Um protocolo é apresentado para a instalação e preparação de eletrodos intramusculares, juntamente com um dispositivo de medição miniaturizado montável em animais para análise de eletromiografia (EMG) em estudos de locomoção. Este sistema permite a transmissão sem fio de dados EMG em tempo real para investigar a recuperação da locomoção em ratos modelo AVC.
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Artigo de método
Um sistema de medição de eletromiografia vestível em tempo real para pequenos animais
Neste artigo
Resumo
Resumo
O método de medição de eletromiografia intramuscular (EMG) para animais experimentais foi implementado de várias maneiras. Dentre esses métodos, amarrar cabos a dispositivos de medição externos pode restringir o movimento de animais experimentais, enquanto dispositivos implantáveis podem causar efeitos colaterais indesejados devido à presença constante de um dispositivo com tamanho e peso consideráveis. Para resolver essas questões, propomos um sistema de medição EMG de baixo custo, sem fio e destacável e um procedimento experimental. Este artigo enfoca a instalação cirúrgica de eletrodos de fio intramuscular com pequenos conectores e o desenvolvimento do sistema sem fio. Notavelmente, neste sistema, apenas os eletrodos de fio são inseridos no corpo do animal. Usando este sistema, as medições EMG podem ser facilmente realizadas conectando o sistema de circuito a um conector instalado nas costas do animal, com monitoramento em tempo real alcançável em um laptop. O método proposto é explicado de forma detalhada, passo a passo, seguido de uma demonstração envolvendo a inserção de eletrodos intramusculares nos membros posteriores de um rato. Um experimento em esteira é conduzido para um estudo de locomoção, e os sinais eletrofisiológicos resultantes são posteriormente obtidos e analisados.
Introdução
A eletromiografia envolve o registro de potenciais elétricos gerados pelas fibras musculares durante a contração. Essas propriedades são determinadas por sinais de ativação neural enviados de neurônios motores para músculos individuais. A EMG é amplamente utilizada em estudos de reabilitação, motores, cerebrais e relacionados aos nervos, e os métodos de medição podem ser amplamente classificados em EMG de superfície (sEMG) e EMG intramuscular (iEMG)1. Os eletrodos de superfície oferecem várias vantagens, principalmente em aplicações vestíveis, pois não são invasivos e requerem um processo de preparação simples2. Na EMGs implantada, o processo cirúrgico é mais simples em comparação com a EMGi, onde o eletrodo não precisa penetrar no músculo. Apesar dessas vantagens, a EMGs é propensa a contaminação de sinal, como distúrbios na interface músculo-eletrodo, artefatos de movimento, qualidade do contato do eletrodo e diafonia de sinal de músculos adjacentes1. Esses desafios são particularmente problemáticos quando os eletrodos são colocados próximos, como costuma ser o caso em estudos envolvendo pequenos animais. Por outro lado, a iEMG requer um procedimento cirúrgico adicional para penetração do eletrodo. Apesar das etapas extras do procedimento, esse método fornece registros EMG específicos do músculo com maior precisão e menos diafonia, pois os eletrodos estão permanentemente embutidos no tecido muscular3. Em estudos motores de pequenos animais, a EMGi é preferida, pois as informações de EMG específicas do músculo com instalação confiável do eletrodo são críticas4.
Várias abordagens foram relatadas para a aquisição de registros EMG de eletrodos em pequenos animais. Os cabos de amarração são comumente usados para conectar eletrodos a equipamentos de medição externos5,6,7,8,9,10,11, dispositivos podem ser implantados dentro do corpo12, ou uma plataforma vestível sem fio pode ser colocada no animal13. Os cabos de amarração são o método mais amplamente relatado devido à disponibilidade de equipamentos comerciais compatíveis para esse fim; no entanto, os fios de amarração causam desconforto aos animais, e seu movimento é frequentemente restringido pelos cabos, o que pode afetar o estudo. Os dispositivos implantáveis oferecem soluções sem fio, mas sua vida útil limitada da bateria pode restringir a duração dos experimentos. Além disso, o tamanho e o peso dos dispositivos instalados permanentemente podem causar estresse e desconforto aos animais, o que pode afetar o estudo. Técnicas de transferência de energia sem fio foram propostas para resolver os problemas em dispositivos implantáveis, mas manter um link de energia confiável para um dispositivo pequeno é normalmente muito difícil14. Além disso, a exposição a altos campos eletromagnéticos pode levar a consequências imprevistas, como redução da função imunológica e potenciais alterações neurodegenerativas no cérebro15,16.
O sistema de aquisição também pode ser implementado como uma plataforma vestível sem fio que lida com o processamento de sinal e transmite sem fio as gravações EMG para uma estação base. Embora este seja o método preferido, ele apresenta um desafio técnico para os usuários, e os detalhes experimentais muitas vezes não são totalmente abordados na literatura.
Neste trabalho, apresentamos um método de aquisição EMG simples, de baixo custo e confiável para estudos de locomoção em pequenos animais. Um par de eletrodos iEMG é implantado nos músculos dos membros posteriores de um rato, enquanto o restante do sistema de aquisição de sinal, incluindo amplificação, conversor analógico-digital e telemetria sem fio, é montado nas costas do animal. Os dados EMG são transmitidos para um computador pessoal para monitoramento em tempo real, com dados registrados localmente. Um experimento de locomoção em esteira é conduzido para demonstrar o sistema em um estudo de recuperação de AVC.
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Protocolo
A aprovação de todos os procedimentos e protocolos éticos e experimentais foi concedida pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais sob o Requerimento nº. CGU1-2021-IA0041. Um rato Sprague-Dawley macho de 7 semanas de idade foi usado neste estudo. Os detalhes dos reagentes e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação dos animais
- Prepare ratos com 7 semanas de idade. Por segurança, ratos domésticos de pesos semelhantes juntos, com um máximo de três ratos por gaiola.
- Certifique-se de que os ratos se adaptem sem estresse antes da cirurgia. Forneça água e comida de forma consistente e substitua a roupa de cama periodicamente.
- Durante o período de adaptação (cerca de 7 dias), treine os animais para correr em uma esteira a uma velocidade de 16-25 m/min por 5 min por dia para ajudá-los a se aclimatar à esteira.
NOTA: Se um rato parar ou se recusar a se mover como pretendido, bata suavemente em suas nádegas para incentivá-lo.
2. Preparação do eletrodo
- Prepare cinco fios de aço inoxidável revestidos com politetrafluoretileno, quatro deles com 140 mm de comprimento e um com 60 mm de comprimento.
- Dê três nós em um fio de 140 mm de comprimento, colocando-os a 40 mm e 100 mm em relação ao nó (Figura 1A).
NOTA: Durante a inserção do eletrodo de fio no músculo, pode ser um desafio garantir um contato preciso e manter a parte exposta do eletrodo posicionada corretamente. Para resolver isso, um nó de bloqueio é criado no fio para evitar mais inserção quando puxado, garantindo que o eletrodo permaneça estável dentro do músculo. - Para os fios de 140 mm, deixe uma folga de 2 mm do nó no lado curto e, em seguida, retire parcialmente o isolamento usando um ferro de solda para 2 mm. Descasque totalmente o isolamento da extremidade do lado comprido em 2 mm. Para os eletrodos de 60 mm, remova completamente o isolamento em uma extremidade em 2 mm e na outra extremidade em 10 mm (Figura 1).
NOTA: A ponta do ferro de solda deve ser bem limpa para evitar contaminação. - Fixe o fio soldando-o ao acessório do conector após remover totalmente o isolamento (Figura 2B,C).
- Monte a parte metálica à qual o fio está conectado no invólucro de plástico (Figura 2D,E).
- Conecte o conector a uma guia de plástico impressa em 3D (consulte a Tabela de Materiais) que inclui orifícios para prendê-lo à pele. Para evitar que a peça soldada entre em contato com o local da incisão, aplique cianoacrilato biocompatível (Figura 2F).
- Corte uma placa de níquel de 0,2 mm de espessura e dobre-a para envolver o conector, protegendo-o para evitar possíveis danos ao animal.
3. Cirurgia
- Coloque o rato em uma câmara de indução (fabricada sob medida usando uma resina sintética transparente) e administre anestesia usando uma mistura de 70% de óxido nitroso e 30% de oxigênio, com uma concentração de isoflurano de 2% a 3%. Prepare os instrumentos cirúrgicos necessários (Figura 3).
- Remova o pelo usando uma máquina de cortar cabelo elétrica e prepare a pele com clorexidina e álcool para prevenir infecções durante a cirurgia (Figura 4A).
- Faça uma incisão de cerca de 10-15 mm usando uma tesoura cirúrgica na pele onde está localizado o músculo alvo a ser medido. Como a fáscia fica sob a pele e os músculos abaixo dela, primeiro use uma tesoura para cortar a pele e, em seguida, remova a fáscia limpando-a suavemente com um pano limpo.
- Faça uma incisão de 5 a 10 mm ao redor da região lombar onde o conector será fixado.
- Use trochar estéril para criar uma passagem sob a pele para que o fio passe do conector para a posição do músculo alvo (Figura 4B).
- Passe o trochar da posição muscular, sob a pele, em direção ao local da incisão no lado lombar.
- Prepare o eletrodo e o conector do estágio anterior. Aperte os eletrodos de arame no local da incisão no lado lombar usando a pinça e puxe-os cuidadosamente até a incisão no músculo-alvo. Uma vez que o fio tenha sido puxado para o local do músculo alvo, consulte Figura 4C.
- Conforme mostrado em Figura 4D, use uma agulha de sutura para penetrar o fio do eletrodo no músculo alvo.
NOTA: O músculo alvo para este experimento é o gastrocnêmio medial (MG), que é um dos músculos-chave para a análise de tarefas motoras17. Como o comprimento do MG é de aproximadamente 18 mm em ratos com 7 semanas de idade, os eletrodos devem ser colocados ao redor do centro do músculo, com espaçamento de cerca de 5 mm, para minimizar os danos musculares e garantir medições precisas de EMG. Recomenda-se que o comprimento do fio que penetra no músculo exceda 5 mm para garantir que a parte com o isolamento removido esteja em bom contato com o músculo. - Guie o fio que passou e saiu do músculo de volta ao seu ponto de inserção e prenda-o com um nó overhand. Corte o fio restante (Figura 4E).
- Depois de instalar o eletrodo de arame no músculo-alvo, suture o local da incisão com sutura de monofilamento 4-0.
- Suturar a incisão sob o conector. Certifique-se de que todo o fio esteja inserido no corpo e suturado com segurança (Figura 5A).
- Prenda o conector à pele dorsal do animal usando um fio de sutura, conforme mostrado em Figura 5B.
NOTA: Certifique-se de que o escudo esteja bem preso para evitar que o animal mastigue o conector. Para analgesia, carprofeno (5 mg / kg) foi administrado por via subcutânea. - Assim que a operação cirúrgica estiver concluída, interrompa a anestesia e prepare uma gaiola para a recuperação do animal.
- Ligue uma lâmpada de calor para evitar que a temperatura corporal do animal caia e monitore o local da cirurgia em busca de anormalidades, como sinais de infecção, inflamação ou inchaço. Desinfete bem o local da incisão e aplique pomada, se necessário. Assim que o rato se recuperar da anestesia, remova a lâmpada de calor.
- Monitore o comportamento do rato, incluindo apetite, bebida e micção.
NOTA: Após a cirurgia, deixe o animal descansar por cerca de 2 dias antes de realizar qualquer teste.
4. Projeto e fabricação de placas de circuito impresso (PCB)
- Projete o circuito para medição e digitalização de EMG para incluir dois circuitos integrados (ICs) de amplificadores analógicos e uma unidade de microcontrolador (MCU). Certifique-se de que o amplifier tem uma largura de banda de 5-740 Hz e um ganho de 1300 V/V.
NOTA: Modifique o ampganho e largura de banda do amplificador de acordo com os requisitos específicos do animal, se necessário18. - Inclua um módulo Bluetooth integrado no MCU para comunicação sem fio para transmitir os dados medidos para o dispositivo host. Uma antena de chip operando a 2,4 GHz foi usada para este experimento.
- Utilize uma bateria Li-po recarregável de 3.7 V junto com um IC de gerenciamento de energia dedicado para este estudo.
- Fabrique um PCB para os ICs acima em um substrato FR4. Crie o PCB em várias formas para atender a requisitos específicos. Consulte a Figura Suplementar 1, a Figura Suplementar 2 e a Figura Suplementar 3.
- Preencha os componentes eletrônicos no PCB soldando ou usando uma pistola de calor.
5. Configuração do software
- firmware
- Prepare o firmware (Codificação Suplementar File 1) para configurar um ADC de 2 canais com resolução de 8 bits e uma taxa de amostragem de 2 kSPs. Formate os dados convertidos digitalmente em uma matriz e transmita-os via Bluetooth Low Energy (BLE) usando a ferramenta de desenvolvimento de software designada.
- Carregue o firmware no MCU antes da implantação.
- Programa de monitoramento em tempo real
- Prepare um programa para plotar os dados recebidos via BLE em tempo real. Para este estudo, é desenvolvida uma aplicação de plotagem baseada em Python, que também armazena os dados brutos em um local especificado (Arquivo de Codificação Suplementar 2).
NOTA: O sistema pode experimentar um buffer de amostragem atraso de no máximo 50 ms e um atraso de comunicação sem fio de aproximadamente 10 ms19,20.
- Prepare um programa para plotar os dados recebidos via BLE em tempo real. Para este estudo, é desenvolvida uma aplicação de plotagem baseada em Python, que também armazena os dados brutos em um local especificado (Arquivo de Codificação Suplementar 2).
6. Teste em esteira
- Conecte a bateria ao circuito preparado e conecte a placa de circuito impresso ao conector, conforme mostrado em Figura 6A.
- Execute o programa de monitoramento no PC e estabeleça conectividade sem fio com o circuito PCB.
- Coloque o rato na esteira e monitore a forma de onda EMG. Para este estudo, a esteira é ajustada a uma velocidade de 25 m/min (Figura 6B).
7. Análise dos dados
- Carregue os dados EMG armazenados no . CSV.
- Aplique métodos de processamento de sinal para remover ruídos indesejados e sinais de interferência.
NOTA: A detecção de envelope e a análise espectral podem ser realizadas para analisar a fadiga muscular e a simetria na atividade motora.
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Resultados
Neste estudo, é apresentado um método sem fio simples para aquisição de EMG. Embora seja necessária uma intervenção cirúrgica, apenas a área específica para inserção do eletrodo e fixação do conector é parcialmente incisada, reduzindo significativamente o impacto sobre o animal. Nesta demonstração, os eletrodos foram inseridos nas extremidades inferiores, mas estudos eletrofisiológicos semelhantes podem ser realizados em diversas outras regiões utilizando o mesmo método. Esta abordagem of...
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Discussão
Este trabalho apresenta um sistema de aquisição de eletromiografia (EMG) de pequeno porte, fácil implementação, baixo custo e sem fio. O sistema evita efetivamente a degradação do sinal causada por cabos, pois não depende de nenhum equipamento de medição externo com fio. Ao montar o conector na parte traseira em vez da cabeça, o processo cirúrgico se torna significativamente mais fácil, reduzindo o risco de complicações. Essa configuração também minimiza as chances de a plataforma colidir com as paredes laterais, o que p...
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Divulgações
Todos os autores não têm conflito de interesses.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF-2020M3A9E4104385) e pelo Projeto de Desenvolvimento de Dispositivos Nanomédicos do National Nano Fab Center (número da concessão: 1711160154).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| placa de níquel de 0,2 mm | de espessura Qualquer vendedor | ||
| cubicon | de filamento de impressão 3D | A-100 | |
| 7 semanas de idade RAT | JABIO | SD (DBL) [7W M] | |
| Adesivo | Okong | 1028453 | para proteger o escudo |
| ANT1 | Johanson Technology Inc. | 2450AT07A0100001T | |
| C1, C15, C16, C20 | Vishay | 1n | 0201 (0603) métrico |
| C10, C13 | Vishay | 100p | 0201 (0603) métrico |
| C11, C12 | Vishay | 4p | 0201 (0603) métrico |
| C14, C19 | Vishay | 0.39n | 0201 (0603) métrico |
| C2, C17 | Vishay | 22n | 0201 (0603) métrico |
| C3, C5, C6 | Vishay | 0.1u | 0201 (0603) métrico |
| C4, C18 | Vishay | 2.2u | 0201 (0603) métrico |
| C7 | Vishay | 4.7u | 0402 (1005) métrico |
| C8, C21 | Vishay | 1u | 0201 (0603) métrico |
| C9 | Vishay | 1p | 0201 (0603) |
| métrico Gaiola | JEUNG DO B & P | JD-C-02 | |
| Pano limpo | kimberly | 41112 | |
| Conector acessório | Harwin | M20-1060400 | Caixa de plástico |
| Conector acessório | Harwin | M20-1180042 | Parte de metal |
| Máquina de cortar cabelo elétrica | Buzz | RFC-928 | |
| Pistola de calor | QUICK | 861DW | |
| IC1, IC3 | Dispositivo análogo | AD8232 | para a medida de EMG AFE |
| IC2 | Semicondutor nórdico | nRF52832-CIAA | |
| Isoflurano | Hana Pharm | 657801261 | |
| L1 | Vishay | 3.3n | 0201 (0603) bateria métrica |
| TheHan | TW402025 | 13 milímetros *10 milímetros * 4 milímetros, encabeçamento | |
| Harwin | M22-2530505 | Pin 30mAh | |
| R1, R2, R9, R10, R13, R14, R21, R22 | Vishay | 10M | 0201 (0603) métrico |
| R11, R23 | Vishay | 100k | 0201 (0603) métrico |
| R12, R24 | Vishay | 1M | 0201 (0603) métrico |
| R3, R4, R5, R7, R15, R16, R17, R19 | Vishay | 180k | 0201 (0603) métrico |
| R6, R18 | Vishay | 160k | 0201 (0603) métrico |
| R8, R20 | Vishay | 768k | 0201(0603)metric |
| Fio de solda | Alpha metal | SACX0307 | |
| Ferro de solda | Hakko | FX-951 | |
| Fios de aço inoxidável revestidos com Teflon | A-M Systems | 793200 | |
| AILEE | 301289 | ||
| Ethicon | 604G | ||
| Esteira | Daejong Bio | DJ2-243 | |
| U1 | Torex Semiconductor | XC6204B332DR-G | |
| Y1 | Murata Electronics | XRCTD32M000N1P1AR0 |
Referências
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Reimpressões e permissões
