Artigo de método

Formulação de Nanomateriais à Base de Zinco utilizando o Extrato de Casca de Eucommia ulmoides e seu Potencial de Cicatrização de Feridas

DOI:

10.3791/67416

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27 de dezembro de 2024

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1Biological Experiment Center, School of Life Sciences, Central South University, 2Department of Cell Biology, School of Life Sciences, Central South University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para sintetizar as nanopartículas de óxido de zinco (ZnO) usando o extrato aquoso rico em poliisopreno obtido da casca da árvore Eucommia ulmoides . O potencial de cicatrização de feridas exibido pelas nanopartículas de ZnO sintetizadas em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) foi avaliado usando o ensaio de arranhões, um método simples, econômico e eficiente.

Resumo

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O extrato aquoso da casca de Eucommia ulmoides serve como uma rica fonte de compostos bioativos com inúmeros benefícios à saúde. O protocolo aqui visa explorar a preparação de nanopartículas de óxido de zinco (ZnO) usando o extrato aquoso rico em poliisopreno mediado por casca de Eucommia ulmoides . Enquanto isso, o protocolo proposto está associado à preparação de material de cicatrização de feridas, facilitando o processo. Além disso, o potencial de cicatrização das nanopartículas sintetizadas (Eu-ZnO-NPs) foi avaliado usando um ensaio simples de arranhões em uma monocamada de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC). Após 24 h de tratamento com Eu-ZnO-NPs, a proliferação celular e a migração de células HUVEC foram avaliadas. No final do estudo, a proliferação e migração celular foram observadas em monocamada arranhada tratada com diferentes concentrações de Eu-ZnO-NPs, enquanto baixas taxas de migração e proliferação celular foram observadas em células controle. Das concentrações escolhidas, os nanomateriais de 20 μg/mL de Eu-ZnO apresentaram melhor migração celular e maior potencial de cicatrização de feridas.

Introdução

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Plantas medicinais e compostos derivados de plantas demonstraram exibir inúmeros benefícios à saúde1. A Organização Mundial da Saúde (OMS) informou que 80% da população global depende de plantas medicinais tradicionais para cuidados primários de saúde. A China é bem reconhecida e popular por suas práticas de Medicina Tradicional Chinesa (MTC). Foi relatado que as ervas medicinais chinesas tratam várias doenças e são utilizadas por seu potencial biológico. As plantas medicinais servem como reservatórios para compostos bioativos e múltiplos papéis terapêuticos. Plantas medicinais também têm sido utilizadas para tratar as feridas. Existem vários tipos de abordagens aplicadas para tratar feridas crônicas2. Uma investigação recente revelou que as plantas medicinais estavam envolvidas no processo de cicatrização de feridas, proporcionando condições favoráveis à cicatrização, livres de infecções e fixação da regeneração tecidual3. Enquanto isso, as propriedades antibacterianas e antifúngicas dos compostos bioativos presentes nas plantas medicinais podem ajudar a curar feridas e acelerar a eficiência da cicatrizaçãode feridas 4.

Os nanomateriais à base de metal estão ganhando atenção devido às suas propriedades biocompatíveis e biodegradáveis. Eucommia ulmoides, comumente chamada de seringueira chinesa, é uma espécie nativa da China. As folhas e a casca da árvore são usadas em práticas medicinais. Mais importante ainda, a espécie de planta foi cultivada nas províncias central e ocidental da China5. Peng et al.6relataram que folhas, cascas e flores estaminadas eram comestíveis com potencial terapêutico. Além disso, E. ulmoides serve como a melhor fonte de lignanas, fenilpropanóides, iridóides, flavonóides, aminoácidos e oligoelementos. Além disso, a casca tem sido utilizada para várias aplicações biomédicas, como controle da pressão arterial, redução de gordura e promoção de antiosteroporose e atividade hipoglicêmica7. Portanto, sem dúvida, foi comprovado que o extrato de casca de E. ulmoides tem uma longa história na medicina tradicional chinesa. Relatórios anteriores sugeriram que o poliisopreno polipolímero natural é rico nas cascas de Eucommia ulmoides8. Com base nas informações acima, o presente trabalho tem como objetivo fabricar nanomateriais utilizando extratos de casca de Eucommia ulmoides . A combinação de zinco com extrato de casca é uma escolha atraente para a preparação de nanomateriais. No geral, o objetivo final da presente investigação foi fabricar um novo nanomaterial híbrido para aplicações de cicatrização de feridas.

Protocolo

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NOTA: Antes de preparar o extrato, o material da casca obtido foi lavado duas vezes com água deionizada e seco em local sombreado. As cascas secas à sombra foram armazenadas em um recipiente hermético.

1. Preparação do extrato de casca de Eucommia ulmoides

  1. Pique a casca coletada da árvore Eucommia ulmoides em pedaços pequenos usando uma tesoura.
  2. Lave os materiais da casca picada duas vezes com água destilada dupla.
  3. Seque os pedaços de casca a 37 °C durante 24 h em condições de sombra.
    1. Ajuste a duração do processo de secagem com base na quantidade de casca utilizada para o estudo. Certifique-se de que as cascas estejam completamente secas antes de cortá-las em pedaços pequenos. Evite a luz solar direta.
  4. Transferir 20 g de cascas secas à sombra para um balão cónico contendo 220 ml de água bidestilada estéril e aquecer a 130 °C durante 20 min.
    1. A cor da solução de reação muda para amarelo claro. As mudanças na cor da solução ocorrem após 10 min. Deixe a solução aquecer por mais 10 min. Ajuste o volume de água bidestilada com base na quantidade da amostra.
  5. Conservar o extracto bruto contendo poliisopreno a 4 °C para posterior utilização. A formação de uma estrutura semelhante a um fio indica a presença de poliisopreno nos extratos.

2. Biossíntese de nanopartículas de ZnO mediadas pela casca de E. ulmoides

  1. Adicionar 1 M de nitrato de zinco di-hidratado de Zn (NO3)2 a 50 ml de água desionizada num balão cónico de 500 ml. Agitar continuamente com agitação magnética (60 RPM). O Zn (NO3)2 leva 30 min para se dissolver completamente.
  2. Adicione 15 mL de extrato de casca de E. ulmoides gota a gota a 20 mL de solução de nitrato de zinco 1 M di-hidratado (Zn (NO3)2).
  3. Coloque a mistura de reação coberta em um agitador magnético, ligue o agitador e gire a (60 RPM) por 3 h.
  4. Adicione 1 N de solução de hidróxido de sódio NaOH (3 mL) gota a gota à mistura de reação para ajustar o pH para 9. Adicione NaOH até que a mistura da solução fique branca leitosa e o pH não seja superior a 9. A solução torna-se uma cor branca leitosa quando as nanopartículas de ZnO são formadas.
    1. A preparação de 1 M de nitrato de zinco di-hidratado Zn (NO3)2 volume da solução pode variar de acordo com as necessidades experimentais. Certifique-se de usar os extratos de casca recém-preparados. Se o pH exceder 10, resultará na agregação de nanopartículas.
  5. Transferir os Eu-ZnO-NPs sintetizados para um tubo de centrifugação de 50 ml e centrifugá-lo a 100 xg durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: As impurezas podem ser evitadas por lavagem imediata.
  6. Recolher os Eu-ZnO-NPs lavados numa placa de vidro e secá-los a 45-50 °C durante 1 h numa estufa de ar quente.
    NOTA: Se os Eu-ZnO-NPs forem mantidos por mais de 30 min, pode afetar a natureza físico-química das nanopartículas

3. Confirmação de tamanho usando TEM

  1. Prepare 1 mg/mL de nanopartículas em DDH2O e carregue 5 μL de amostra de Eu-ZnO-NP na grade de cobre e espere até que seque completamente. Vortex a amostra antes de carregar na grade de cobre.
  2. Carregar a grelha de cobre que contém Eu-ZnO-NP no suporte de amostras MET e adquirir imagens com aumentos de 50x e 100x.
    NOTA: As grades devem ser recolhidas usando uma pinça durante esta etapa.

4. Avaliação da citotoxicidade

  1. Semeie 1 × 104 HUVECs em cada poço de uma placa de 96 poços e coloque-a em uma incubadora de 5% de CO2 37 ° C.
  2. Adicione 10 μL de várias concentrações 0, 10, 20, 30, 40 e 50 μg/mL de Eu-ZnO-NPs nas células confluentes de 90% e incube-as por 24 h.
  3. Após a incubação, remova o meio antigo sem perturbar as células, adicione 10 μL de solução de CCK-8 a cada poço contendo 90 μL de meio DMEM fresco e incube em uma incubadora de CO2,37 ° C a 5%.
  4. Medir a absorvância das células tratadas com solução de CCK8 a 450 nm utilizando um espectrofotómetro.
    NOTA: A absorbância foi medida imediatamente em 15 min para evitar alterações na absorbância.

5. Preparação de células HUVEC para ensaio de arranhões

  1. Semear uma quantidade apropriada (1 × 105) de HUVECs em 12 placas de cultura de poço contendo o meio Eagle modificado de Dulbecco com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de pen-strep e incubá-lo em uma incubadora de 5% de CO2 37 ° C.
    1. Antes de realizar o ensaio de arranhões, verifique a confluência usando o microscópio invertido.
      NOTA: Para realizar o ensaio de arranhões, serão utilizadas placas de 6 poços ou 12 placas com base nos requisitos, e a densidade celular variará para diferentes placas de cultura. O uso de 70% -80% de células confluentes é ideal e recomendado para ensaio de arranhões. O volume do meio DMEM pode variar de acordo com as placas de cultura utilizadas no estudo. Por exemplo, placas de 6 poços requerem 1-1,5 mL de meio de cultura e placas de 12 poços requerem 0,5-1,0 mL de meio de crescimento.
  2. Faça um arranhão suavemente usando uma ponta de pipeta estéril de 200 μL na ferida representativa com uma largura de ferida de 200 μm.
  3. Certifique-se de que a ponta usada para fazer arranhões na monocamada da célula entre em contato com a superfície das células.
    NOTA: Toda vez que um arranhão for feito, use a ponta estéril.
  4. Remova o meio completo e lave a monocamada HUVEC usando 1 mL de 1x PBS para remover as células destacadas.
    NOTA: Certifique-se de que as células monocamada separadas sejam completamente removidas dos respectivos poços. Confirme se nenhum dano ocorreu na área criada pela ferida.
  5. Para avaliar o potencial de cicatrização de Eu-ZnO-NPs sintetizados, adicione concentrações de 0 (Controle), 10 e 20 μg/mL de nanopartículas de Eu-ZnO combinadas com um meio completo com 10% de FBS nos poços. Manter as placas experimentais a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5%.
    NOTA: Não perturbe a monocamada celular ao adicionar o meio fresco e completo. Certifique-se de que as células monocamada permaneçam intactas durante a incubação.
  6. Adquira microfotografia em 0 h e 24 h usando um microscópio invertido. Use a ferramenta de anotação para medir o fechamento da ferida em diferentes intervalos de tempo.
    1. Calcule a porcentagem de fechamento da ferida usando a seguinte fórmula: Fechamento da ferida (%) = [(migração celular (em μm) em 0 h - migração celular (em μm) em 24 h)/ migração celular (em μm) em 0 h] x 100.

Resultados

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A presente investigação tem como objetivo sintetizar nanopartículas utilizando as cascas da árvore Eucommia ulmoides . O material da casca foi completamente seco em ambiente sombreado (Figura 1). Os materiais da casca foram utilizados para preparar o extrato bruto aquoso de água quente, aquecendo as amostras a 130 °C por 20 min. Uma ligeira alteração na temperatura e na duração pode perturbar os fitocompostos e torná-los inadequados para a preparação do extrato aquoso. Os extratos aquosos brutos da casca de E. ulmoides foram preparados e utilizados para a síntese de nanopartículas (Figura 2). O extrato preparado pode ser utilizado imediatamente. O extrato armazenado por um período prolongado pode influenciar o processo de síntese. Portanto, um extrato recém-preparado é recomendado para a preparação de nanopartículas.

A síntese bem-sucedida de NPs de ZnO mediadas por extrato bruto de casca foi confirmada pelo aparecimento de uma cor branca leitosa e uma mudança no pH (Figura 3). O pH está intimamente ligado ao tamanho das nanopartículas, e um pH superior a 9 resulta em aglomeração e tamanho desigual. A estrutura do nanomaterial sintetizado foi confirmada usando análise TEM, e as nanopartículas sintetizadas exibiram um tamanho de partícula de 80-90 nm, conforme representado na Figura 4. O NaOH deve ser adicionado gota a gota para evitar uma mudança repentina na mistura de reação. As nanoformulações à base de metal são adequadas, baratas e menos tóxicas. No entanto, os nanomateriais à base de metal são bem conhecidos por suas funções biológicas.

A citotoxicidade de Eu-ZnO-NPs contra células HUVECs foi determinada pelo ensaio CCK-8 com a exposição de diferentes concentrações de Eu-ZnO-NPs por 24 h. Os resultados indicaram que os Eu-ZnO-NPs não exibiram alterações perceptíveis na citotoxicidade das células HUVECs na concentração mais alta de 50 μg / mL (Figura 5). A quantidade adequada de células foi carregada e um tamanho uniforme das feridas foi feito usando uma ponta de pipeta estéril de 200 μL. O volume celular que excede o limite pode causar uma mudança no pH e uma taxa de proliferação mais lenta. As migrações de células e o fechamento da ferida foram observados no grupo de tratamento após 24 h de tratamento, enquanto nenhuma alteração semelhante foi observada no controle. Os resultados da atividade de cicatrização de feridas revelaram que os Eu-ZnO-NPs sintetizados mostraram propriedades de cicatrização de feridas em linhagens celulares HUVECs. Uma concentração de 20 μg/mL de nanomateriais Eu-ZnO promove uma migração celular mais rápida e propriedades aprimoradas de cicatrização de feridas. Mais importante ainda, as nanopartículas de Eu-ZnO sintetizadas exibiram um modo de ação dependente da concentração. Além disso, após 24 h de tratamento, a proliferação e migração celular foram observadas em monocamada arranhada e, enquanto a baixa migração celular e taxa de proliferação foram observadas em células controle (Figura 6). A porcentagem de fechamento da ferida foi de 16% para o controle, seguida de 51% para os grupos tratados com 10 μg/mL e 81,5% para os grupos tratados com 20 μg/mL após 24 h (Figura 7).

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Figura 1: Coleção de pedaços de casca de Eucommia ulmoides . Imagem da casca de Eucommia ulmoides usada para preparar o extrato aquoso de água quente. Antes da extração, as cascas devem ser bem lavadas para remover as impurezas e completamente secas à sombra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Preparação do extrato da casca de Eucommia ulmoides : Imagem dos extratos da casca de Eucommia ulmoides utilizados para sintetizar as nanopartículas. O extrato de casca de Eucommia ulmoides de 200 mL foi preparado usando 20 g de pedaços de casca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Síntese de nanopartículas de ZnO mediadas por casca de Eucommia ulmoides . A imagem mostra a formação de nanopartículas de Eu-ZnO e a solução de cor branca leitosa representa a formação de nanopartículas de Eu-ZnO. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Análise de microscopia eletrônica de transmissão: A imagem mostra diferentes ampliações de nanopartículas de ZnO mediadas por casca de Eucommia ulmoides (A) ampliação de 100 nm e (B) ampliação de 50 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Ensaio de viabilidade celular CCK-8. Os gráficos de barras representam a viabilidade das células após serem tratadas com diferentes concentrações de 0-50 μg/mL, enquanto as células sem tratamento servem como controle negativo. Os dados representam média e desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Ensaio de arranhões para avaliação do fechamento da ferida. As células foram tratadas com NPs de EU-ZnO sintetizadas (10 μg/mL e 20 μg/mL) e sem NPs de EU-ZnO (grupo controle) e incubadas por 24 h. A proliferação e migração celular foram observadas nas células tratadas com EU-ZnO NPs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Porcentagem de fechamento da ferida. Os gráficos de barras representam a porcentagem de fechamento da ferida na monocamada HUVEC com e sem tratamento EU-ZnO NP em 0 h e 24 h. Os dados representam média e desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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Acredita-se que a casca, a semente e as folhas de E. ulmoides exibam inúmeros benefícios à saúde. Nossos resultados mostraram que a síntese de nanopartículas de EU-ZnO foi alcançada usando uma abordagem simples e econômica. O extrato aquoso foi utilizado para sintetizar as nanopartículas. O aquecimento do material da casca em altas temperaturas pode causar degradação de alguns fitoconstituintes e diminuir a eficiência da extração. Os fitoconstituintes presentes no extrato aquoso de ervas podem reduzir os íons metálicos para formar nanopartículas. O nitrato de zinco di-hidratado é utilizado para a preparação de nanopartículas de ZnO por suas propriedades biocompatíveis e altamente estáveis9. O uso de elementos metálicos causadores de toxicidade mínima a alta para sintetizar ou projetar os nanomateriais é arriscado e não pode ser usado para alegações biomédicas. Esta síntese pode ser realizada em um dia (24 h). No entanto, metais livres de tóxicos e materiais biocompatíveis são considerados seguros e utilizados para avaliar a eficiência da cicatrização de feridas. A principal razão por trás da aglomeração de nanopartículas sintetizadas são as ligações fitoquímicas. A aglomeração de nanopartículas deveu-se à natureza atrativa das interações de Van der Waal e às forças atrativas entre a superfície10,11. A aglomeração de nanopartículas pode influenciar as propriedades físicas e ópticas. O tamanho e a forma das nanopartículas podem ser modificados usando calcinação e recozimento12. A ressuspensão de nanomateriais em água deionizada e sonicação pode ajudar a evitar a aglomeração de nanopartículas. A presença de compostos bioativos ou grupos funcionais no extrato aquoso provavelmente envolverá no processo de redução. O rendimento das nanopartículas depende exclusivamente do volume da mistura de reação usada para o processo de síntese. A síntese de nanopartículas em larga escala tem várias limitações, incluindo aglomeração e tamanho de partícula não uniforme.

Semelhante aos nossos achados, Aydin Acar et al.13 relataram que as nanopartículas de ZnO mediadas por extrato de flores de Calendula officinalis exibiram propriedades de cicatrização de feridas em células L929 com 69,1% de fechamento de feridas. Além disso, as nanopartículas de ZnO mediadas por folhas de Crotalaria verrucosa exibiram potencial de cicatrização de feridas na concentração de 5 μg/mL em linhagens celulares HeLA com 40,45% de fechamento de feridas14. Zhang et al.15relataram que as nanopartículas de ZnO sintetizadas usando Euphorbia fischeriana apresentaram propriedades cicatrizantes significativas nas concentrações de 10 e 15 μg/mL. Esses estudos provaram que a nanoformulação sintetizada pode ser usada como agente cicatrizante. Os resultados da pesquisa desses estudos mostraram que os compostos sintetizados podem reparar a ferida e ajudar na reepitelização em grupos de tratamento.

A hemostasia e a migração celular são consideradas processos importantes na cicatrização de feridas. O arranhão criado na monocamada de HUVECs foi feito usando pontas de pipeta para mimetizar feridas artificiais. Além disso, criar feridas com as mesmas larguras é bastante complicado e complicado. Por outro lado, este é um método mais barato. Neste ensaio, observou-se que as nanopartículas projetadas apresentaram excelentes propriedades cicatrizantes nos HUVECs em concentrações de 10-20 μg/mL em comparação com o controle. Além disso, os Eu-ZnO-NPs sintetizados têm o poder de reparar a ferida criada na monocamada celular sem causar efeitos tóxicos. Esses experimentos in vitro podem ser usados para identificar a eficácia de nanomateriais à base de polímeros sintetizados usando modelos animais.

Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar

Agradecimentos

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Os autores gostariam de agradecer sinceramente ao Departamento de Biologia Celular da Universidade Central do Sul, Changsha, China, por fornecer as instalações de instrumentação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de 12 poçosNEST703011Usada para cultura de células e ensaio
CentrífugaSCILOGEXSC1406Usada para separar as nanopartículas da mistura coloidal
Tubo de Centrífuga – 15 mLBIOFILCFT-312150Para centrifugar a solução sintetizada 
Tubo de centrífuga – 5 mLBiosharp BS-50-CM-SPara armazenar as nanopartículas
CO2 incubadoraThermo scientific3010Para cultivar as células HUVEC
Água sem ruídoMilliporeNão aplicável Para preparação do extrato 
Meio DMEMCytivaSH30243.01Usado para trabalho de cultura de células
FunilThermo scientific42600060Para segurar o papel de filtro durante a filtração
Copos de vidroBorosilicato 1102-50Usado para preparar o extrato aquoso
Forno de ar quenteGenetimesNão Aplicável Usado para secar as nanopartículas e coletar na forma de pó
Agitador magnéticoKYLIN-BELLGL-5250-AUsado para síntese de nanopartículas
MicroscópioNikon EclipseTs2Usado para tirar microfotografias 
Placa de PetriNEST753001Usada para coletar as nanopartículas 
Pipeta 1 mLCiência de Laboratório YEA17AD0055580Para tomar/adicionar o volume específico de solução/extrato
Ponteiras de pipeta 1 mLSAINING 3014200-TPara pegar/adicionar o volume específico de solução/extrato
Misturador Magnético PTFE Barras de AgitaçãoLAN RANNão aplicável Usado para o processo de síntese de nanomateriais
Hidróxido de sódioSigma Alrich71690Usado para ajustar o pH durante a síntese
Tesoura de Aço InoxidávelDeli6034Usado para cortar os materiais da casca
Frasco de cultura de tecidos T25NEST707001Usado para manter as células 
Balança de pesagem Radwag AS220R2Usado para pesar os produtos químicos 
Papel de filtro Whatman No.1NewstarGB/T1914-2017Usado para filtrar o extrato para síntese
Nitrato de zinco Sigma Alrich13778-30-8Usado como precursor para a nanopartícula ' síntese

Referências

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