Neste artigo, propomos um protocolo para fabricação de esferoides híbridos usando pinças ópticas. Este método permite o controle preciso dos estágios iniciais do processo de formação do esferóide, o que é inatingível por outros métodos.
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Artigo de método
Usando pinças ópticas para a geração de esferoides híbridos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A cultura de células bidimensionais (2D) ainda está entre os modelos mais comumente usados na pesquisa pré-clínica do câncer. No entanto, os modelos in vitro tridimensionais (3D) parecem avaliar o ambiente in vivo com mais precisão, incluindo uma morfologia arquitetônica, microambiente e respostas a medicamentos mais relevantes.
O aprisionamento óptico usa um ou mais feixes de laser focados para manipular de forma não invasiva a posição, o movimento, a interação e a dinâmica das estruturas em nano e microescala. As pinças ópticas (OT) encontraram inúmeras aplicações em biologia celular; no entanto, seu potencial na pesquisa do câncer ainda é subvalorizado. Neste artigo, recomendamos um protocolo não invasivo para formação de esferoides de células linfoma-estromais com o uso de pinças ópticas. Este método não apenas constrói os esferoides híbridos de novo , mas também permite controlar o número de células anexadas e o tempo de formação da adesão, fornecendo uma importante fonte de informação para a engenharia de tecidos. Além disso, a OT permite o estudo dos estágios iniciais da formação de esferóides híbridos, o que não pode ser alcançado com técnicas padrão em massa. É importante ressaltar que o modelo descrito pode ser usado para estudar as mudanças mínimas na adesão induzidas por drogas anticâncer. Este protocolo pode ser facilmente aplicado a outros tipos de células.
Introdução
Modelos celulares tridimensionais (3D) estão acelerando a pesquisa do câncer porque se assemelham melhor ao tecido tumoral em várias propriedades funcionais e estruturais. Estes incluem, entre outros, a produção de matriz extracelular, interação entre células, manutenção de gradientes de nutrientes e oxigênio e respostas semelhantes aos tratamentos 1,2,3,4. Recentemente, para refletir melhor as condições in vivo, modelos 3D heterogêneos avançados envolvendo vários tipos de células foram desenvolvido....
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Protocolo
1. Fabricação de micromoldes à base de gel de agarose
NOTA: Técnicas assépticas adequadas são essenciais ao manusear todas as culturas de células. Todos os reagentes utilizados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais. Prepare três géis com MSCs para um único experimento, conforme mostrado na Figura 1A.
Figura 1: Preparação de esferóides de ....
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Resultados
Nossos resultados anteriores mostraram que as células estromais mesenquimais cultivadas com células de linfoma constituem o núcleo estromal homogêneo ao qual as células cancerígenas se ligam uniformemente18. Neste estudo, projetamos com sucesso o esferóide híbrido humano que consiste em células estromais mesenquimais e células de linfoma usando pinças ópticas personalizadas. A Figura 2B mostra um esferóide representativo em um microscópio de campo claro, uma parte ess.......
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Discussão
Neste estudo, os esferoides híbridos do núcleo estromal mesenquimal e das células do linfoma foram projetados em tempo real com o uso de pinças ópticas. Novas tecnologias baseadas em laser, incluindo sistemas de captura, estão agora disponíveis comercialmente e estão se tornando cada vez mais populares. No entanto, até o momento, a maioria das pinças ópticas continua a ser instrumentos personalizados; Assim, a calibração, os procedimentos de operação e as geometrias experimentais podem v.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Autores sinceros agradecimentos Nicholas Czarnik, cuja edição cuidadosa melhorou significativamente a clareza do estudo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| µ-Prato 35 mm, fundo de vidro alto | IBIDI | 81158 | |
| 12-256 micro-molde 3D PetriDish | Microtissues Inc., RI, EUA | 12-256TR | |
| 3 µ m microesferas de poliestireno | Polysciences | 17134-15 | |
| anti CD20 anticorpo (clone L26) | Dako | IS604 | |
| Contador de Células Automatizado, EVE | NanoEntek | EVE/ EVE-MC | |
| Autostainer Link 48 | Dako | D09634 | |
| Câmera | Incubadora de CO2 Olympus | U-TV0.63XC | |
| CelCulture | Esco Technologies, Inc. | ||
| , EVE | NanoEntek | NE-EVS | |
| Linha Celular HS-5 | ATCC | CRL-3611 | |
| Linha Celular Ri-1 | DSMZ | ACC 585 | |
| Soro Fetal Bovino | Gibco | A5256701 | |
| Microscópio de Fluorescência | Programa Olympus | BX43 | |
| ImageJ | Institutes of Health, MD, EUA | ||
| Microscópio invertido | Olympus | IX73 | |
| Kit de reagentes vivos/mortos | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4 | Gibco | 10010023 | |
| RPMI 1640 Médio | Gibco | 11875093 | |
| Solução de cloreto de sódio | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Solução de cloreto de sódio 0,9%, estéril | Reagentes ITW ReITW, S.R.L.agents, S.R.L. | A1671 | |
| Solução de Azul de Tripano, 0,4% | Gibco | 15250061 | |
| Enzima TrypLE Express (1X), sem vermelho de fenol | Gibco | 12604013 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol | Gibco | 25300096 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Configuração de pinças ópticas | |||
| Espelhos dicróicos | Thorlabs | DMSP805R | |
| Câmera digital | Mikrotron GmbH | MC1362 | |
| Sistema de varredura XY de espelho Galvano | Thorlabs | GVS002 | |
| Microscópio invertido | Lente Olympus | IX71 | |
| 1 | Lente Thorlabs | AC254-050-B-ML | |
| 2 | Lente Thorlabs | AC508-200-B-ML | |
| Nd:YAG 1064 nm laser | Laser Quantum | Ventus |
Referências
- Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744(2020).
- Fontoura, J. C., et al. Comparison of 2D and 3D cell culture models for cell growth, gene expression a....
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Reimpressões e permissões
