Artigo de método

Análise por citometria de massa das respostas imunes sistêmicas e locais no carcinoma hepatocelular

DOI:

10.3791/67425

⸱

25 de abril de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, The First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um método abrangente de análise de citometria de massa (citometria por tempo de voo [CyTOF]) para avaliar as respostas imunes sistêmicas e locais no carcinoma hepatocelular (CHC). A abordagem visa fornecer informações sobre a paisagem imunológica do CHC, oferecendo uma compreensão mais profunda do microambiente tumoral e dos mecanismos imunológicos associados.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O carcinoma hepatocelular (CHC) é uma das formas mais comuns e mortais de câncer de fígado em todo o mundo. Apesar dos avanços no tratamento, o prognóstico para pacientes com CHC permanece ruim devido à complexa interação de fatores genéticos, ambientais e imunológicos que impulsionam sua progressão. Compreender o cenário imunológico do CHC é crucial para o desenvolvimento de terapias eficazes, particularmente no campo da imunoterapia, que traz grandes promessas para melhorar os resultados dos pacientes. Este estudo emprega a tecnologia de citometria de massa (citometria por tempo de voo [CyTOF]) para investigar as respostas imunes sistêmicas e locais em pacientes com CHC. Ao analisar amostras de sangue periférico e tumores, a pesquisa visa identificar populações únicas de células imunes e seus estados funcionais associados à progressão do CHC. Os resultados fornecem uma visão abrangente do cenário imunológico no CHC, destacando potenciais biomarcadores e alvos terapêuticos. Essa abordagem oferece informações valiosas sobre os mecanismos imunológicos subjacentes ao CHC e abre caminho para o desenvolvimento de imunoterapias mais eficazes para essa malignidade.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O carcinoma hepatocelular (CHC) é o câncer primário de fígado mais comum e um importante problema de saúde global devido às suas altas taxas de incidência e mortalidade1. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, o CHC é o quinto câncer mais comum e a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo2. É particularmente prevalente em regiões com altas taxas de infecções crônicas por hepatite B e C, como o Leste Asiático e a África Subsaariana3. Os principais fatores de risco incluem hepatite viral, cirrose e síndrome metabólica4. O CHC requer tratamento de longo prazo, impondo encargos físicos e financeiros substanciais, ressaltando a necessidade de prevenção eficaz, detecção precoce e estratégias de tratamento inovadoras5.

O sistema imunológico desempenha um papel crucial no desenvolvimento do CHC. O fígado é um órgão imunologicamente ativo com abundância de células imunes, incluindo macrófagos residentes no fígado, células natural killer (NK) e células T, que são essenciais para monitorar e eliminar células anormais6. No entanto, o CHC pode escapar da vigilância imunológica expressando moléculas imunossupressoras, recrutando células imunossupressoras e alterando o microambiente tumoral 7,8. Esse escape imunológico não apenas promove o crescimento do tumor e a metástase, mas também afeta a resposta à imunoterapia 9,10.

As respostas imunes sistêmicas e locais no microambiente tumoral são fatores-chave que influenciam a progressão do câncer e os resultados terapêuticos. As respostas imunes sistêmicas envolvem células imunes circulantes que podem reconhecer e atacar células tumorais distantes, como células T periféricas, células NK e monócitos que podem atingir células tumorais em todo o corpo. As respostas imunes locais se concentram na atividade das células imunes dentro do microambiente tumoral, incluindo linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), macrófagos associados ao tumor (TAMs) e células T reguladoras (Tregs). Embora os TILs frequentemente exerçam efeitos citotóxicos contra células tumorais, TAMs e Tregs normalmente contribuem para um ambiente imunossupressor que suporta o crescimento do tumor11,12. As células tumorais e as células estromais podem remodelar o microambiente tumoral para promover a imunossupressão e evitar a vigilância imunológica. A interação entre as respostas imunes sistêmica e local determina a eficácia geral da imunidade antitumoral11. Compreender essa interação pode ajudar no desenvolvimento de estratégias de imunoterapia mais eficazes.

A citometria de fluxo tradicional e a imuno-histoquímica, embora amplamente utilizadas em estudos imunológicos, exibem limitações significativas quando se trata de analisar paisagens imunológicas complexas devido à sua incapacidade de realizar análises abrangentes e de alta dimensão. A citometria de fluxo é altamente eficaz para detectar marcadores de superfície e funcionais no nível de célula única; no entanto, sua capacidade de análise simultânea de múltiplos marcadores é restrita, muitas vezes limitada por sobreposição espectral e restrições práticas sobre o número de etiquetas fluorescentes que podem ser usadas13,14. A imuno-histoquímica, por outro lado, fornece informações valiosas sobre o contexto tecidual de marcadores específicos, mas é igualmente prejudicada pelo número limitado de marcadores analisáveis e pelas dificuldades inerentes de obter avaliações robustas, quantitativas e de alta dimensão15.

Para caracterizar efetivamente ambientes imunológicos complexos, técnicas de alta dimensão como citometria de massa (citometria por tempo de voo [CyTOF]) são essenciais. A citometria de massa é uma tecnologia avançada que emprega espectrometria de massa para analisar vários marcadores de proteínas em células únicas. Ele permite a análise multiparamétrica de células individuais sem os problemas de sobreposição espectral observados na citometria de fluxo tradicional16. Ao usar anticorpos marcados com metal, ele pode medir dezenas de marcadores simultaneamente, oferecendo uma visão abrangente e imparcial dos fenótipos e funções celulares17. Por exemplo, Gadalla et al. desenvolveram um painel CyTOF com mais de 40 parâmetros para a análise de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e tecido tumoral, demonstrando sua vantagem na imunofenotipagem de alta dimensão18. A citometria de fluxo tradicional, com seu número limitado de parâmetros detectáveis, foi incapaz de identificar essas populações de células raras exibindo fenótipos únicos. Em contraste, a citometria de massa permitiu uma avaliação abrangente dos estados funcionais dessas células, fornecendo uma caracterização mais detalhada e robusta. Behbehani e col. utilizaram citometria de massa para analisar amostras de medula óssea de pacientes com síndromes mielodisplásicas (SMD), identificando e caracterizando com sucesso células progenitoras hematopoiéticas aberrantesraras 18. A capacidade da citometria de massa de detectar simultaneamente mais de 40 marcadores de superfície e intracelulares aumentou significativamente a detecção desses subconjuntos de células de baixa frequência19. Esses recursos superam as limitações tradicionais e fornecem insights mais profundos sobre as paisagens imunológicas, impulsionando o progresso na imunologia e no desenvolvimento terapêutico. A capacidade de traçar um perfil abrangente dos fenótipos e funções celulares no nível de uma única célula avança muito na compreensão dos processos imunológicos e auxilia no desenvolvimento de terapias direcionadas.

A citometria de massa fornece informações abrangentes sobre as populações de células imunes sistêmicas e locais no CHC, detectando simultaneamente vários marcadores de proteínas. Essa tecnologia pode distinguir entre vários tipos de células T dentro do microambiente tumoral, como células T efetoras, células T reguladoras (Tregs) e células T exaustas, elucidando seus papéis específicos na progressão do tumor. Ao utilizar a citometria de massa, os pesquisadores podem identificar marcadores imunológicos associados ao prognóstico do CHC20. Por exemplo, subconjuntos de células T com alta expressão da Proteína de Morte Celular Programada 1 (PD-1) podem servir como preditores da resposta de um paciente aos inibidores do checkpoint imunológico21. Além disso, facilita a descoberta de novos alvos terapêuticos, identificando moléculas imunossupressoras específicas, fornecendo assim uma base para estratégias de tratamento personalizadas. A capacidade da tecnologia de detectar vários marcadores e sua resolução de célula única a tornam particularmente vantajosa para descobrir novos alvos terapêuticos e projetar imunoterapias combinadas. Essa abordagem avançada tem um potencial significativo para melhorar os resultados do tratamento em pacientes com CHC, oferecendo uma compreensão detalhada do cenário imunológico e permitindo o desenvolvimento de intervenções terapêuticas personalizadas.

Este estudo tem como objetivo utilizar a citometria de massa para analisar o perfil de células imunes sistêmicas e locais de pacientes com CHC. Os objetivos são caracterizar as populações de células imunes, correlacionar essas características com resultados clínicos e respostas terapêuticas e identificar marcadores imunológicos específicos e subconjuntos de células associados ao prognóstico do CHC. Ao elucidar os papéis de várias células imunes nas respostas ao tratamento, este estudo busca fornecer uma base para estratégias de tratamento personalizadas. Espera-se que as descobertas otimizem as imunoterapias existentes e ofereçam informações valiosas para o desenvolvimento de novos tratamentos, com o objetivo de melhorar a sobrevida geral e a qualidade de vida dos pacientes com CHC.

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Protocolo

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As etapas para coleta de amostras de sangue e CHC, isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), dissociação de célula única e coloração são descritas no plano a seguir. Os reagentes e materiais experimentais estão todos listados na Tabela de Materiais. Todos os experimentos foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética do Primeiro Hospital Afiliado, Faculdade de Medicina, Universidade de Zhejiang, garantindo que a coleta de amostras tumorais não interferisse no diagnóstico patológico. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os indivíduos humanos.

1. Isolamento de PBMCs

  1. Retire uma amostra de sangue da veia de pacientes com CHC e use um tubo cheio de um anticoagulante para evitar a coagulação do sangue. Amostras de sangue foram obtidas de 4 pacientes (2 homens e 2 mulheres) com idades entre 50 e 60 anos, com idade média de 55 anos. Para cada paciente, colete 10-20 mL de sangue periférico para garantir volume suficiente para o isolamento subsequente de PBMCs, minimizando o desconforto do paciente.
  2. Retire um volume específico de sangue (por exemplo, 6 mL) e adicione um volume igual de líquido de separação de linfócitos do sangue periférico (Ficol-paque ou Lymphoprep) a um tubo de centrífuga de 15 mL.
    NOTA: O volume total não deve exceder 12 mL para permitir espaço para uma mistura adequada e evitar transbordamento; o volume máximo recomendado para um tubo de centrífuga de 15 mL é de 14 mL.
  3. Incline o tubo da centrífuga a 45° e adicione lentamente o sangue ao longo da parede do tubo, colocando cuidadosamente o sangue lentamente em cima do líquido de separação de linfócitos do sangue periférico para evitar misturar as duas camadas.
    NOTA: Uma pipeta pode ser usada para adicionar sangue lentamente ao longo da parede do tubo.
  4. Coloque o tubo da centrífuga na centrífuga e ajuste a aceleração em 8 e a desaceleração em 3. Centrifugar a 450 x g, 4 °C, durante 30 min. Após a centrifugação, 4 camadas são formadas no tubo de ensaio, de cima para baixo: camada de plasma, camada de PBMCs (camada de membrana branca), camada Ficol-Paque e camada de glóbulos vermelhos e granulócitos.
  5. Usando uma pipeta, colete cuidadosamente a camada de PBMCs em um novo tubo de centrífuga estéril. Adicione 3 vezes o volume de PBS e centrifugue a 500 x g a 4 ° C por 5 min. Após a centrifugação, um pellet é formado no fundo do tubo.
  6. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta, adicione 1 mL de solução salina tamponada com fosfato de soro bovino fetal a 2% (FBS-PBS) para ressuspender as células e, em seguida, adicione 3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC). Centrifugue a 500 x g a 4°C por 5 min.
  7. Certifique-se de que não haja glóbulos vermelhos no fundo do tubo, indicando que os glóbulos vermelhos foram completamente lisados. Ressuspenda as células em 2% de FBS-PBS e prossiga diretamente com os experimentos subsequentes, ou adicione a solução de criopreservação celular e armazene a -80 ° C por 2-3 meses.
    NOTA: Como diretriz geral, para ressuspensão, use 0,5 mL de 2% de FBS-PBS por 1 x 106 células. A contagem de células é determinada usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado após a coloração com azul de tripano para distinguir células vivas de células mortas. Essa proporção ajuda a garantir a recuperação e a viabilidade celular ideais durante os procedimentos subsequentes.

2. Isolamento de células de tecido tumoral

NOTA: O método para o isolamento de células de tecido tumoral foi adaptado de Song et al.22.

  1. Após ressecar o CHC, guiado por um patologista, use um bisturi estéril para extirpar uma parte do tecido tumoral. O bloco de tecido deve ter aproximadamente 1 cm3 de tamanho. Enxágue todas as manchas superficiais com PBS 1x pré-resfriado. Mergulhe o tecido em um tubo de centrífuga de 15 mL contendo cerca de 5 mL de meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS. Coloque o tubo no gelo e transporte-o de volta ao laboratório para processamento posterior.
  2. Enxágue bem as manchas de sangue e remova manualmente o tecido conjuntivo gorduroso usando uma pinça para garantir a limpeza completa do tecido com FBS-PBS 2% pré-resfriado. Transfira o tecido para um prato tratado com cultura de tecidos contendo uma solução de digestão. Prenda o tecido tumoral com uma pinça e corte-o em pedaços menores que 1 mm3 com um bisturi. Transfira a solução de digestão tecidual para um tubo centrífugo de 50 mL, adicionando mais solução de digestão tecidual até que o volume total seja de aproximadamente 15 mL.
  3. Coloque o tubo de centrifugação contendo a mistura de digestão de tecidos em um agitador. Incline-o ou alise-o e fixe-o para digestão a 150 rpm e 37 °C por 1 h. Filtrar a solução de digestão através de um filtro de 70 μm.
    1. Durante este procedimento, use um êmbolo de seringa de 1 mL para triturar os fragmentos de tecido. Enxágue o filtro com uma solução FBS-1640 a 2%. Pegue o filtrado e transfira-o para um tubo de centrífuga de 15 mL.
  4. Centrifugar o filtrado a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente o pellet em aproximadamente 10 mL de solução de Percoll a 36%. Em seguida, centrifugue-o novamente a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
  5. Aspire suavemente 1 mL de tampão de lise de hemácias com uma pipeta para ressuspender a suspensão celular. Transfira a suspensão para um novo tubo de centrífuga de 15 mL e adicione o tampão de lise de hemácias para atingir um volume total de 10 mL. Deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 10 min.
    NOTA: Um novo tubo de centrífuga é usado para evitar que quaisquer impurezas na parede do tubo entrem novamente na suspensão celular, reduzindo assim o risco de diminuição do rendimento celular.
  6. Centrifugue a suspensão celular a 500 x g por 5 min a 4 ° C e, em seguida, ressuspenda as células em um volume apropriado de 2% de FBS-PBS. Como diretriz geral, use 0,5 mL de FBS-PBS a 2% por 1 x 106 células para ressuspensão.
    NOTA: A contagem de células é determinada usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado após a coloração com azul de tripano para distinguir células vivas de células mortas. O volume de ressuspensão depende da quantidade de células necessária para experimentos subsequentes. Essa proporção ajuda a garantir a recuperação e a viabilidade celular ideais durante os procedimentos subsequentes.

3. Coloração de cisplatina

  1. Pegue 3 x 106 células das PBMCs obtidas na etapa 1.7 e das células tumorais isoladas na etapa 2.6, respectivamente. Após a recuperação celular, ressuspendê-los em 1 mL de PBS sem Ca2+ e Mg2+. Adicione cisplatina a uma concentração final de 0,5 μM, misture bem e incube em temperatura ambiente por 2 min.
    NOTA: A coloração com cisplatina é realizada para distinguir células mortas de células vivas com base na integridade da membrana. As células mortas com membranas comprometidas captarão cisplatina e mostrarão um sinal positivo, enquanto as células vivas permanecerão sem coloração23. O número de células deve ser de pelo menos 1 x 106.
  2. Centrifugue os tubos a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente, descarte o sobrenadante e, em seguida, adicione 1 mL de tampão de coloração celular a cada tubo contendo as suspensões celulares preparadas na etapa 3.1 para interromper a reação. Centrifugue a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente, descarte o sobrenadante e certifique-se de que o pellet celular não seja distribuído linearmente ao longo da parede do tubo após a centrifugação.

4. Bloqueio do receptor Fc

  1. Prepare uma mistura de blocos de 50 μL com antecedência para cada amostra: Combine 48 μL de tampão de coloração celular e, em seguida, adicione 2 μL de solução de bloqueio Fc (tampão de coloração celular: solução de bloqueio Fc = 9: 1).
  2. Suspenda as células da etapa 3.2 na mistura acima e deixe-as descansar em temperatura ambiente por 10 min.

5. Incubação de anticorpos proteicos de membrana

  1. Para cada amostra de célula obtida na etapa 4.2, prepare a mistura de anticorpos de proteína de membrana adicionando unidades de 1,1 μL de cada anticorpo. Em seguida, adicione tampão de coloração celular para atingir um volume final de 55 μL. Neste ponto, o volume total é de aproximadamente 100 μL.
    NOTA: A mistura inclui anticorpos direcionados às principais proteínas de membrana, como CD163, CCR3, CD141, CD117 e CD4524,25. Esses anticorpos foram selecionados por sua especificidade na identificação de marcadores de proteínas de membrana e foram obtidos de fontes comercialmente disponíveis (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes, incluindo números de clones, fabricantes e números de catálogo).
  2. Adicione 50 μL de mistura de anticorpos preparada a cada amostra de tubo, traga o volume total para 100 μL. Agite suavemente as amostras e incube-as em temperatura ambiente por 15 min.
  3. Adicione 2 mL de tampão de coloração celular a cada amostra, centrifugue a 500 x g por 5 min em temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Repita esta etapa 2x.
  4. Descarte o sobrenadante e subtraia brevemente o líquido restante com o pellet celular para ressuspender e dispersar completamente a célula.

6. Coloração de proteínas do núcleo

  1. Uma vez que as células tenham sido totalmente ressuspensas, adicione 500 μL da solução misturada (fixação: fixação/permeabilização = 3:1) a cada amostra da etapa 5.4. Misture delicadamente as amostras e incube em temperatura ambiente por 30 min.
  2. Diluir o tampão de permeabilização (10x) com água desionizada. Após a incubação, centrifugue a 500 g durante 5 min à temperatura ambiente e elimine o sobrenadante. Adicione 1000 μL de tampão de permeabilização 1x a cada tubo para lavar as células. Centrifugue à temperatura ambiente a 1.000 x g por 5 min e, em seguida, descarte o sobrenadante.
  3. Ressuspenda os anticorpos em tampão de permeabilização 1x. Rejeitar o sobrenadante e adicionar 50 μL da mistura de anticorpos a cada tubo de células. Pipete suavemente as células para misturar e incube em temperatura ambiente por 30-45 min.
  4. Adicione 1000 μL de tampão de permeabilização 1x a cada tubo, centrifugue à temperatura ambiente a 1.000 x g por 5 min e descarte o sobrenadante.
  5. Adicione 1000 μL de tampão de coloração celular a cada tubo para ressuspender as células novamente, centrifugue em temperatura ambiente a 1.000 x g por 5 min e descarte o sobrenadante.

7. Fixação celular

  1. Prepare uma solução de formaldeído a 1,6% em PBS, com 1 mL necessário por amostra.
  2. Adicione 1 mL de solução de formaldeído a 1,6% a cada amostra da etapa 6.5, vortex para misturar bem e incube em temperatura ambiente por 10 min.
    NOTA: Embora o formaldeído seja comumente usado para fixação celular, reagentes alternativos, como paraformaldeído a 4% (PFA) ou metanol, também podem ser usados. A escolha do fixador deve basear-se nas necessidades específicas da experiência e nas características celulares a observar.
  3. Centrifugue à temperatura ambiente a 800 x g durante 5 min e elimine o sobrenadante.

8. Coloração de intercalação nuclear

  1. Preparar a solução de intercalação celular: Diluir o Cell-ID Intercalator-Iridium (Ir) com Fix e tampão de permeabilização até uma concentração final de 125 nM. Prepare 1 ml da solução por amostra.
  2. Adicionar 1 ml da solução de intercalação celular preparada a cada amostra fixa do passo 7.3. Misture delicadamente e vortex imediatamente. Isso ajuda a minimizar a formação de agregados celulares.
  3. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h ou a 4°C durante a noite. Centrifugue a 500 g por 5 min à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.

9. Preparação da suspensão celular

  1. Adicione 1000 μL de tampão de coloração celular ao tubo da etapa 8.3 e centrifugue a 800 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante. Repita esta etapa 2x.
  2. Adicione 450 μL a 900 μL de água deionizada para ressuspender as células. Conte as células usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado após a coloração com azul de tripano. Após a contagem, prossiga com a coleta e análise de dados usando citometria de massa.

10. Citometria de massa e análise de dados

  1. Adquira dados de citometria de massa usando um sistema CyTOF e salve-os como arquivos Flow Cytometry Standard (FCS). Garanta a calibração adequada do instrumento e o controle de qualidade para reduzir o ruído de fundo e os efeitos do lote de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Pré-processe a população de células CD45+ no arquivo FCS usando o software associado. Remova os detritos com base no tamanho da célula (dispersão direta, FSC) e granularidade (dispersão lateral, SSC). Exclua duplicatas por gating sequencial de gráficos FSC-A/FSC-H ou SSC-A/SSC-H. Elimine as células mortas usando coloração de viabilidade, como a exclusão da cisplatina. Gate a população CD45 + para se concentrar em células imunológicas e exportar a população fechada para análise posterior.
  3. Transforme os dados com um cofator de 5 e identifique os principais clusters usando o software de clustering. Execute o agrupamento com base no algoritmo Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events (SPADE), que agrupa células com perfis de expressão de marcadores semelhantes em clusters26. Use a incorporação hierárquica de vizinhos estocásticos (HSNE) para redução de dimensionalidade e identificação de clusters distintos26.
  4. Execute o reagrupamento dos principais clusters usando o pacote cytofkit no software R para clustering não supervisionado. Identifique subclusters com o PhenoGraph usando parâmetros padrão.
  5. Aplique Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) para redução da dimensionalidade. Realizar análise estatística por meio do teste de Wilcoxon, considerando um valor de P < 0,05 como estatisticamente significativo. Visualize os resultados usando ggplot2.

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Resultados

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Para elucidar as características imunológicas associadas ao CHC, foi realizada uma análise abrangente das populações de células imunes. PBMCs pareados e amostras de tecido de CHC foram coletadas de 4 pacientes com CHC. O perfil de citometria de massa foi realizado para examinar as populações de células imunes no nível proteômico de célula única, usando dois painéis de anticorpos para amostras de tecido PBMCs e HCC.

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo aproveita a tecnologia de citometria de massa para fornecer uma análise aprofundada das respostas imunes sistêmicas e locais no CHC. A aplicação da citometria de massa neste contexto permite a detecção simultânea de múltiplos marcadores em nível de célula única, oferecendo uma caracterização imunofenotípica detalhada que é crucial para a compreensão do complexo cenário imunológico do CHC. A citometria de massa revolucionou os estudos imunológicos, facilitando a análise de cél...

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Divulgações

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Os autores declaram não ter conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (concessão 2019YFA0803000 para JS), a Excellent Youth Foundation da Zhejiang Scientific (concessão R22H1610037 para JS), a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (concessão 82173078 para JS), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang (concessão 2022C03037 para JS).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1×PBSHyCloneSH30256.01
10×PBSHyCloneSH30256.01
100 mm×20 mm tissue-culture-treated culture dishCorning430167
1000 mL pipette tipsRainin30389218
15 mL centrifuge tubeNEST601052
200 mL pipette tipsRainin30389241
40 mm nylon cell strainer/70-mm nylon cell strainerFalcon352340
50 mL centrifuge tubeNEST602052
70 μm syringe fifilterSangon BiotechF613462-9001
Anti-Human CCR2 Antibody (clone: K036C2)BioLegend357224
Anti-Human CCR3 Antibody (clone: 5E8)BioLegend310724
Anti-Human CCR7 Antibody (clone: G043H7)BioLegend353240
Anti-Human CD103 Antibody (clone: Ber-ACT8)BioLegend350202
Anti-Human CD115 Antibody (clone: 9-4D2-1E4)BioLegend347314
Anti-Human CD117 Antibody (clone: 104D2)BioLegend313201
Anti-human CD11b Antibody (clone: 1CRF44) BD562721
Anti-human CD11c Antibody (clone: B-ly6) BD563026
Anti-Human CD123 Antibody (clone: 6H6)BioLegend306002
Anti-Human CD127 Antibody (clone: A019D5)BioLegend351337
Anti-Human CD13 Antibody (clone: WM19)BioLegend301701
Anti-Human CD138 Antibody (clone: MI15)BioLegend356535
Anti-human CD14 Antibody (clone: HCD14)BioLegend325604
Anti-Human CD141 Antibody (clone: M80)BioLegend344102
Anti-Human CD15 Antibody (clone: QA19A61)BioLegend376302
Anti-human CD16 Antibody (clone: B7311) BD561313
Anti-Human CD161 Antibody (clone: HP-3G10)BioLegend339902
Anti-Human CD163 Antibody (clone: GHI/61)BioLegend333603
Anti-Human CD169 Antibody (clone: 7-239)BioLegend346002
Anti-human CD19 Antibody (clone: HIB19)BioLegend302226
Anti-Human CD1c Antibody (clone: L161)BioLegend331501
Anti-Human CD20 Antibody (clone: 2H7)BioLegend302301
Anti-Human CD206 Antibody (clone: 15-2)BioLegend321151
Anti-Human CD24 Antibody (clone: ML5)BioLegend311129
Anti-Human CD25 Antibody (clone: BC96)BioLegend302624
Anti-human CD3 Antibody (clone: UCHT1) BD555916
Anti-Human CD31 Antibody (clone: W18200D)BioLegend375902
Anti-Human CD32 Antibody (clone: FUN-2)BioLegend303232
Anti-Human CD326 Antibody (clone: CO17-1A)BioLegend369812
Anti-Human CD33 Antibody (clone: WM53)BioLegend303402
Anti-human CD4 Antibody (clone: L200) BD563094
Anti-Human CD45 Antibody (clone: HI30) BD563716
Anti-Human CD45RO Antibody (clone: UCHL1)BioLegend304220
Anti-human CD56 Antibody (clone: 5.1H11)BioLegend362510
Anti-Human CD64 Antibody (clone: S18012C)BioLegend399502
Anti-Human CD66b Antibody (clone: 6/40c)BioLegend392917
Anti-human CD68 Antibody (clone: Y1/82A)BioLegend333808
Anti-Human CD69 Antibody (clone: FN50)BioLegend310902
Anti-Human CD7 Antibody (clone: 4H9/CD7)BioLegend395602
Anti-human CD8 Antibody (clone: RPA-T8) BD557750
Anti-Human CD80 Antibody (clone: W17149D)BioLegend375402
Anti-Human CD86 Antibody (clone: BU63)BioLegend374202
Anti-Human FOXP3 Antibody (clone: 206D)BioLegend320101
Anti-Human HLA_ABC Antibody (clone: W6/32)BioLegend311426
Anti-human HLA-DR Antibody (clone: L243)BioLegend307650
Anti-Human IgD Antibody (clone: IA6-2)BioLegend348211
Anti-Human Ki67 Antibody (clone: Ki-67)BioLegend350501
Anti-Human PD_L2 Antibody (clone: MH22B2)BD567783
Anti-Human PD1 Antibody (clone: EH12.2H7)BioLegend329951
Anti-Human PDL1 Antibody (clone: MIH2)BioLegend393602
Anti-human TCR-γδ Antibody (clone: B1) BD74

Referências

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