A medicina tradicional chinesa (MTC) representa um rico tesouro de opções de tratamento natural e desempenha um papel importante no atendimento de diversas necessidades de saúde em todo o mundo. Este estudo apresenta uma investigação experimental abrangente sobre a extração, separação e propriedades físico-químicas da rutina, o principal componente ativo de Flos sophorae immaturus.
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Artigo de método
Extração e Caracterização do Flavonoide Rutina da Medicina Tradicional Chinesa Flos sophorae immaturus
Neste artigo
Resumo
Resumo
A medicina tradicional chinesa (MTC) há muito serve como um rico repositório de soluções terapêuticas naturais, desempenhando um papel fundamental no atendimento de diversas necessidades de saúde em todo o mundo. Entre as várias ervas usadas na MTC, a Sophora flavescens é conhecida por sua ampla gama de propriedades medicinais. Sua aplicação remonta a séculos e continua a ser altamente valorizada na medicina moderna, particularmente por seus benefícios terapêuticos no tratamento de doenças cardiovasculares. A rutina, um composto flavonóide bioativo, é amplamente distribuída por todo o reino vegetal, com a maior concentração encontrada em Flos sophorae immaturus. Foi relatado que a rutina reduz a permeabilidade e fragilidade capilar anormal e atua como um agente protetor para vasos cardiovasculares e cerebrovasculares. Este estudo apresenta um protocolo experimental detalhado para a extração, separação e caracterização das propriedades físico-químicas da rutina derivada de Flos sophorae immaturus. Além disso, o protocolo para a extração de flavonóides da MTC usando o método de extração alcalina e precipitação ácida é introduzido e descrito.
Introdução
Flos sophorae immaturus (FSI), o botão de flor seca de Sophora japonica L., tem sido a pedra angular da medicina tradicional chinesa (MTC) há séculos. Seus principais componentes ativos incluem rutina, isoquercitrina, Sophorae Flos e outros flavonóides e saponinas. Esses constituintes conferem coletivamente uma variedade de efeitos farmacológicos, como limpar o calor e desintoxicar, resfriar o sangue e a hemostasia e reduzir a pressão arterial. Na prática clínica, o FSI é valorizado principalmente por sua capacidade de proteger a permeabilidade capilar1, manter a função do sistema cardiovascular2, resfriar o sangue, interromper o sangramento e regular o fogo hepático3. Suas propriedades terapêuticas são atribuídas a uma alta concentração de rutina (quercetina-3-rutinosídeo), um flavonóide bioativo que constitui até 20%-30% de seu peso seco4.
A rutina é um flavonóide amplamente distribuído nas plantas. Seu nome químico é Que-3-O-rutina (C27H30O16) (Figura 1). À temperatura ambiente, a rutina aparece como um pó cristalino amarelo claro a verde-amarelo. Seu ponto de fusão varia com a forma e pureza do cristal, normalmente variando entre 125 °C e 195 °C. A rutina exibe características polares pronunciadas: é ligeiramente solúvel em água fria, altamente solúvel em solventes orgânicos polares, como etanol e metanol, e quase insolúvel em solventes apolares, como éter e clorofórmio. Além disso, sua solubilidade é sensível ao pH e aumenta significativamente em condições alcalinas devido à dissociação de grupos hidroxila fenólicos formando sais de sódio ou potássio. Essas propriedades físicas estão intimamente associadas aos grupos polihidroxila e glicosídeo em sua estrutura molecular5, influenciando diretamente seu processo de extração e aplicações em medicina, alimentos e outras indústrias6. A rutina, embora onipresente nas plantas, é mais abundante no FSI e exibe múltiplas atividades farmacológicas, incluindo estabilização capilar7, anti-inflamatório, antioxidante8, antimicrobiano9 e efeitos reguladores metabólicos10.
Apesar de seu potencial clínico11, a baixa solubilidade aquosa e estabilidade da rutina representam desafios para extração e formulação5. Para lidar com essas limitações, o método de precipitação ácida de extração alcalina (AEAP) surgiu como uma alternativa eficaz, aproveitando o comportamento dependente do pH de seus grupos hidroxila fenólicos.
Com base nas propriedades físicas da rutina, o método AEAP tornou-se uma técnica padronizada para isolar a rutina do FSI, utilizando sua solubilidade em soluções alcalinas e posterior cristalização em condições ácidas12. O AEAP explora a ionização comutável por pH de grupos hidroxila fenólicos para melhorar o rendimento e obter extração de rutina de alta pureza do FSI. Em condições alcalinas (pH >10), os grupos fenólicos -OH desprotonados para formar íons -O- hidrofílicos, permitindo a solubilização completa dos tecidos vegetais e minimizando a degradação oxidativa. A acidificação a pH 2-3 reverte essa ionização, precipitando os fenólicos alvo com co-precipitação mínima de impurezas polares. Como um polifenol com solubilidade dependente do pH, a rutina se dissolve prontamente em soluções alcalinas (por exemplo, hidróxido de sódio), mas precipita sob condições ácidas devido à protonação do grupo hidroxila. A AEAP fornece uma alternativa econômica, escalável e ecologicamente correta, alinhando-se aos princípios da química verde, evitando solventes tóxicos13. Ele reflete uma tendência mais ampla na química do produto natural que favorece as técnicas de separação orientadas por pH14. Métodos comparáveis são empregados para isolar a curcumina (da cúrcuma) e a berberina (de Coptis chinensis), explorando as mudanças de solubilidade em valores específicos de pH para extração seletiva. O método AEAP é ideal para a produção de rutina de alto rendimento a partir de fontes ricas em flavonoides, como FSI, exigindo apenas equipamentos básicos de laboratório (por exemplo, medidores de pH, centrífugas). Para matrizes vegetais com baixo teor de rutina ou compostos interferentes complexos, o pré-tratamento de hidrólise enzimática pode ser considerado no futuro para aumentar a eficiência da extração.
Em conclusão, o AEAP representa uma abordagem conveniente para a extração de rutina, equilibrando eficácia, segurança e escalabilidade. Seu papel na modernização da MTC destaca seu potencial para unir as práticas tradicionais com os padrões farmacêuticos contemporâneos.
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Protocolo
A rutina é um flavonóide que contém vários grupos hidroxila fenólicos e é solúvel em soluções alcalinas quentes, seguidas de acidificação e precipitação. Pode ser extraído usando o processo de precipitação ácida de extração alcalina. Os reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação experimental
- Obtenha os seguintes materiais: Flos sophorae immaturus (20 g), bórax (0,8 g), béqueres diversos, pó de cal (1,5 g), ácido clorídrico concentrado, termômetro e tiras de teste de pH. Consulte a Figura 2 para obter uma versão maior desta imagem.
2. Extração de rutina
NOTA: Use uma proporção de bórax para água de 0.8 g de bórax para 200 mL de água. Use uma proporção de leite de limão de 1,5 g de pó de limão para 10 mL de água. Ajuste o pH com rapidez e precisão. Reabasteça a água perdida conforme necessário.
- Extração alcalina
NOTA: Filtre com papel de filtro redondo de 6 cm.- Adicione 250 mL de água e 0,8 g de bórax a um copo de 500 mL. Aqueça até ferver e adicione 20 g de Flos sophorae immaturus. Continue fervendo por 2-3 min.
- Após a fervura, ajuste o pH para 8-9 com o leite de limão sob agitação. Continue aquecendo por 20 min. Filtrar com gaze ainda quente para obter um filtrado castanho-amarelado.
- Extração por precipitação ácida
- Ajustar o extracto a pH 2-3 com ácido clorídrico concentrado e deixar repousar. Uma mudança de uma solução marrom-amarelada clara para uma turva, juntamente com a formação gradual de precipitado floculante amarelo-alaranjado no fundo do recipiente, indica uma separação eficaz da rutina.
- Depois de repouso por 6 h, submeter o precipitado à filtração por sucção à pressão atmosférica. Colete e seque para obter rutina bruta.
NOTA: Corte o filme de filtro de acordo com o tamanho do funil Brinell usado (150 mm de diâmetro). - Lavar o precipitado com água até ficar neutro durante a filtração por sucção à pressão atmosférica.
3. Refino de rutina
- Após pesagem grosseira, recristalize a rutina usando água quente a uma proporção de solubilidade de 1:200. Ferva a solução aquosa por 30 min e filtre enquanto estiver quente. Certifique-se de que o volume final da solução de rutina seja de 210 mL.
- Filtre o resíduo. Deixar o filtrado repousar sem perturbação, filtrar novamente e secar sob vácuo numa estufa a 60-70 °C para obter rutina refinada (figura 3).
NOTA: Corte o filme de filtro de acordo com o tamanho do funil Brinell usado (150 mm de diâmetro).
4. Identificação físico-química da rutina
- Reação cloridrato-sal de magnésio - identificação de núcleos parentais de flavonóides
- Dissolva 1-2 mL da amostra em metanol e adicione 50 mg de pó de magnésio.
- Adicione algumas gotas de ácido clorídrico concentrado. Agite suavemente. A solução deve ficar vermelha (Figura 4).
- Reação de Molisch - identificação de compostos de açúcar
- Adicione uma solução de etanol a 10% de α-naftol e agite. Incline o tubo de ensaio e adicione cuidadosamente ácido sulfúrico concentrado gota a gota ao longo da parede interna.
- Observe a formação de um anel marrom na interface (Figura 5).
- Reação de zircônia verde-ácido cítrico
- Adicione 1-2 mL de solução de α-naftol a 10% à solução de etanol da amostra. Agite bem. Adicione lentamente 10 gotas de H2SO4 concentrado ao longo da parede do tubo sem agitar.
- Adicione a solução de metanol de ácido cítrico a 2%. A cor da solução deve clarear (Figura 6).
- Discriminação de camada fina
- Use a rutina refinada e o padrão de rutina.
- Use clorofórmio: metanol: ácido fórmico (15: 5: 1) como agente revelador e solução de etanol a 1% de AlCl3 como agente cromogênico. Observe a fluorescência sob uma lâmpada UV a 365 nm.
5. Exame TLC de rutina
NOTA: Um método de cromatografia em camada delgada (TLC) foi empregado para avaliar a pureza da rutina. Uma placa de sílica gel foi usada como fase estacionária.
- Coloque a amostra de rutina refinada e o padrão de rutina (1 mg / mL em metanol) na placa. Desenvolver a placa numa fase móvel constituída por acetato de etilo:ácido fórmico:água (8:1:1, v/v/v).
- Após a secagem, visualize a placa sob luz ultravioleta a 254 nm.
- Calcule o fator de retenção (Rf) do ponto de amostra e compare-o com o padrão.
NOTA: Um único ponto com um valor de Rf idêntico (aproximadamente 0,35-0,50 nessas condições) indica alta pureza, enquanto pontos adicionais sugerem a presença de impurezas.
6. Determinação da pureza da rutina por HPLC
NOTA: A pureza da rutina foi analisada quantitativamente por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). As condições de análise foram as seguintes: Coluna cromatográfica (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); fase móvel-acetonitrila (A) e solução aquosa de ácido acético a 0,2% (B). Programa de eluição de gradiente linear: 0-15 min, 20%-30% A; 15-30 min, 30%-60% A. Taxa de fluxo-1 mL/min. Volume de injeção-10 μL. Comprimento de onda de detecção-355 nm. Temperatura da coluna-40 °C.
- Pese com precisão 0,1 g de pó de amostra de rutina e transfira-o para um tubo de centrífuga de 10 mL. Adicione 5,0 mL de solução de etanol a 60% e agite bem.
- Regular o banho-maria ou o forno de coluna a temperatura constante a 30 °C e ultrassonizar a amostra durante 30 min.
- Centrifugue a amostra a 55.900 × g por 10 min em temperatura ambiente. Utilizar o sobrenadante como solução de ensaio para a análise por HPLC.
7. Determinação da rutina por LC-MS
NOTA: Os compostos isolados foram identificados por cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS). As condições de LC corresponderam ao método HPLC. A espectrometria de massas foi realizada usando ionização por eletrospray (ESI) no modo de íons negativos com tensão capilar de 3,5 kV. Temperatura de dessolvatação-350 °C; Faixa de varredura em massa-m/z 100-1000.
- Pesar 10 mg de rutina purificada e transferi-la para um tubo de microcentrífuga de 2 ml. Adicione 0,6 mL de DMSO deuterado usando uma pipeta até que a amostra esteja totalmente dissolvida. Prepare soluções padrão de rutina usando o mesmo procedimento.
- Analise as amostras e padrões tratados usando espectroscopia de ressonância magnética nuclear de prótons (RMN de 1H).
- Processe os dados espectrais usando software compatível15.
- Compare os dados espectrais com referências de literatura ou banco de dados, como NIST ou PubChem, para verificação.
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Resultados
No experimento de identificação físico-química da rutina, a solução ficou vermelha após a adição de pó de magnésio e uma pequena quantidade de ácido clorídrico concentrado, seguido de agitação, indicando a presença de um núcleo pai flavonóide. Na reação de Molisch, um anel roxo se formou na interface, indicando um resultado positivo e a presença de porções de açúcar na estrutura molecular. A solução da amostra tornou-se amarela brilhante após a adição de 2% de reagente de cloro-oxidação em metanol, sugerindo a presença d...
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Discussão
A extração de rutina é baseada principalmente no método de precipitação ácida de extração alcalina (AEAP)6, que oferece as vantagens de requisitos de equipamento simples, facilidade de operação, alta eficiência e baixo custo. Essa técnica é frequentemente complementada por extração assistida por micro-ondas (MAE)7 e extração assistida por ultrassom (UAE)8, que reduzem o consumo de reagentes, aceleram o tempo de extra...
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Divulgações
Os autores deste artigo declaram que divulgaram todo e qualquer conflito de interesse que possa ter surgido durante a realização desta pesquisa e a redação deste artigo. Confirmamos que não temos relações financeiras, pessoais ou profissionais que possam influenciar nossa interpretação dos resultados ou conclusões apresentadas neste trabalho. Especificamente, não temos vínculos com nenhuma empresa farmacêutica, instituição de pesquisa ou outras entidades que possam se beneficiar das descobertas relatadas aqui. Por fim, afirmamos que nossos achados e conclusões são baseados exclusivamente nos dados e análises apresentados neste artigo e não são influenciados por nenhum fator externo. Continuamos comprometidos com os mais altos padrões de integridade acadêmica e conduta ética em todas as nossas atividades de pesquisa.
Agradecimentos
Gostaríamos de expressar nossa profunda gratidão ao Laboratório de Química Farmacêutica da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim por fornecer a plataforma experimental. Seu apoio e recursos têm sido inestimáveis na condução de nossas pesquisas e experimentos. Apreciamos profundamente sua dedicação à excelência científica e seu compromisso em promover o desenvolvimento de jovens pesquisadores.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1-Naftol | MACKLIN | C16245764 | |
| Ácido acético | MACKLIN | C12662811 | |
| Acetonitrilo | MACKLIN | C16129374 | |
| Cloreto de Alumínio | MACKLIN | C16485922 | |
| Ácido cítrico | MACKLIN | C16429480 | |
| DMSO | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20230306 | |
| Etanol | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20250102 | |
| Acetato de etila | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20240318 | |
| Flos sophorae immaturus | Pequim Tongrentang | 10092026329782 | |
| Ácido fórmico | FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD | 20150402 | |
| MestReNova | Pesquisa Mestrelab | / | |
| Metanol | Innochem | C16365684 | |
| Gel de sílica 60F254 | STEEMA | 20210222 | |
| Xcalibur | Thermo Fisher Scientific | / | |
| Cloreto de zircônila octahidratado | MACKLIN | C15350627 |
Referências
- Drew, A. K., et al. Chinese herbal medicine toxicology database: Monograph on Radix Sophorae Flavescentis, "ku shen". J Toxicol Clin Toxicol. 40 (2), 173-176 (2002).
- Chua, L. S. A review on plant-based rutin extraction methods and its pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 150 (3), 805-817 (2013).
- Huang, R., et al. Evaluation of the synergetic effect of Yupingfeng San and Flos Sophorae Immaturus based on free radical scavenging capacity. Biomed Pharmacother. 128, 110265(2020).
- Li, R., Wang, C., Lei, P., Huang, L., Yuan, S. Chemical constituents in Flos sophorae carbonisatus. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 35 (5), 607-609 (2010).
- Ghorbani, A. Mechanisms of antidiabetic effects of flavonoid rutin. Biomed Pharmacother. 96, 305-312 (2017).
- Calabrese, E. J., et al. Rutin, a widely consumed flavonoid, that commonly induces hormetic effects. Food Chem Toxicol. 187, 114626(2024).
- Li, R. R., Yuan, S. T., Li, Z. H., Qin, H. L. Studies on chemical constituents in Flos sophorae carbonisatus. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 30 (16), 1255-1257 (2005).
- Nikfarjam, B. A., Adineh, M., Hajiali, F., Nassiri-Asl, M. Treatment with rutin - a therapeutic strategy for neutrophil-mediated inflammatory and autoimmune diseases: Anti-inflammatory effects of rutin on neutrophils. J Pharmacopuncture. 20 (1), 52-56 (2017).
- Singh, S., et al. Rutin protects t-butyl hydroperoxide-induced oxidative impairment via modulating the Nrf2 and iNOS activity. Phytomedicine. 55, 92-104 (2019).
- Cushnie, T. P., Lamb, A. J. Antimicrobial activity of flavonoids. Int J Antimicrob Agents. 26 (5), 343-356 (2005).
- Budzynska, B., et al. Rutin as neuroprotective agent: From bench to bedside. Curr Med Chem. 26 (27), 5152-5164 (2019).
- Tan, Y. Q., et al. Pharmacological properties of total flavonoids in Scutellaria baicalensis for the treatment of cardiovascular diseases. Phytomedicine. 107, 154458(2022).
- Tobar-Delgado, E., Mejía-España, D., Osorio-Mora, O., Serna-Cock, L. Rutin: Family farming products' extraction sources, industrial applications and current trends in biological activity protection. Molecules. 28 (15), 5864(2023).
- Wang, S., et al. Effect of combined ultrasonic and enzymatic extraction technique on the quality of noni (Morinda citrifolia L.) juice. Ultrason Sonochem. 92, 106231(2023).
- Dos Santos Dantas, T., et al. Phytochemical profile analysis by LC-ESI-MS(n) and LC-HR-ESI-MS and validated HPLC method for quantification of rutin in herbal drug and products from leaves of Croton blanchetianus. Biomed Chromatogr. 37 (9), e5665(2023).
- Santiago, M., Strobel, S. Thin layer chromatography. Methods Enzymol. 533, 303-324 (2013).
- Ravber, M., et al. Hydrothermal degradation of rutin: Identification of degradation products and kinetics study. J Agric Food Chem. 64 (48), 9196-9202 (2016).
- Zhang, Z., et al. Effect of pH regulation on the components and functional properties of proteins isolated from cold-pressed rapeseed meal through alkaline extraction and acid precipitation. Food Chem. 327, 126998(2020).
- Lv, H., et al. Extraction and separation of vitisin D, ampelopsin B and cis-vitisin A from Iris lactea Pall. var. chinensis (Fisch.) Koidz by alkaline extraction-acid precipitation and high-speed counter-current chromatography. J Chromatogr Sci. 54 (5), 744-751 (2016).
- Yang, Y., Chu, X., Li, Y., Meng, H., Qin, L. Alkali-extracted rhamnogalactoarabinan from Chaetomorpha linum: Characterisation and anti-type 2 diabetic effect. Carbohydr Polym. 356, 123388(2025).
- Gao, S., et al. Unveiling polysaccharides of Houttuynia cordata Thunb.: Extraction, purification, structure, bioactivities, and structure-activity relationships. Phytomedicine. 138, 156436(2025).
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Reimpressões e permissões
