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Artigo de método

Síndrome de Sjögren Primária Associada ao Adenocarcinoma de Pulmão: Sondando os Potenciais Mecanismos Patogênicos Comuns e Verificação Experimental

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DOI:

10.3791/67421

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20 de setembro de 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Oncology Department, Wangjing Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3The Second Department of Healthcare, China-Japan Friendship Hospital, 4Rheumatology Department, Shangqiu Hospital of Traditional Chinese Medicine

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito descreve os procedimentos operacionais e precauções para investigar os potenciais mecanismos patogênicos comuns que ligam a síndrome de Sjögren primária e o adenocarcinoma de pulmão por meio de análise de bioinformática e verificação experimental.

Resumo

Este estudo teve como objetivo investigar os potenciais mecanismos patogênicos comuns que ligam a síndrome de Sjögren primária (SSp) e o adenocarcinoma de pulmão (LUAD) por meio de análise de bioinformática e verificação experimental. Os genes relevantes associados a pSS e LUAD foram recuperados do banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO) e do banco de dados Genecard. Posteriormente, genes diferencialmente expressos (DEGs) associados a pSS e LUAD foram rastreados como pSS-LUAD-DEGs. Análises de enriquecimento da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) e Ontologia Gênica (GO) foram realizadas para elucidar as funções biológicas significativas dos pSS-LUAD-DEGs. Os alvos principais foram identificados pela construção da rede de interação proteína-proteína (PPI), avaliando ainda mais a precisão do diagnóstico do gene hub por meio de análises de curva ROC (Receiver Operating Characteristic). Neste estudo, camundongos NOD/Ltj serviram como modelos animais pSS e foram estimulados com material particulado 2,5 (PM2,5) para gerar uma reação inflamatória. Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR), ensaio imunoenzimático (ELISA) e western blotting foram empregados para verificação relevante de experimentos de biologia molecular. Os resultados revelados por meio de análises de enriquecimento KEGG e GO indicam que a inflamação desempenha um papel crítico na ligação entre pSS e LUAD. IL6, CCNA2, JAK2, IL1B, ASPM, CCNB2, NUSAP1 e CEP55 foram determinados como os principais alvos do pSS-LUAD. Camundongos BALB/c e camundongos NOD/Ltj exibiram expressão aumentada das citocinas inflamatórias IL-6 e IL-1β nos tecidos pulmonares após 21 dias de estimulação com PM2.5, ativando a via de sinalização JAK2/STAT3 e regulando positivamente a expressão dos genes associados ao tumor CCNA2, CCNB2 e CEP55, com camundongos NOD/Ltj exibindo alterações mais pronunciadas do que camundongos BALB/c. Este protocolo demonstra que a carcinogênese induzida pelo microambiente inflamatório pulmonar pode ser uma das principais razões para a alta incidência de LUAD em pacientes com SSp. Além disso, os mecanismos relacionados ao bloqueio podem ajudar a prevenir a ocorrência de LUAD em pacientes com SSp.

Introdução

A síndrome de Sjögren primária (SSp) é uma doença autoimune caracterizada por infiltração linfocítica das glândulas exócrinas e leva aos sintomas clínicos de olhos secos (xeroftalmia) e boca seca (xerostomia)1,2. A SSp também é geralmente acompanhada por manifestações extraglandulares de envolvimento, incluindo hiperglobulinemia3, doença pulmonar intersticial4, acidose tubular renal5, dano neurológico6 e trombocitopenia7, que constituem os principais fatores prognósticos adversos. Nos últimos anos, uma linha de estudos tem demonstrado que a SSp é geralmente acompanhada por um aumento da prevalência de câncer, incluindo neoplasias hematológicas e tumores sólidos 8,9,10. O câncer de pulmão é um dos cânceres mais comuns relacionados à SSP, especialmente o adenocarcinoma de pulmão (LUAD)11.

Coletivamente, uma investigação mais aprofundada sugeriu que a SSp com LUAD pode ter alguma patogênese comum subjacente. De acordo com nosso conhecimento atual, ainda não há estudos especiais que expliquem os mecanismos comuns entre as duas doenças. Recentemente, a análise de bioinformática oferece uma possibilidade potencial para revelarmos mecanismos de doenças potencialmente compartilhados entre as espécies 12,13,14. Para revelar ainda mais os mecanismos subjacentes, a análise de bioinformática é usada para a análise de alvos comuns e vias de sinalização entre pSS e LUAD, e modelos animais são posteriormente estabelecidos para verificação experimental. A revelação desses mecanismos pode ajudar a fornecer uma base de evidências para a prevenção clínica da LUAD em pacientes com SSp.

Este estudo utilizou os bancos de dados GEO e Genecard para recuperar os genes relevantes associados a pSS e LUAD. Posteriormente, os DEGs associados a pSS e LUAD foram rastreados como pSS-LUAD-DEGs. Realizamos análises de enriquecimento KEGG e GO para elucidar as funções biológicas significativas dos pSS-LUAD-DEGs. A construção da rede PPI foi usada para identificar os principais alvos, e avaliamos ainda mais a precisão diagnóstica do gene hub por meio de análises da curva ROC. Usamos camundongos NOD/Ltj como modelos animais pSS estimulados com material particulado 2,5 (PM2,5) para gerar uma reação inflamatória. QPCR, ELISA e western blotting foram realizados para verificar o estudo experimentalmente. No geral, os resultados aqui indicam que a carcinogênese induzida pelo microambiente inflamatório pulmonar pode ser uma razão crítica para a alta incidência de LUAD em pacientes com SSp. Também sugere que a ocorrência de LUAD em pacientes com SSp pode ser prevenida por mecanismos relacionados ao bloqueio.

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Protocolo

Os animais experimentais foram alojados nas instalações de animais do Hospital da Amizade China-Japão, onde as condições de alojamento atendiam ao ambiente de alimentação animal de acordo com o padrão nacional da China, Requisitos de Animais de Laboratório de Instalações Ambientais e de Alojamento (GB14925-2010). Todos os procedimentos e experimentos de cuidados com os animais obedeceram às diretrizes ARRIVE e foram baseados nos princípios 3R (redução, substituição, refinamento), aderindo às diretrizes da Lei Nacional de Bem-Estar Animal da China. Os camundongos BALB/c foram comprados da SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd., e os camundongos NOD/Ltj foram comprados da Huafukang (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.

1. Análise de bioinformática

  1. Preparação de conjuntos de dados
    1. Abra o banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO) (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)15 e use a síndrome de Sjögren primária e o adenocarcinoma de pulmão como palavras-chave para pesquisar perfis de expressão gênica. Em seguida, clique nos resultados no banco de dados GEO DataSets e selecione Homo sapiens em Principais organismos. Selecione e baixe o conjunto de dados de interesse junto com as informações da plataforma correspondentes.
    2. Abra o banco de dados Genecard (https://www.genecards.org/)16 e use asíndrome de Sjögren p rimária e o adenocarcinoma de pulmão como palavras-chave para obter os genes de pSS e LUAD. Baixe as planilhas dos genes da doença.
  2. Identificação de DEGs compartilhados entre pSS e LUAD
    1. Baixe e abra o software R (https://cran.r-project.org/)17. Instale o pacote GEOquery R, o pacote stringr R, o pacote ggplot2 R, o pacote reshape2 R e o pacote limma R no software R.
    2. Identifique e visualize genes diferencialmente expressos (DEGs) em diferentes conjuntos de dados GEO (GSE84844, GSE51092, GSE32863 e GSE75037) usando o software R e, em seguida, compare e analise a expressão gênica entre esses conjuntos de dados. Considere os genes com um valor P ajustado < 0,05 e mudança de dobra (FC) > 1,2 ou < 0,83 como DEGs.
    3. Selecione genes com um nível de expressão maior ou igual a 20 relacionados a pSS e LUAD do banco de dados Genecard.
    4. Mescle os DEGs associados ao pSS e os DEGs associados ao LUAD do banco de dados GEO e do banco de dados Genecard.
    5. Instale e carregue o pacote VennDiagram no R para obter e visualizar os DEGs associados a pSS e LUAD (pSS-LUAD-DEGs).
  3. Análise de enriquecimento da via da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG)
    1. Digite Metascape (https://metascape.org/)18. Clique em Selecionar arquivo e carregue o arquivo de formato .xlsx do pSS-LUAD-DEGs. Selecione H. sapiens em Entrada como espécie. Da mesma forma, selecione H. sapiens em Análise como Espécie.
    2. Clique em Análise personalizada. Clique em Enriquecimento e selecione Caminho KEGG. Clique em Análise de Enriquecimento e, em seguida, clique em Página do Relatório de Análise quando a análise de enriquecimento estiver concluída.
    3. Clique em Tudo em um arquivo Zip para baixar o resultado. Acesse o arquivo _ FINAL_GO.csv na pasta de Enrichment_GO de download para visualizar o resultado.
    4. Use o pacote ggplot2 para executar o programa de visualização KEGG em R.
  4. Análise de enriquecimento de Ontologia Gênica (GO)
    1. Instale e carregue o pacote clusterProfiler e enrichplot no R.
    2. Importe a lista de formato de texto de pSS-LUAD-DEGs para R.
    3. Execute os pacotes clusterProfiler e enrichplot para análise de enriquecimento GO e visualização de resultados. Defina a significância estatística na análise em um valor de P ajustado < 0,05.
  5. Construção de rede de interação proteína-proteína (PPI) e análise de módulos
    1. Digite o banco de dados Retrieval of Interacting Genes (STRING) (http://string-db.org/)19. Clique em Procurar e carregue o arquivo de pSS-LUAD-DEGs. Selecione Homo sapiens em Organismos e clique em Pesquisar.
    2. Clique em Continuar. Assim que os resultados estiverem disponíveis, clique em Configurações. Em Configurações básicas > Pontuação mínima de interação necessária, selecione Alta confiança (0,700). Marque Ocultar nós desconectados na rede em Configurações avançadas e clique em Atualizar.
    3. Clique em Exportações na barra de título para baixar o texto da relação PPI no formato TSV.
    4. Baixe e ative o software Cytoscape 3.7.1 (https://cytoscape.org/)20. Clique em Arquivo > Importar > rede do arquivo para importar o arquivo de formato TSV para construir a rede PPI.
    5. Use a ferramenta Network Analyzer para analisar os parâmetros topológicos na rede. Otimize o tamanho e a cor do nó por meio da barra de estilo no painel de controle esquerdo.
    6. Na barra de menus, selecione Ferramentas > Analisar rede. No painel Tabela , clique em Grau para classificar os componentes por grau em ordem decrescente. Pegue os 20 principais genes com graus mais altos como genes centrais.
    7. Instale e carregue os pacotes igraph e ggplot2 no R para visualizar os genes do hub por grau.
  6. Identificação e validação de genes hub
    1. Instale e carregue o pacote pROC em R.
    2. Importe a lista de genes de hub em formato de texto para R.
    3. Plote as curvas ROC (receiver operating characteristic) dos genes do hub e calcule a área sob os valores da curva ROC (AUC).
      NOTA: Consulte o Arquivo de Codificação Suplementar 1 para obter o código R para filtrar DEGs.

2. Verificação experimental

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.

  1. Preparação animal
    1. Alimentar 12 ratinhos BALB/c fêmeas com nove semanas de idade e 12 ratinhos NOD/Ltj fêmeas com nove semanas de idade de forma adaptativa durante 1 semana.
    2. Use uma tabela de números aleatórios para alocar uniformemente 12 camundongos BALB/c fêmeas de nove semanas de idade no grupo de controle em branco e no grupo PM2.5. Da mesma forma, divida uniformemente 12 camundongos NOD / Ltj fêmeas de nove semanas de idade no grupo pSS e no grupo pSS-PM2.5.
  2. Preparação da suspensão de partículas 2.5 (PM2.5)
    NOTA: PM2.5 pode induzir a ocorrência e o desenvolvimento de LUAD relacionado à inflamação no modelode camundongo 21. Camundongos BALB/c e camundongos NOD/Ltj foram induzidos por PM2.5 a desenvolver alterações relacionadas à inflamação. De acordo com o método descrito por Piao et al.22, a concentração da suspensão de PM2,5 foi preparada a 1 mg/mL.
    1. Pese as membranas de fibra de quartzo PM2.5, corte-as em pedaços de 2 cm × 2 cm e mergulhe-as em um béquer contendo uma quantidade adequada de água deionizada.
    2. Fechar o copo e sonicá-lo num sonicador em banho-maria a 37 °C durante 30 minutos de cada vez. Repita este processo 3 vezes até que as partículas estejam completamente dissolvidas.
    3. Filtre o líquido no béquer através de 16 camadas de gaze médica estéril e, em seguida, esprema qualquer umidade residual da gaze.
    4. Colocar o filtrado num prato raso e congelá-lo em blocos de gelo num congelador a -20 °C. Em seguida, use um instrumento de liofilização (-52 ° C, 0,1 mbar, 48 h) para secar os blocos de gelo do filtrado e coletar as partículas em pó.
    5. Dissolva as partículas em pó completamente em solução salina para preparar uma suspensão de PM2,5 com uma concentração de 1 mg/mL. Despeje a suspensão PM2.5 em uma garrafa de vidro, coloque-a em um esterilizador de alta pressão e aplique alta pressão e temperatura (15 min a 121 ° C, 15 psi) para esterilização.
    6. Realize agitação ultrassônica (200 W, 10 s de agitação, 10 s de repouso, por 3 ciclos). Após o tratamento, guarde-o em uma geladeira a 4 °C para uso posterior.
  3. Estabelecimento do modelo de camundongo PM2.5
    NOTA: O grupo PM2.5 e o grupo pSS-PM2.5 receberam suspensão de PM2.5 por gotejamento da traqueia uma vez a cada 3 dias durante 28 dias, com cada dose sendo de 0,1 mL. O grupo controle em branco e o grupo pSS receberam soro fisiológico por gotejamento da traqueia uma vez a cada 3 dias por 28 dias, sendo cada dose de 0,1 mL.
    1. Injete uma mistura de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) no camundongo. Confirme o plano cirúrgico da anestesia verificando se há falta de resposta a uma pinça do dedo do pé e garantindo o relaxamento muscular completo. Monitore continuamente os reflexos, a respiração e a resposta geral para garantir que a anestesia adequada seja mantida durante todo o procedimento até que todas as etapas sejam concluídas.
    2. Posicione o mouse no limitador de pequenos animais com o abdômen voltado para cima, a cabeça elevada e a cauda abaixada em um ângulo de 45°. Use linha fina para enrolar os incisivos superiores do mouse, puxando-os para cima, e prenda a rosca em um parafuso no suporte do animal, garantindo a exposição total da cavidade oral do mouse.
    3. Abra a lâmpada de luz fria e acenda a luz na pele do pescoço do rato. Use uma pinça para puxar a língua do rato, expondo totalmente a glote. Observe dentro da cavidade oral do camundongo um ponto de luz recorrente de abertura e fechamento, que indica a posição da abertura das vias aéreas do camundongo.
    4. Insira a agulha venosa de demora 18 G na traqueia do camundongo, puxe o núcleo da agulha, coloque o fio de algodão na extremidade externa da agulha venosa e confirme o sucesso ao observar o fio de algodão se movendo com os movimentos do peito do camundongo.
    5. Aspire 0,2 mL de ar primeiro usando uma seringa de 1 mL, depois aspire 0,1 mL de suspensão PM2,5, seguido de aspiração de mais 0,2 mL de ar. Injetar a mistura através da agulha venosa de demora 18 G na traqueia.
    6. Retire a agulha venosa de demora 18 G. Prenda o porta-animais na posição vertical e gire-o no sentido horário e anti-horário 30 vezes para distribuir uniformemente a suspensão PM2.5 nos pulmões do camundongo. Em seguida, estenda o pescoço do rato e coloque-o de lado para evitar asfixia.
  4. Coleta de espécimes
    NOTA: Colete amostras no29º dia do experimento para análises subsequentes de biologia molecular.
    1. Verifique a conexão do sistema de eutanásia e ligue a alimentação do controlador. Abra a válvula do cilindro de dióxido de carbono (CO2).
      NOTA: Não encha previamente a câmara de eutanásia antes de colocar os animais dentro.
    2. Coloque os camundongos na câmara e infunda CO2 a 30% -70% do volume da câmara por minuto. Exponha os camundongos ao CO2 por 5 min, garantindo que eles estejam imóveis, sem respirar e com as pupilas dilatadas. Desligue a válvula do cilindro de CO2 e observe por mais 5 minutos para confirmar a morte.
    3. Coloque o camundongo sacrificado em decúbito dorsal em uma placa de dissecação limpa. Exponha a traqueia, o coração e os pulmões.
    4. Use tesouras e fórceps para remover a pele e os músculos que cobrem as regiões ventral torácica e do pescoço. Use tesouras e fórceps para fazer incisões ao longo das bordas das costelas em ambos os lados da cavidade torácica para expor a cavidade torácica que contém o coração e os pulmões. Em seguida, corte a clavícula para criar uma abertura larga o suficiente para examinar minuciosamente os lobos pulmonares esquerdo e direito.
    5. Extirpar os músculos do pescoço que se estendem do esterno e costelas até a mandíbula. Insira uma tesoura abaixo da borda anterior das costelas e faça incisões em ambos os lados para remover a porção óssea que cobre a traqueia.
    6. Segure a traqueia perto da mandíbula com uma pinça e faça uma incisão transversal completa usando uma tesoura colocada acima da pinça.
    7. Puxe suavemente a traqueia com uma pinça, cortando as conexões do tecido ventral com uma tesoura até que todo o tecido torácico seja removido do corpo.
    8. Coloque os pulmões na bancada. Enxágue o resíduo da superfície do tecido pulmonar com soro fisiológico, seque com papel de filtro, alíquota em criotubos e armazene a -80 °C.
  5. Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR)
    1. Moa o tecido pulmonar em pó usando uma argamassa contendo nitrogênio líquido.
    2. Pese 20 mg de tecido moído usando uma balança de precisão, combine-o com 750 μL de Buffer RL em um tubo de centrífuga, misture bem usando um misturador de vórtice e deixe repousar em temperatura ambiente (RT) por 3 min. Em seguida, centrifugue-o a 14.000 x g por 5 min em RT e colete o sobrenadante.
    3. Coloque a mini coluna de filtro de DNA genômico (gDNA) em um tubo de coleta de 2 mL. Transferir o sobrenadante para a mini-coluna do filtro de ADNg e centrifugar a 14.000 x g durante 2 min a RT.
    4. Descarte a mini coluna do filtro gDNA. Adicione um volume igual de etanol a 70% ao filtrado e misture pipetando para cima e para baixo 5 vezes.
    5. Coloque a mini coluna de RNA em um tubo de coleta de 2 mL. Transfira 750 μL da mistura para a mini coluna de RNA e centrifugue a 12.000 x g por 1 min em RT.
    6. Descarte o filtrado e coloque a mini coluna de RNA de volta no tubo de coleta de 2 mL. Adicione 500 μL de tampão RW1 à mini coluna de RNA e centrifugue a 12.000 x g por 1 min em RT.
    7. Descarte o filtrado e coloque a mini coluna de RNA de volta no tubo de coleta de 2 mL. Adicione 500 μL de tampão RW2 à mini coluna de RNA. Centrifugue a 12.000 x g por 1 min em RT. Repita esta etapa mais uma vez.
    8. Descarte o filtrado e coloque a mini coluna de RNA de volta no tubo de coleta de 2 mL. Centrifugue a 12.000 x g por 2 min em RT.
    9. Transfira a mini-coluna de RNA para um tubo de centrífuga de 1,5 mL, adicione 100 μL de água livre de RNase ao centro da membrana da coluna e incube em RT por 2 min. Em seguida, centrifugue a 12.000 x g por 1 min em RT. Descarte a mini coluna de RNA e armazene a solução de RNA a -80 ° C.
    10. Pegue 2 μL da solução de RNA e meça-a usando o espectrofotômetro NanoDrop de acordo com o manual do equipamento para determinar sua concentração e qualidade.
      NOTA: O estudo selecionou as proporções 260/280 e 260/230 para o controle de qualidade do RNA.
    11. Prepare a solução de RNA adicionando sequencialmente os seguintes componentes em um tubo de microcentrífuga: 1 μg de RNA total, 4 μL de MgCl2 (25 mM), 2 μL de tampão 10x de transcrição reversa, 2 μL de mistura dNTP (10 mM), 0,5 μL de inibidor de ribonuclease recombinante, 15 unidades de transcriptase reversa, 0,5 μg de oligo (dT) 15 primer, e adicione água sem nuclease a 20 μL. Misture o conteúdo suavemente para coletar todo o líquido no fundo do tubo.
      NOTA: As soluções de coquetel devem ser preparadas para garantir uma síntese de cDNA e quantificação de RNA mais consistentes.
    12. Transcreva reversamente a solução de RNA de 20 μL em cDNA, incubando-a a 42 ° C por 15 min, desnaturando-a a 95 ° C por 5 min e, em seguida, resfriando-a a 4 ° C, seguida de armazenamento a -20 ° C.
    13. Combine e misture completamente 6,4 μL de água destilada, 10 μL de master mix de PCR em tempo real SYBR Green, 2 μL da solução de cDNA obtida, 0,8 μL de primer direto (10 μM) e 0,8 μL de primer reverso (10 μM) (Tabela 1) para preparar o sistema de reação.
    14. Execute a reação no instrumento de PCR para obter os valores do limiar de ciclo (CT) para os genes-alvo e genes de referência.
      1. Definir a desnaturação inicial a 95 °C durante 60 s no início de cada ciclo de PCR.
      2. Durante os ciclos de PCR, realizar desnaturação a 95 °C por 15 s, recozimento a 60 °C por 15 s e extensão a 72 °C por 45 s, coletando dados durante a etapa de extensão. Realize um total de 40 ciclos de PCR.
      3. Depois de completar os ciclos de PCR, execute a análise da curva de fusão automaticamente usando o instrumento de PCR.
        NOTA: Se a curva de fusão mostrar um pico duplo ou formato de pico irregular, isso indica que pode haver um problema com o experimento.
    15. Determine os níveis de expressão relativa de cada gene alvo usando o método 2-ΔΔCT, seguido de análise estatística adicional. Use a seguinte lista de fórmulas para o método 2-ΔΔCT:
      ΔCT (teste) = CT (alvo, teste) - TC (ref, teste)
      ΔCT (calibrador) = CT (alvo, calibrador) - CT (ref, calibrador)
      ΔΔCT = ΔCT (teste) -ΔCT (calibrador)
      2-ΔΔCT = Mudança de dobra na expressão gênica

Nome do geneSequência (5 ′ a 3 ′)
Mouse CCNA2 para frenteCCCAGAAGTAGCAGAGTTTGTG
Mouse CCNA2 reversoTTGTCCCGTGACTGTGTAGAG
Mouse ASPM para frenteCTTATTCAGGCTATGTGGAGGA
Mouse ASPM reversoCCAGGCTTGAATCTTGCAG
Mouse CCNB2 para frenteTTGAAATTTGAGTTGGGTCGAC
Mouse CCNB2 reversoCTGTTCAACATCAACCTCCC
Mouse NUSAP1 para frenteCTCCCTCAAGTACAGTGACC
Mouse NUSAP1 reversoTTTAACAACTTGGTTGCCCTC
Mouse CEP55 para frenteCCGCCAGAATGCAGCATCAAC
Mouse CEP55 reversoAGTGGGAATGGCTGCTCTGTGA

Tabela 1: Sequências primárias para PCR quantitativo em tempo real.

  1. Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)
    NOTA: De acordo com as instruções do kit ELISA, equilibre o kit ELISA com RT, prepare um tampão de lavagem e dilua o padrão. Diluir 90 μL de anticorpo biotinilado concentrado com 8910 μL de tampão de diluição de anticorpo biotinilado para preparar uma solução de trabalho de anticorpo biotinilado (1:100) com antecedência. Da mesma forma, dilua 90 μL de conjugado enzimático concentrado com 8910 μL de tampão de diluição do conjugado enzimático para preparar uma solução de trabalho de conjugado enzimático (1:100) com antecedência.
    1. Triture o tecido pulmonar em pó usando uma argamassa contendo nitrogênio líquido.
    2. Pese 50 mg de tecido pulmonar usando uma balança de precisão, combine-o com 1 mL de PBS em um tubo de moagem e triture-o completamente no gelo.
    3. Centrifugar a mistura a 4 °C, 3000 x g durante 5 min e recolher o sobrenadante como amostra.
    4. Colocar 100 μL de amostra/padrão de diferentes concentrações nos respectivos alvéolos da placa ELISA, cobrir os alvéolos de reação com película adesiva de vedação e incubar numa incubadora a 37 °C durante 90 min.
    5. Use uma lavadora de placas automatizada para lavar a placa ELISA 4 vezes, injetando 350 μL de tampão de lavagem de cada vez com um intervalo de 30 s entre a injeção e a aspiração.
    6. Adicione 100 μL de solução de trabalho de anticorpos biotinilados por poço, sele os poços com filme de vedação adesivo e incube em uma incubadora a 37 °C por 60 min. Em seguida, lave a placa ELISA 4 vezes seguindo o procedimento descrito anteriormente.
    7. Adicione 100 μL de solução de trabalho de conjugado enzimático por poço, sele os poços com filme de vedação adesivo e incube em uma incubadora a 37 °C por 30 min. Em seguida, lave a placa ELISA 4 vezes seguindo o procedimento descrito anteriormente.
    8. Adicione 100 μL de agente cromogênico por poço, proteja da luz e incube em uma incubadora a 37 ° C por 10-20 min. Em seguida, adicione 100 μL de solução de parada por poço, misture bem e meça imediatamente a densidade óptica em valores de 450 nm (OD450).
      NOTA: Uma pipeta de 8 canais é usada para adicionar a solução de trabalho de anticorpo biotinilado, a solução de trabalho do conjugado enzimático e a solução de parada, o que permite concluir a adição rapidamente e evitar possíveis erros.
    9. Gere uma curva padrão usando o software CurveExpert (http:// curveexpert.webhop.net/) para calcular a concentração das substâncias-alvo em cada poço de amostra.
  2. Western blotting
    1. Prepare a solução de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) misturando tampão de lise RIPA, fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF) e inibidor de fosfatase na proporção de 100:1:1 e coloque-o no gelo.
    2. Triture os tecidos pulmonares em pó usando uma argamassa contendo nitrogênio líquido.
    3. Pesar 20 mg de tecido pulmonar com precisão usando uma balança de precisão e adicioná-lo a 250 μL da solução misturada RIPA.
    4. Incubar a mistura em gelo durante 20 min, centrifugar a 12 000 x g durante 15 min a 4 °C e recolher o sobrenadante como amostra.
    5. Prepare a solução de trabalho BCA misturando o Reagente A e o Reagente B do kit BCA na proporção de 50:1.
      1. Diluir o padrão para preparar soluções-padrão diluídas com concentrações de 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 e 0,5 mg/ml. Adicionar 20 μl de cada solução-padrão e colher a amostra em alvéolos separados de uma placa de 96 poços e incubar a 37 °C durante 30 min.
      2. Medir a absorvância a 490 nm utilizando o leitor de microplacas. Ajustar a curva-padrão utilizando as concentrações e absorvâncias das soluções-padrão e calcular a concentração da amostra23. Ajustar as concentrações da amostra para o mesmo nível utilizando a solução mista RIPA.
    6. Misture o sobrenadante de proteína com tampão de carga 5x na proporção de 4:1 em um tubo de centrífuga. Ferva em um banho de metal por 5 min, depois centrifugue a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C e colete o sobrenadante.
    7. Realize a separação de proteínas usando eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e transfira as proteínas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) eletricamente. Bloqueie a membrana de PVDF com 5% de leite desnatado em RT por 1 h.
    8. Incubar a membrana de PVDF com anticorpo primário (diluído a 1:1000) a 4 °C durante 12 h, seguido de lavagem três vezes com TBST durante 10 min cada, e depois incubar com anticorpo secundário (diluído a 1:5000) a RT durante 2 h.
    9. Detecte as bandas alvo usando um sistema de imunoensaio de eletroquimioluminescência totalmente automático e realize análises quantitativas usando o software integrado.
  3. Análise estatística
    1. Utilize o software apropriado para análise estatística.
    2. Apresentar dados experimentais como média ± desvio padrão.
    3. Determine a significância usando a análise de variância (ANOVA) unidirecional.
    4. Considere P < 0,05 como estatisticamente significativo.

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Resultados

Um total de 3290 DEGs foram identificados a partir dos 23348 genes em GSE84884 (pSS), incluindo 2659 genes regulados positivamente e 631 genes regulados negativamente (Figura 1A). Para GSE51092 (pSS), um total de 3290 DEGs foram identificados a partir dos 11409 genes, incluindo 667 genes regulados positivamente e 587 genes regulados negativamente (Figura 1B). O banco de dados GeneCards obteve 102 DEGs relacionados ao SSp ovariano, e o escore de correlação dos cr...

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Discussão

Embora a SSp seja considerada uma doença caracterizada principalmente pela invasão de glândulas exócrinas, os danos das glândulas extra-glândulas não podem ser ignorados24. Os pulmões representam um órgão-alvo para a SSp, e o envolvimento pulmonar é uma manifestação extraglandular comum da SSp, geralmente envolvendo infiltração linfocítica da mucosa brônquica e interstício pulmonar25. Pesquisas indicam que pelo menos 20% dos pacientes com S...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelo National High Level Hospital Clinical Research Funding (2023-NHLHCRF-BQ-01) e pelo Youth Project of China-Japan Friendship Hospital (No.2020-1-QN-8).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Marcador de proteína pré-fabricada de 3 coresEpizymeWJ103Blot
Antibody Dilution BufferEpizymePS119Western Blot
BCA Protein Quantification KitEpizymeZJ101Western Blot
Cytoscape 3.7.1 softwareInstituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIGMS), National Institutes of Health (NIH)Versão 3.7.1.Software de código aberto para análise e visualização de redes biológicas
ECL Fluido LuminosoEpizymeSQ203Western Blot
Electrophoresis BufferEpizymePS105SWestern Blot
GraphPad Prism 10.0GraphPadVersão 10.0Análise de dados
HRP-conjugado Cabra anti-Rabbit IgG (H + L) (AS014)abclonalAS014Western Blot
JAK2 AntibodyCell Signaling Technology3230TBlot
Mouse IL-1β Kit ELISAPequim  4A  Biotech Co., LtdCME0015Kit ELISA
Mouse IL-6 ELISABeijing  4A  Biotech Co., LtdCME0006
o cocktail do inibidor da fosfatase de ELISA (100×)EpizymeGRF102Western Blot
Phospho-JAK2 (Tyr1007/1008)Tecnologia de sinalização celular3776SWestern Blot
Phospho-STAT3 (Tyr705)Tecnologia de sinalização celular9145SWestern Blot
Protease Inhibitor Cocktail (100 &vezes;)Western BlotEpizymeGRF101
(5 vezes;)Membrana EpizymePS108Western Blot
PVDFMilliporeIPVH00010Western Blot
Software RBase para Computação EstatísticaNão AplicávelSoftware de análise estatística e linguagem de programação usados para aplicações de análise de dados, visualização e aprendizado de máquina
Ensaio de imunoprecipitação de rádioEpizymePC101Western Blot
Sistema de Transcrição ReversaPromegaA3500PCR
SDS-PAGEEpizymeLK303Western Blot
SDS-PAGE Tampão de Carga de Proteína (5 &vezes;)TecnologiaWestern BlotLT103
Blot
SYBR Green Realtime PCR Master MixTOYOBOQPK-201PCR
TBST (10×)EpizymePS103Western Blot
Tampão de Transferência Western Blot (10&vezes;)EpizymePS109Western Blot
β-ActinAnticorpo abclonalAC026Western Blot
Western Western de anticorpos de anticorpos Tampão de bloqueio rápido livre de proteína de de sinalização celular de anticorpos STAT3 Epizyme Western

Referências

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