidade de fluorescência emitida está quantitativamente relacionada à concentração de Ca2+ ligado. Ao medir a razão 340/380, a concentração de Ca2+ no citoplasma pode ser determinada, eliminando erros causados por variações na eficiência de carregamento da sonda fluorescente entre diferentes amostras. Essa tecnologia permite o monitoramento em tempo real, quantitativo e simultâneo das alterações de Ca2+ em várias células. Os resultados são armazenados em ". XLSX" para análise posterior, que é rápida e gera curvas de mudança intuitivas, melhorando muito a eficiência da detecção. A partir de diferentes perspectivas experimentais, este artigo lista o uso dessa tecnologia para detectar sinais de Ca2+ em células com proteínas de canal endógenas ou superexpressas. Enquanto isso, diferentes métodos de ativação de células também foram mostrados e comparados. O objetivo é fornecer aos leitores uma compreensão mais clara do uso e das aplicações da imagem de Ca2+ de célula única.
Introdução
O Ca2+ desempenha um papel crucial na transdução do sinal celular, regulando várias funções celulares, como contração muscular1, condução nervosa2, secreção3 e expressão gênica4, influenciando assim vários processos fisiológicos. Concentrações anormais de Ca2+ podem levar a doenças como arritmias5, distúrbios de coagulação6 e desequilíbrios hormonais7. Portanto, estudar os mecanismos de mudanças na concentração intracelular de Ca2+ é de ....
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Protocolo
Os métodos experimentais foram aprovados e seguiram as diretrizes da IACUC da Universidade de Tsinghua e da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim. Este protocolo introduz métodos de imagem de Ca2+ de célula única para vários tipos de células, incluindo queratinócitos primários isolados da pele de vários camundongos recém-nascidos (dentro de três dias após o nascimento, com irmãos de ninhada randomizados por sexo, camundongos C57BL / 6). Os detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação celular....
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Resultados
Detecção de resposta de temperatura
Queratinócitos primários
Os queratinócitos primários foram isolados de camundongos recém-nascidos e preparados de acordo com protocolos estabelecidos10. Essas células foram semeadas em placas de 24 poços contendo lâminas de vidro. Após o carregamento da sonda Fura-2, o foco foi ajustado ao microscópio em um comprimento de onda de 380 nm para obter uma visualização clara da morfologia celular, conforme ilustrado na
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Discussão
A aplicação de sistemas de imagem de Ca2+ de célula única é extensa, permitindo o estudo de sinais de Ca2+ em vários tipos de células, incluindo queratinócitos, células-tronco16, células hepáticas, células cardíacas17, podócitos18, células imunes e linhagens celulares superexpressando proteínas-alvo10,19. Essa técnica mede mudanças e val.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Reconhecimento é dado a Bailong Xiao da Universidade de Tsinghua por compartilhar o sistema de imagem de célula única Ca2+ e o sistema operacional de controle de temperatura, bem como pelo apoio e assistência neste projeto. Esta pesquisa foi financiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32000705), o Programa de Patrocínio de Jovens Cientistas de Elite da Associação Chinesa de Medicina Chinesa (CACM-(2021–QNRC2–B11)), Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (2020–JYB–XJSJ–026), (2024-JYB-KYPT-06).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Câmera | Nikon | ||
| Capsaicine | Sigma | 211275 | |
| CL-100 controlador de temperatura | Warner Instruments | ||
| Ácido Ciclopiazônico (CPA) | Sigma | C1530 | |
| DG-4 light | Sutter Instrument Company | ||
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Amresco | 231 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Software de imagem de fluorescência (MetaFluor, software pago) | Molecular Devices | ||
| Nikon | |||
| Fura-2/AM | Invitrogen | F1201 | |
| HBSS buffer | Gibco | 14175103 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| Pluronic F-127 | Beyotime | ST501 | |
| poli-D-lisina | Dispositivo | ST508 | |
| SC-20 | Harvard Apparatus | ||
| Fonte de luz branca | Nikon |
Referências
- Murthy, K. S. Signaling for contraction and relaxation in smooth muscle of the gut. Annu Rev Physiol. 68, 345-374 (2006).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--eeg, ecog, lfp and spikes. Nat Rev Neurosc....
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Reimpressões e permissões
