Artigo de método

Registro de correntes retificadoras internas de K+ em células musculares lisas da artéria basilar recém-isoladas pela técnica de patch clamp

DOI:

10.3791/67414

⸱

7 de fevereiro de 2025

 ,  , 
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Research Center, Fenyang College, Shanxi Medical University

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve um método rápido e eficiente para isolar células musculares lisas da artéria basilar de rato e registrar as correntes retificadoras internas dos canais de potássio nessas células usando a técnica de patch clamp de células inteiras. Ele oferece uma nova abordagem para pesquisadores que estudam a artéria basilar e os canais iônicos.

Resumo

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A doença cerebrovascular é uma condição prevalente entre os idosos, com sua incidência aumentando constantemente. A artéria basilar é um vaso cerebral crítico que supre a ponte, o cerebelo, as regiões posteriores do cérebro e o ouvido interno. A atividade do canal de potássio (K+) desempenha um papel significativo na determinação do tônus vascular, regulando o potencial da membrana celular. A ativação dos canais retificadores internos de K+ (Kir), como outros canais de K+ , leva à hiperpolarização e vasodilatação da membrana celular. Neste estudo, células musculares lisas recém-isoladas da artéria basilar foram usadas para registrar as correntes de Kir por meio da técnica de patch clamp de células inteiras. Foram investigados os efeitos de 100 μmol/L de BaCl2, um inibidor do canal de Kir, e 10 μmol/L de nitroprussiato de sódio (SNP), um nitrovasodilatador, sobre as correntes do canal de Kir. Os resultados demonstraram que o BaCl2 inibiu as correntes do canal Kir nas células musculares lisas da artéria basilar, enquanto o SNP aumentou essas correntes. Este protocolo fornece um guia abrangente para preparar células musculares lisas arteriais recém-isoladas e registrar as correntes do canal Kir usando a técnica de patch clamp, oferecendo um recurso valioso para pesquisadores que buscam dominar esse método.

Introdução

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A doença cerebrovascular é uma condição prevalente na população idosa. Com melhorias nos padrões de vida, aumento da expectativa de vida e envelhecimento da população, a incidência de doenças cerebrovasculares está aumentando constantemente1. A artéria basilar, um vaso não pareado formado pela fusão das artérias vertebrais bilaterais, corre abaixo da ponte dentro do crânio e se divide em duas artérias cerebrais posteriores. Ele supre a ponte, o cerebelo, as regiões posteriores do cérebro e o ouvido interno. O suprimento insuficiente de sangue para a artéria basilar pode levar a vertigem episódica, muitas vezes acompanhada de náuseas e vômitos. Os pacientes também podem apresentar sintomas como zumbido, perda auditiva e outros problemas relacionados. Esses sintomas são frequentemente associados a condições como espondilose cervical, aterosclerose cerebral e pressão arterial anormal. A doença cerebrovascular, particularmente prevalente entre indivíduos de meia-idade e idosos, está frequentemente ligada a essas condições subjacentes 2,3,4.

As artérias de resistência desempenham um papel vital na função cardiovascular e na manutenção da homeostase corporal. Como local primário de resistência vascular, regulam a pressão arterial e o débito cardíaco, garantindo fluxo sanguíneo suficiente para atender às demandas metabólicas e fisiológicas dos tecidos e órgãos5. A artéria basilar, classificada como uma artéria de resistência, regula principalmente o fluxo sanguíneo para o tronco encefálico6. As células musculares lisas, que formam as paredes das artérias de resistência, são mediadores chave da resistência vascular por meio da regulação da contração em estado estacionário ou tensão vascular. Essas células abrigam numerosos canais iônicos, incluindo canais de K+, canais de Ca2+ e canais de Cl-, que são críticos para a modulação do tônus vascular 5,7.

Os canais de K+ são críticos para estabelecer o potencial de membrana e regular o tônus contrátil das células musculares lisas arteriais8. Existem quatro tipos de canais de K+ no músculo liso arterial: K+ dependente de voltagem (Kᴠ), K+ dependente de Ca2+ (KCa), K+ dependente de ATP (KATP) e canais retificadores internos de K+ (Kir) 9,10,11. Os canais Kir são categorizados em sete subtipos, sendo Kir2.x canais Kir clássicos. Dentre estas, as subfamílias Kir2.x são as mais relevantes na vasculatura. As correntes Kir exibem retificação interna em tensões negativas, indicando um influxo líquido de K + na célula, enquanto em tensões positivas, há fluxo de corrente líquido de K + mínimo ou nenhum 5. No sistema cardiovascular, os canais de Kir são essenciais para estabilizar o potencial de membrana. Sua ativação induz hiperpolarização e vasodilatação da membrana celular 12,13,14.

Experimentos de patch-clamp em células musculares lisas recém-isoladas foram conduzidos em várias artérias, incluindo artérias coronárias, cerebrais, renais e mesentéricas15,16. Embora alguns métodos utilizem o mesmo tipo de colagenase para isolamento celular, os procedimentos precisos variam. Poucos estudos resumiram de forma abrangente os métodos de isolamento das células musculares lisas vasculares. Portanto, este estudo se concentra no isolamento fresco de células musculares lisas vasculares primárias da artéria basilar de ratos e no registro das correntes do canal Kir nessas células usando a técnica de patch clamp de células inteiras, fornecendo um protocolo detalhado e completo para pesquisadores em áreas afins.

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Protocolo

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O protocolo animal foi aprovado pelo Comitê de Ética de Bem-Estar Animal do Laboratório de Medicina Tradicional Chinesa da Universidade de Chengdu (Registro nº 2024035). Ratos machos da raça Sprague-Dawley (SD), pesando 260-300 g e com idade entre 8 e 10 semanas, foram utilizados neste estudo. Os animais receberam água e ração (ração experimental SPF) ad libitum. Os detalhes dos reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Dissecção da artéria basilar do rato

  1. Preparação da solução
    1. Prepare as soluções conforme descrito na Tabela 1.
  2. Anestesiar o rato por inalação de isoflurano a 2%. Confirme a anestesia profunda usando uma pinça no dedo do pé. Se necessário, administre anestésicos adicionais. Prossiga imediatamente para abrir o crânio e expor o cérebro na mesa de operação portátil.
  3. Transfira rapidamente o cérebro para uma placa de Petri contendo PSS saturada com 95% de O2 e 5% de CO2 a 4 ° C. Certifique-se de que a solução tenha um pH de 7,40.
  4. Posicione o cérebro ventralmente para cima em uma placa de Petri e prenda-o com agulhas. Sob um microscópio óptico, localize a artéria basilar e remova cuidadosamente o tecido circundante usando uma pinça e tesoura autoclavadas (ver Figura 1A).
  5. Insira um fio de 2 cm de comprimento com um diâmetro de 25 μm na artéria basilar isolada. Esfregue suavemente a parede interna com o fio para remover efetivamente o endotélio vascular.
    NOTA: A artéria basilar em ratos está situada dentro dos sulcos basais do tronco encefálico na base do cérebro e é formada pela confluência das artérias vertebrais esquerda e direita2. Durante o processo de isolamento, manuseie a artéria com cuidado para evitar alongamento ou compressão excessiva que pode resultar em danos.

2. Isolamento de células musculares lisas

  1. Pré-aqueça 1 mL de solução de separação celular, 1 mL de hidrolisado enzimático I e 1 mL de hidrolisado enzimático II a 37 ° C nos tubos de ensaio 1, 2 e 3, respectivamente (ver Figura 1B).
  2. Transfira a artéria basilar isolada para o tubo de ensaio 2. Injete continuamente uma mistura de 95% de O2 e 5% de CO2 no tubo e mantenha o tratamento enzimático por 30 min (ver Figura 1C).
  3. Transfira a artéria basilar do tubo de ensaio 2 para o tubo de ensaio 3. Continue injetando 95% de O2 e 5% de CO2 no tubo e mantenha o tratamento enzimático por 5 min (ver Figura 1D).
  4. Adicione 1 mL de solução de separação de células a 37 °C do tubo de ensaio 1 no tubo de ensaio 3. Continue injetando 95% de O2 e 5% de CO2 , mantendo o tratamento enzimático por 3 min. Triturar a preparação da artéria basilar para liberar células (ver Figura 1E).
  5. Adicionar a solução de separação a 4 °C ao tubo de ensaio 3 para terminar o processo enzimático (ver figura 1F). Centrifugue a mistura a 59 × g por 6 min. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta, adicionar novamente a solução de separação a 4 °C (ver figura 1G) e repetir a centrifugação duas vezes para remover as enzimas residuais.
  6. Remova o sobrenadante usando uma pipeta e armazene 1 mL da suspensão celular a 4 ° C por até 6-8 h.
  7. Pegue 100 μL da suspensão celular e coloque-a no banho (ver Figura 1H). Adicione 1 mL de fluido extracelular ao banho e deixe as células assentarem por 40 minutos para se ligarem ao fundo (ver Figura 2).
    NOTA: Para células do grupo de tratamento (por exemplo, BaCl2 ou nitroprussiato de sódio), pré-incube com as respectivas substâncias à temperatura ambiente (22-26 ° C) por 40 min durante o período de fixação.

3. Gravação de corrente Kir usando grampo de patch de célula inteira

  1. Fabricação de micropipetas
    1. Ligue o extrator de micropipeta (consulte a Tabela de Materiais).
    2. Coloque um tubo de vidro (diâmetro externo: 1.5 mm, diâmetro interno: 1.10 mm, comprimento: 10 cm) no extrator. Selecione o Programa 1, clique em Enter e acesse o Programa 1. Execute um teste de rampa clicando em Rampa no painel de controle para medir o valor calorífico do tubo de vidro.
      NOTA: Edite o Programa 1 com os seguintes parâmetros: Calor: Rampa, Tração: 0, Velocidade: 25, Atraso: 1, Pressão: 500, Modo: Atraso, Aquecimento seguro ativado. O ensaio em rampa deve ser efectuado aquando da mudança de filamentos ou de tipos de pipetas de vidro. As micropipetas devem ter um diâmetro de ponta de ~1-2 μm e um comprimento de cone de aproximadamente 5 mm. Diâmetros de ponteira menores e cones mais longos resultam em maior resistência à pipeta.
    3. Insira um novo tubo de vidro e selecione Programa 1. Clique em Enter para fabricar a micropipeta.
  2. Gravando Kir Current
    1. Ligue os dispositivos de hardware sequencialmente: conversor digital-analógico, amplificador de sinal, micromanipulador, microscópio, câmera e computador.
    2. Inicie o software na seguinte ordem: câmera, amplificador de sinal e software de aquisição de dados.
      NOTA: Se um microscópio não estiver equipado com uma câmera, apenas o software do instrumento precisará ser ativado. Certifique-se de que o software seja aberto após a inicialização do hardware para habilitar a funcionalidade adequada.
    3. No software de aquisição de dados, selecione Arquivo > Definir nomes de arquivo de dados para estabelecer um caminho de armazenamento de dados.
    4. Edite o protocolo para registrar as correntes Kir da seguinte maneira:
      1. Interface de forma de onda: Época A & D: Tipo = passo; Primeiro nível = −60 mV; Nível delta = 0 mV; Primeira duração = 100 ms; Duração do delta = 0 ms. Época B: Tipo = etapa; Primeiro nível = −160 mV; Nível delta = 0 mV; Primeira duração = 1 ms; Duração do delta = 0 ms. Época C: Tipo = rampa; Primeiro nível = 40 mV; Nível delta = 20 mV; Primeira duração = 500 ms; Duração do delta = 0 ms.
      2. Interface de modo/taxa: Atraso de teste = 0 s; Corridas = 1; Varreduras = 1; Duração da varredura = 0,8 s.
      3. Interface de saída: Canal #0; Nível de retenção = −60 mV. Salve e nomeie o protocolo como "Protocolo Kir".
        NOTA: A configuração do protocolo é adaptada para gravações atuais específicas e pode ser reutilizada após salvar. Certifique-se de que a interface de saída corresponda à fiação do instrumento (por exemplo, Canal #0).
    5. Ative a função Teste de membrana no menu Ferramentas do software de aquisição de dados.
    6. Posicione a célula para medição no centro da câmera do microscópio view.
    7. Mergulhe a ponta do fio de referência na solução de banho. Encha 20% da micropipeta (fabricada na etapa 3.1) com a solução intracelular e prenda-a no suporte do eletrodo de registro.
      1. Aplique pressão positiva usando uma seringa, mova a ponta da pipeta para a solução de banho e ajuste o deslocamento da pipeta no sinal amplifier software para definir a linha de base atual para 0 pA (consulte a Figura 3A).
        NOTA: Use fios de referência Ag/AgCl. A resistência da pipeta deve ser de 4-6 MΩ.
    8. Pressione suavemente a pipeta contra a membrana celular. Observe um aumento na resistência da vedação (Rt) para pelo menos 1 MΩ (Figura 3B). Remova a pressão positiva e aplique pressão negativa para estabelecer uma alta resistência com Rt ≥ 1 GΩ (Figura 3C).
      1. Defina a tensão de retenção para −60 mV e compense a capacitância do eletrodo usando Cp Fast e Cp Slow (Figura 3D).
        NOTA: Se Rt permanecer acima de 1 GΩ, prossiga para a próxima etapa; caso contrário, substitua a célula ou pipeta e repita as etapas 3.2.6-3.2.8.
    9. Aplique uma breve pressão negativa para romper a membrana celular, formando uma configuração de célula inteira ( Figura 3E ). Selecione Whole Cell no sinal amplifier software, clique em Auto para compensação de capacitância de membrana (Figura 3F), carregue o protocolo Kir e inicie a gravação de dados. Repita as etapas 3.2.6-3.2.9 para células tratadas.
      NOTA: Se a resistência em série (Ra) for >30 MΩ, selecione uma nova célula. Se 30 MΩ > Ra > 10 MΩ, aplique a compensação de resistência em série antes de gravar. Este protocolo requer Ra < 10 MΩ.
  3. Analisando dados
    1. Abra o software de análise de dados e carregue os dados gravados. Use cursores para analisar traços atuais e exportar dados para plotagem de curva I-V.
    2. Crie um sinal de forma de onda de estímulo selecionando Editar > Criar sinal de forma de onda de estímulo e confirme.
    3. Exporte o rastreamento do protocolo Kir selecionando Editar > Transferir rastreamentos, especificando a região de rastreamento completa e o sinal (A0 #0) e copiando os dados para análise posterior.
    4. Exporte rastreamentos atuais Kir representativos selecionando Editar > Transferir Rastreamentos, especificando a região de rastreamento completa e o sinal (IN 0) e copiando dados para gerar gráficos de rastreamento atuais.
      NOTA: Normalize os dados atuais usando a densidade de corrente (pA/pF) para uma comparação precisa entre células de tamanhos variados. Certifique-se de que a capacitância da membrana (Cm) seja registrada durante o experimento17.

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Resultados

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Isolamento das células do músculo liso arterial
A primeira seção do procedimento detalha o processo de isolamento das células musculares lisas da artéria basilar cerebral do rato. Esse processo é ilustrado na Figura 1. O procedimento envolve digestão enzimática e etapas de separação celular para liberar células musculares lisas da artéria.

Imagens representativas de células musculares lisas isoladas
A segunda seção apresenta...

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Discussão

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O registro de células inteiras usando células recém-isoladas remonta ao início dos anos 198018, e o registro de correntes de canal de células musculares lisas basilares de roedores tornou-se amplamente praticado na década de 199019. Com os avanços tecnológicos, os pesquisadores estão cada vez mais focados nos resultados alcançados por meio dessas tecnologias. No entanto, a atenção dada à atualização e ao resumo dos métodos técnicos tem dimi...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo Programa Especial de Talentos da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu para o "Plano de Promoção da Pesquisa de Talentos Acadêmicos e Disciplinares de Xinglin" (33002324) e pelo Projeto Chave de Pesquisa e Desenvolvimento para a Introdução de Talentos Científicos e Tecnológicos de Alto Nível na Cidade de Luliang (2022RC28).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Albumina de soro bovinoSigma, EUAB2064
Cloreto de bárioMacklin Biochemical Co., Ltd., Xangai, ChinaB861682
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA501330
CâmeraHamamatsu, JapãoC11440
Software da câmeraImage J, EUAMicro-gerente 2.0.0-gammal
Collagenase FSigma, EUAC7926
Collagenase HSigma, EUAC8051
ComputadorLenovo, China~
Software de aquisição de dadosMolecular Devices, EUAClampex 10.4
Software de análise de dadosAxon, EUAclampfit 10.4
D-glicoseSangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA610219
Conversor digital-analógicoMolecular Devices, EUAAxon digidata 1550B
DithiothreitolSigma, USAD0632
Software de desenhoSan Diego, Califórnia, EUAGraphPad 
EGTASangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA600077
Tubo de vidroDL Naturegene Life Sciences.USAB150-86-10
HEPESXiya Reagent Co., Ltd., Shandong, ChinaS3872
KClSangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA100781
MgCl2· 6H2OSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100288
Micromanipuladorsutter, EUAMP285A
Micropipeta extratorsutter, EUAP1000
MicroscópioOlympus, JapãoIX73
Na2-ATPSigma, EUAA26209
Na2HPO4Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA610404
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA100241
NaH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA600878
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA100865
NaOHSangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA100173
PapaínaSigma, EUAP4762
Potássio-D-gluconatoSangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA507810
Amplificador de sinalMolecular Devices, EUAAxon MutiClamp 700B
Software amplificador de sinalMolecular Devices, EUAMultiClamp Commander software
Nitroprussiato de sódioSangon Biotech Co., Ltd., Xangai, ChinaA600867
Software de análise estatísticaSan Diego, Califórnia, EUAGraphPad 

Referências

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