Aqui, apresentamos um protocolo para sintetizar as nanopartículas de óxido de zinco (ZnO) usando o extrato aquoso rico em poliisopreno obtido da casca da árvore Eucommia ulmoides . O potencial de cicatrização de feridas exibido pelas nanopartículas de ZnO sintetizadas em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) foi avaliado usando o ensaio de arranhões, um método simples, econômico e eficiente.
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Artigo de método
Formulação de Nanomateriais à Base de Zinco utilizando o Extrato de Casca de Eucommia ulmoides e seu Potencial de Cicatrização de Feridas
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Resumo
Resumo
O extrato aquoso da casca de Eucommia ulmoides serve como uma rica fonte de compostos bioativos com inúmeros benefícios à saúde. O protocolo aqui visa explorar a preparação de nanopartículas de óxido de zinco (ZnO) usando o extrato aquoso rico em poliisopreno mediado por casca de Eucommia ulmoides . Enquanto isso, o protocolo proposto está associado à preparação de material de cicatrização de feridas, facilitando o processo. Além disso, o potencial de cicatrização das nanopartículas sintetizadas (Eu-ZnO-NPs) foi avaliado usando um ensaio simples de arranhões em uma monocamada de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC). Após 24 h de tratamento com Eu-ZnO-NPs, a proliferação celular e a migração de células HUVEC foram avaliadas. No final do estudo, a proliferação e migração celular foram observadas em monocamada arranhada tratada com diferentes concentrações de Eu-ZnO-NPs, enquanto baixas taxas de migração e proliferação celular foram observadas em células controle. Das concentrações escolhidas, os nanomateriais de 20 μg/mL de Eu-ZnO apresentaram melhor migração celular e maior potencial de cicatrização de feridas.
Introdução
Plantas medicinais e compostos derivados de plantas demonstraram exibir inúmeros benefícios à saúde1. A Organização Mundial da Saúde (OMS) informou que 80% da população global depende de plantas medicinais tradicionais para cuidados primários de saúde. A China é bem reconhecida e popular por suas práticas de Medicina Tradicional Chinesa (MTC). Foi relatado que as ervas medicinais chinesas tratam várias doenças e são utilizadas por seu potencial biológico. As plantas medicinais servem como reservatórios para compostos bioativos e múltiplos papéis terapêuticos. Plantas medicinais também têm sido utilizadas para tratar as feridas. Existem vários tipos de abordagens aplicadas para tratar feridas crônicas2. Uma investigação recente revelou que as plantas medicinais estavam envolvidas no processo de cicatrização de feridas, proporcionando condições favoráveis à cicatrização, livres de infecções e fixação da regeneração tecidual3. Enquanto isso, as propriedades antibacterianas e antifúngicas dos compostos bioativos presentes nas plantas medicinais podem ajudar a curar feridas e acelerar a eficiência da cicatrizaçãode feridas 4.
Os nanomateriais à base de metal estão ganhando atenção devido às suas propriedades biocompatíveis e biodegradáveis. Eucommia ulmoides, comumente chamada de seringueira chinesa, é uma espécie nativa da China. As folhas e a casca da árvore são usadas em práticas medicinais. Mais importante ainda, a espécie de planta foi cultivada nas províncias central e ocidental da China5. Peng et al.6relataram que folhas, cascas e flores estaminadas eram comestíveis com potencial terapêutico. Além disso, E. ulmoides serve como a melhor fonte de lignanas, fenilpropanóides, iridóides, flavonóides, aminoácidos e oligoelementos. Além disso, a casca tem sido utilizada para várias aplicações biomédicas, como controle da pressão arterial, redução de gordura e promoção de antiosteroporose e atividade hipoglicêmica7. Portanto, sem dúvida, foi comprovado que o extrato de casca de E. ulmoides tem uma longa história na medicina tradicional chinesa. Relatórios anteriores sugeriram que o poliisopreno polipolímero natural é rico nas cascas de Eucommia ulmoides8. Com base nas informações acima, o presente trabalho tem como objetivo fabricar nanomateriais utilizando extratos de casca de Eucommia ulmoides . A combinação de zinco com extrato de casca é uma escolha atraente para a preparação de nanomateriais. No geral, o objetivo final da presente investigação foi fabricar um novo nanomaterial híbrido para aplicações de cicatrização de feridas.
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Protocolo
NOTA: Antes de preparar o extrato, o material da casca obtido foi lavado duas vezes com água deionizada e seco em local sombreado. As cascas secas à sombra foram armazenadas em um recipiente hermético.
1. Preparação do extrato de casca de Eucommia ulmoides
- Pique a casca coletada da árvore Eucommia ulmoides em pedaços pequenos usando uma tesoura.
- Lave os materiais da casca picada duas vezes com água destilada dupla.
- Seque os pedaços de casca a 37 °C durante 24 h em condições de sombra.
- Ajuste a duração do processo de secagem com base na quantidade de casca utilizada para o estudo. Certifique-se de que as cascas estejam completamente secas antes de cortá-las em pedaços pequenos. Evite a luz solar direta.
- Transferir 20 g de cascas secas à sombra para um balão cónico contendo 220 ml de água bidestilada estéril e aquecer a 130 °C durante 20 min.
- A cor da solução de reação muda para amarelo claro. As mudanças na cor da solução ocorrem após 10 min. Deixe a solução aquecer por mais 10 min. Ajuste o volume de água bidestilada com base na quantidade da amostra.
- Conservar o extracto bruto contendo poliisopreno a 4 °C para posterior utilização. A formação de uma estrutura semelhante a um fio indica a presença de poliisopreno nos extratos.
2. Biossíntese de nanopartículas de ZnO mediadas pela casca de E. ulmoides
- Adicionar 1 M de nitrato de zinco di-hidratado de Zn (NO3)2 a 50 ml de água desionizada num balão cónico de 500 ml. Agitar continuamente com agitação magnética (60 RPM). O Zn (NO3)2 leva 30 min para se dissolver completamente.
- Adicione 15 mL de extrato de casca de E. ulmoides gota a gota a 20 mL de solução de nitrato de zinco 1 M di-hidratado (Zn (NO3)2).
- Coloque a mistura de reação coberta em um agitador magnético, ligue o agitador e gire a (60 RPM) por 3 h.
- Adicione 1 N de solução de hidróxido de sódio NaOH (3 mL) gota a gota à mistura de reação para ajustar o pH para 9. Adicione NaOH até que a mistura da solução fique branca leitosa e o pH não seja superior a 9. A solução torna-se uma cor branca leitosa quando as nanopartículas de ZnO são formadas.
- A preparação de 1 M de nitrato de zinco di-hidratado Zn (NO3)2 volume da solução pode variar de acordo com as necessidades experimentais. Certifique-se de usar os extratos de casca recém-preparados. Se o pH exceder 10, resultará na agregação de nanopartículas.
- Transferir os Eu-ZnO-NPs sintetizados para um tubo de centrifugação de 50 ml e centrifugá-lo a 100 xg durante 5 min a 4 °C.
NOTA: As impurezas podem ser evitadas por lavagem imediata. - Recolher os Eu-ZnO-NPs lavados numa placa de vidro e secá-los a 45-50 °C durante 1 h numa estufa de ar quente.
NOTA: Se os Eu-ZnO-NPs forem mantidos por mais de 30 min, pode afetar a natureza físico-química das nanopartículas
3. Confirmação de tamanho usando TEM
- Prepare 1 mg/mL de nanopartículas em DDH2O e carregue 5 μL de amostra de Eu-ZnO-NP na grade de cobre e espere até que seque completamente. Vortex a amostra antes de carregar na grade de cobre.
- Carregar a grelha de cobre que contém Eu-ZnO-NP no suporte de amostras MET e adquirir imagens com aumentos de 50x e 100x.
NOTA: As grades devem ser recolhidas usando uma pinça durante esta etapa.
4. Avaliação da citotoxicidade
- Semeie 1 × 104 HUVECs em cada poço de uma placa de 96 poços e coloque-a em uma incubadora de 5% de CO2 37 ° C.
- Adicione 10 μL de várias concentrações 0, 10, 20, 30, 40 e 50 μg/mL de Eu-ZnO-NPs nas células confluentes de 90% e incube-as por 24 h.
- Após a incubação, remova o meio antigo sem perturbar as células, adicione 10 μL de solução de CCK-8 a cada poço contendo 90 μL de meio DMEM fresco e incube em uma incubadora de CO2,37 ° C a 5%.
- Medir a absorvância das células tratadas com solução de CCK8 a 450 nm utilizando um espectrofotómetro.
NOTA: A absorbância foi medida imediatamente em 15 min para evitar alterações na absorbância.
5. Preparação de células HUVEC para ensaio de arranhões
- Semear uma quantidade apropriada (1 × 105) de HUVECs em 12 placas de cultura de poço contendo o meio Eagle modificado de Dulbecco com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de pen-strep e incubá-lo em uma incubadora de 5% de CO2 37 ° C.
- Antes de realizar o ensaio de arranhões, verifique a confluência usando o microscópio invertido.
NOTA: Para realizar o ensaio de arranhões, serão utilizadas placas de 6 poços ou 12 placas com base nos requisitos, e a densidade celular variará para diferentes placas de cultura. O uso de 70% -80% de células confluentes é ideal e recomendado para ensaio de arranhões. O volume do meio DMEM pode variar de acordo com as placas de cultura utilizadas no estudo. Por exemplo, placas de 6 poços requerem 1-1,5 mL de meio de cultura e placas de 12 poços requerem 0,5-1,0 mL de meio de crescimento.
- Antes de realizar o ensaio de arranhões, verifique a confluência usando o microscópio invertido.
- Faça um arranhão suavemente usando uma ponta de pipeta estéril de 200 μL na ferida representativa com uma largura de ferida de 200 μm.
- Certifique-se de que a ponta usada para fazer arranhões na monocamada da célula entre em contato com a superfície das células.
NOTA: Toda vez que um arranhão for feito, use a ponta estéril. - Remova o meio completo e lave a monocamada HUVEC usando 1 mL de 1x PBS para remover as células destacadas.
NOTA: Certifique-se de que as células monocamada separadas sejam completamente removidas dos respectivos poços. Confirme se nenhum dano ocorreu na área criada pela ferida. - Para avaliar o potencial de cicatrização de Eu-ZnO-NPs sintetizados, adicione concentrações de 0 (Controle), 10 e 20 μg/mL de nanopartículas de Eu-ZnO combinadas com um meio completo com 10% de FBS nos poços. Manter as placas experimentais a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5%.
NOTA: Não perturbe a monocamada celular ao adicionar o meio fresco e completo. Certifique-se de que as células monocamada permaneçam intactas durante a incubação. - Adquira microfotografia em 0 h e 24 h usando um microscópio invertido. Use a ferramenta de anotação para medir o fechamento da ferida em diferentes intervalos de tempo.
- Calcule a porcentagem de fechamento da ferida usando a seguinte fórmula: Fechamento da ferida (%) = [(migração celular (em μm) em 0 h - migração celular (em μm) em 24 h)/ migração celular (em μm) em 0 h] x 100.
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Resultados
A presente investigação tem como objetivo sintetizar nanopartículas utilizando as cascas da árvore Eucommia ulmoides . O material da casca foi completamente seco em ambiente sombreado (Figura 1). Os materiais da casca foram utilizados para preparar o extrato bruto aquoso de água quente, aquecendo as amostras a 130 °C por 20 min. Uma ligeira alteração na temperatura e na duração pode perturbar os fitocompostos e torná-los inadequados para a preparação do extrato aquoso. Os extratos a...
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Discussão
Acredita-se que a casca, a semente e as folhas de E. ulmoides exibam inúmeros benefícios à saúde. Nossos resultados mostraram que a síntese de nanopartículas de EU-ZnO foi alcançada usando uma abordagem simples e econômica. O extrato aquoso foi utilizado para sintetizar as nanopartículas. O aquecimento do material da casca em altas temperaturas pode causar degradação de alguns fitoconstituintes e diminuir a eficiência da extração. Os fitoconstituintes presentes no extrato aquoso...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer sinceramente ao Departamento de Biologia Celular da Universidade Central do Sul, Changsha, China, por fornecer as instalações de instrumentação.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de 12 poços | NEST | 703011 | Usada para cultura de células e ensaio |
| Centrífuga | SCILOGEX | SC1406 | Usada para separar as nanopartículas da mistura coloidal |
| Tubo de Centrífuga – 15 mL | BIOFIL | CFT-312150 | Para centrifugar a solução sintetizada |
| Tubo de centrífuga – 5 mL | Biosharp | BS-50-CM-S | Para armazenar as nanopartículas |
| CO2 incubadora | Thermo scientific | 3010 | Para cultivar as células HUVEC |
| Água sem ruído | Millipore | Não aplicável | Para preparação do extrato |
| Meio DMEM | Cytiva | SH30243.01 | Usado para trabalho de cultura de células |
| Funil | Thermo scientific | 42600060 | Para segurar o papel de filtro durante a filtração |
| Copos de vidro | Borosilicato | 1102-50 | Usado para preparar o extrato aquoso |
| Forno de ar quente | Genetimes | Não Aplicável | Usado para secar as nanopartículas e coletar na forma de pó |
| Agitador magnético | KYLIN-BELL | GL-5250-A | Usado para síntese de nanopartículas |
| Microscópio | Nikon Eclipse | Ts2 | Usado para tirar microfotografias |
| Placa de Petri | NEST | 753001 | Usada para coletar as nanopartículas |
| Pipeta 1 mL | Ciência de Laboratório | YEA17AD0055580 | Para tomar/adicionar o volume específico de solução/extrato |
| Ponteiras de pipeta 1 mL | SAINING | 3014200-T | Para pegar/adicionar o volume específico de solução/extrato |
| Misturador Magnético PTFE Barras de Agitação | LAN RAN | Não aplicável | Usado para o processo de síntese de nanomateriais |
| Hidróxido de sódio | Sigma Alrich | 71690 | Usado para ajustar o pH durante a síntese |
| Tesoura de Aço Inoxidável | Deli | 6034 | Usado para cortar os materiais da casca |
| Frasco de cultura de tecidos T25 | NEST | 707001 | Usado para manter as células |
| Balança de pesagem | Radwag | AS220R2 | Usado para pesar os produtos químicos |
| Papel de filtro Whatman No.1 | Newstar | GB/T1914-2017 | Usado para filtrar o extrato para síntese |
| Nitrato de zinco | Sigma Alrich | 13778-30-8 | Usado como precursor para a nanopartícula ' síntese |
Referências
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Reimpressões e permissões
