Artigo de método

Fabricação de dispositivo de fixação de eletroacupuntura de camundongo para pré-tratamento de eletroacupuntura em modelo de camundongo de cardiomiopatia diabética

DOI:

10.3791/67427

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18 de abril de 2025

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1College of Acupuncture and Orthopedics, Hubei University of Chinese Medicine, 2Department of Acupuncture, Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Acupuncture, Affiliated Hospital of Hubei University of Chinese Medicine, 4Hubei Province Academy of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo de camundongo de cardiomiopatia diabética e um dispositivo de fixação de eletroacupuntura de camundongo para o uso de eletroacupuntura em camundongos, que pode fixar os camundongos de forma mais suave durante o tratamento.

Resumo

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A cardiomiopatia diabética (CMD) é uma complicação do diabetes que pode progredir para insuficiência cardíaca e é limitada pelo uso de medicamentos. A eletroacupuntura é uma forma eficaz como método de tratamento externo da medicina tradicional chinesa para tratar a cardiomiopatia diabética. Um dispositivo de fixação por eletroacupuntura de camundongo pode fixar camundongos de maneira fácil e suave durante o tratamento de eletroacupuntura e expor pontos de acupuntura no abdômen e nos membros de camundongos. Este artigo descreve os métodos usados para fabricar o dispositivo de fixação de eletroacupuntura em camundongo com todas as etapas e precauções, estabelecendo um modelo de camundongo de cardiomiopatia diabética com medidas abrangentes para registrar de forma abrangente as alterações nos índices bioquímicos do sangue, como a glicose no sangue. O experimento foi feito com 3 grupos: um grupo controle, um grupo modelo e um grupo pré-tratamento, com 10 camundongos em cada grupo. O grupo de pré-tratamento foi tratado com pré-tratamento com eletroacupuntura de pontos de acupuntura Biaoben uma vez a cada dia alternado para um total de 7 sessões. Após a eletroacupuntura, os camundongos do grupo pré-tratamento apresentaram diminuição da glicose no sangue acompanhada de redução dos sintomas de diabetes.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A cardiomiopatia diabética (CMD) é uma complicação comum do diabetes mellitus caracterizada por alterações na estrutura cardíaca e na função diastólica e contrátil ventricular de uma lesão específica, evoluindo ainda para insuficiência cardíaca. É uma das principais causas de morte em pacientes com diabetes mellitus 1,2, e sua prevalência crescente tem atraído ampla atenção nos últimos anos3. Verificou-se que a patogênese dessa doença inclui principalmente resistência à insulina, resposta inflamatória, metabolismo lipídico anormal, estresse oxidativo, dano mitocondrial 4,5.

Atualmente, o tratamento clínico da cardiomiopatia diabética baseia-se principalmente em medicamentos orais para controlar a glicemia e aliviar os sintomas da doença cardíaca, mas apresenta certas limitações, como reações medicamentosas, efeitos na função renal e dependência de medicamentos de longo prazo6. A acupuntura, como método de tratamento externo da medicina tradicional chinesa, tem um efeito regulador melhor da glicose sanguínea, lipídios sanguíneos e resposta inflamatória em pacientes com cardiomiopatia diabética, e a eficácia clínica é notável7. A acupuntura não tem efeitos negativos nas funções gastrointestinais e renais, e o tratamento a longo prazo não produz dependência. A teoria dos pontos de acupuntura de Biaoben é um método importante de seleção e uso de pontos de acupuntura na teoria tradicional da acupuntura8. Ele define os pontos de acupuntura que podem melhorar os sintomas das doenças como pontos de acupuntura Biao, e os pontos de acupuntura que podem regular as funções básicas do corpo relacionadas às doenças e tratar as causas das doenças são chamados de pontos de acupuntura Ben. A estimulação dos pontos de acupuntura Biao e Ben ao mesmo tempo com a acupuntura pode atingir o objetivo de tratar as doenças, bem como aumentar a resistência do corpo às doenças e prevenir a exacerbação e recorrência das doenças9. Pode prevenir o agravamento e a recorrência da doença. Pesquisas modernas provaram que a acupuntura com pontos de acupuntura de Biaoben é eficaz para diabetes e suas muitas complicações, incluindo doença cardíaca diabética, nefropatia diabética, retinopatia diabética, pé diabético e assim por diante10,11. Um esquema de seleção de pontos de acupuntura de acordo com a teoria dos pontos de acupuntura de Biaoben é selecionar PC6 (Neiguan), que pode regular as funções do coração e melhorar a resposta inflamatória como o ponto de acupuntura Biao12, e ST36 (Zusanli), que pode melhorar a glicose no sangue e a situação de açúcar no sangue, melhorar a resistência à insulina e reduzir o estresse oxidativo, como o ponto de acupuntura Ben13.

Os modelos animais são uma ferramenta importante no estudo da cardiomiopatia diabética, pois foi demonstrado experimentalmente que os modelos de ratos ou camundongos mimetizam bem as anormalidades estruturais e as alterações funcionais do coração causadas pela cardiomiopatia diabética e fornecem as amostras necessárias para os índices de detecção bioquímica da cardiomiopatia diabética14,15. O uso de ração com alto teor de açúcar e gordura combinada com solução de estreptozotocina para induzir camundongos pode levar à formação de modelos diabéticos em 4-5 semanas, reduzindo efetivamente o tempo de modelagem e melhorando a taxa de sucesso, e não há requisitos especiais para o ambiente de criação16,17. A cardiomiopatia diabética é um tipo de cardiomiopatia causada pelo dano à estrutura e função cardíaca causado pela hiperglicemia contínua. Com o prolongamento do curso da doença, o modelo de cardiopatia diabética pode ser desenvolvido naturalmente pelo modelo diabético sob hiperglicemia de longa duração 18,19,20. O pré-tratamento com acupuntura refere-se ao pré-tratamento de camundongos após a formação de diabetes e antes da formação de lesão miocárdica óbvia. No entanto, após repetidas estimulações experimentais, os camundongos geralmente se tornam móveis e difíceis de imobilizar, e técnicas violentas de manipulação experimental podem causar lesões nos camundongos ou torná-los maníacos ou deprimidos21. Portanto, é necessário um método adequado para imobilizar camundongos. Os métodos comumente usados de imobilização de camundongos incluem anestesia e cintagem22. Embora o método de anestesia possa expor melhor os pontos de acupuntura, ele pode afetar a condução nervosa e, em última análise, afetar os resultados experimentais. O método de cintagem é um método de imobilização física e não produz os mesmos efeitos fisiológicos da anestesia, mas os camundongos amarrados experimentarão tensão significativa, aumento do tônus muscular e aumento da defecação22,23. Além disso, a agulha não pode alcançar facilmente a posição desejada. Aqui, apresentamos um dispositivo de fixação por eletroacupuntura em camundongos que pode ser usado para garantir que os camundongos não se movam e também expõem pontos de acupuntura durante o tratamento com eletroacupuntura para que o tratamento com eletroacupuntura possa ser realizado de forma conveniente, segura, não violenta e sem sequelas.

Este artigo descreve em detalhes a fabricação do dispositivo de fixação por eletroacupuntura em camundongo e o estabelecimento de um modelo de cardiomiopatia diabética em camundongos. Tratamos a cardiomiopatia diabética pelo pré-tratamento com eletroacupuntura de Biaoben, demonstramos como sua operação foi realizada no dispositivo de fixação de camundongos e avaliamos o efeito terapêutico do pré-tratamento com eletroacupuntura de acupontos de Biaoben na cardiomiopatia diabética medindo índices relacionados ao metabolismo de glicolipídios.

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Protocolo

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Todos os experimentos com animais estão em conformidade com o princípio 3Rs da ética animal e foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentos com Animais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Hubei (número de autorização ética HUCMS00309300). Aqui, 30 camundongos de grau SPF foram obtidos do Centro Provincial de Controle e Prevenção de Doenças de Hubei (certificado de qualidade NO.42010200009690).

1. Fabricação do dispositivo de fixação por eletroacupuntura

  1. Para a montagem de um dispositivo de fixação por eletroacupuntura, obtenha um tubo plástico oco de acrílico transparente e um instrumento de terapia de eletroacupuntura como corpo principal (Figura 1A). No tubo, mantenha um corpo de tubo e prepare as abas de fechamento localizadas nas aberturas em cada extremidade. Faça ranhuras no tubo oco no centro de cada extremidade e prenda as abas de fechamento nas ranhuras em cada extremidade usando parafusos giratórios manualmente.
  2. No meio do tubo oco, faça três orifícios ovais com cerca de 2 cm de comprimento e 1 cm de largura distribuídos adjacentes um ao outro. Os orifícios em ambos os lados são usados para retirar os membros anteriores do camundongo para fixação para tratamento de eletroacupuntura dos membros anteriores, e o orifício no meio pode ser usado para expor os pontos de acupuntura das regiões torácica e abdominal do camundongo para tratamento de eletroacupuntura das regiões torácica e abdominal.
  3. No final do tubo oco, faça um orifício oval simetricamente distribuído em ambos os lados da ranhura central, que pode ser usado para puxar os membros posteriores do camundongo para tratamento de eletroacupuntura dos membros posteriores (Figura 1B).
  4. Verifique a integridade do tubo de plástico oco e instale as abas de fechamento. Mova as abas de fechamento no corpo do tubo à medida que os parafusos deslizam nas ranhuras, garantindo que ele possa ajustar o comprimento de fixação para se adequar ao comprimento do mouse.
  5. Ligue o instrumento de terapia de eletroacupuntura e certifique-se de que esteja operacional. Cada botão pode ser ajustado pressionando-o uma vez (Figura 1C).
  6. Prepare o instrumento de terapia de eletroacupuntura para ser colocado próximo aos tubos de plástico ocos para a realização de tratamentos de eletroacupuntura em camundongos. O instrumento de terapia de eletroacupuntura consiste em uma máquina de terapia de eletroacupuntura e vários pares de clipes energizantes; Cada par de clipes energizantes pode fornecer dois pólos de energização.
  7. Ao usar os clipes para prender o cabo da agulha para energizar a agulha, use um clipe para fixar a agulha.
  8. A máquina de terapia de eletroacupuntura possui 11 botões. Use os 5 superiores para definir a frequência, o tempo e a forma de onda da eletroacupuntura e são usados da esquerda para a direita para frequência, tempo, onda contínua, onda esparsa e densa e onda intermitente. Use o 6 inferior para definir a força atual da eletroacupuntura. Cada um desses botões tem um entalhe embaixo dele para prender clipes energizantes; O número de clipes energizantes pode aumentar ou diminuir com o número de mouses, até um máximo de 6.

2. Estabelecendo um modelo de camundongo de cardiomiopatia diabética

  1. Divida os 30 camundongos em 3 grupos pelo método da tabela de números aleatórios: um grupo de controle, um grupo modelo e um grupo de pré-tratamento, com 10 camundongos em cada grupo. Submeta um total de 20 camundongos no grupo modelo e no grupo pré-tratamento para estabelecer o modelo de cardiomiopatia diabética. Trate o grupo de pré-tratamento com eletroacupuntura de acupuntura Biaoben.
    NOTA: O modelo foi construído durante um longo período de tempo e a cardiomiopatia significativa se desenvolve após 16 semanas. Nosso tempo de tratamento é do dia 36 ao dia 70 (semana 6 à semana 10). Este tratamento foi selecionado após o estabelecimento do diabetes, mas antes de danos miocárdicos significativos. Ao final de 6 semanas, o coração do camundongo foi removido e descobriu-se que tinha cardiomiopatia diabética significativa. Portanto, a seleção do tratamento neste momento pertence à categoria de pré-tratamento.
  2. Alimente os camundongos do grupo controle com ração normal por 16 semanas. Alimente os camundongos do grupo modelo e do grupo de pré-tratamento com uma dieta rica em gordura e açúcar por 16 semanas para induzir um estado metabólico muito semelhante à condição diabética. A composição da ração com alto teor de gordura e açúcar é 67,0% de ração padrão, 10,0% de banha, 2,5% de colesterol, 20,0% de sacarose e 0,5% de sais biliares.
  3. Injete solução intraperitoneal de estreptozotocina para estabelecer um modelo de cardiomiopatia diabética em camundongos.
    1. Prepare a solução a 1% de estreptozotocina no dia 29. Dissolva a estreptozotocina em um tampão preparado misturando ácido cítrico com citrato trissódico (pH = 4,4).
    2. Forneça apenas água e sem comida por 12 h no dia 29. Em seguida, dê a cada camundongo uma única injeção intraperitoneal de 150 mg / kg de solução de estreptozotocina, conforme descrito abaixo.
    3. Pegue o mouse pela cauda com a mão direita e mova-o para fora da gaiola. Coloque o mouse na superfície da gaiola e puxe suavemente sua cauda para fora. Imobilize o mouse com a mão esquerda e vire-o para expor o abdômen.
    4. Injete o camundongo por via intraperitoneal usando a mão direita com uma seringa de 1 mL preparada com a quantidade apropriada da solução de estreptozotocina já retirada.
  4. Realize o tratamento de acupuntura por pontos de acupuntura Biaoben.
    1. Selecione os pontos de acupuntura de acordo com a teoria dos pontos de acupuntura de Biaoben13 , incluindo PC6 e ST36 bilaterais. Para o grupo de pré-tratamento, realize acupuntura no dia 36, uma vez a cada dois dias, para um total de 18 tratamentos, com duração total de 5 semanas (do dia 36 ao dia 70; Figura 2).
      1. Ponto de acupuntura Biao: Selecione PC6 bilateral como o ponto de acupuntura Biao; o PC6 está localizado no lado medial do membro anterior, entre as suturas ulnar-radiais a cerca de 3 mm das articulações do punho. Ponto de acupuntura Ben: Selecione ST36 bilateral como pontos de acupuntura Ben; o ST36 está localizado na face póstero-lateral da articulação do joelho, aproximadamente 2 mm abaixo da tuberosidade da fíbula.
    2. Segure o mouse, aperte sua cauda e coloque-o na superfície da gaiola. Mantenha a boca do tubo de plástico oco de acrílico em um ângulo de 30° em relação ao plano horizontal, com o pequeno orifício no centro voltado para o chão e a boca do tubo alinhada com a cabeça do mouse.
    3. Acomode a cabeça do mouse na boca do tubo. Gire lentamente a cabeça do mouse no tubo usando movimento voluntário e um leve empurrão. Bata suavemente nas nádegas do mouse para que ele seja empurrado de forma autônoma e completa para dentro do tubo.
    4. Ajuste as abas de fechamento, levante a cauda do mouse para fora da ranhura, aperte a porca e use as abas de fechamento nas extremidades superior e inferior para restringir o movimento do mouse. Neste ponto, o mouse não pode mais se mover livremente no corpo do tubo.
    5. Use uma pinça para puxar suavemente os quatro membros do mouse de cada um dos quatro pequenos orifícios em ambos os lados. Depois que os quatro membros forem puxados para fora dos pequenos orifícios, prenda-os suavemente na parte externa do corpo do tubo. Nesse ponto, os quatro membros do rato não podiam mais ser deslocados.
    6. Segure o cabo da agulha descartável de aço inoxidável (0.3 mm x 13 mm) com o polegar e o indicador da mão direita e segure o tubo de acrílico e os ratos imóveis nele com a mão esquerda.
    7. Toque e localize onde o PC6 e o ST36 estão situados com o dedo médio da mão direita e, em seguida, pique suavemente a pele do mouse com a ponta da agulha. Insira rapidamente a agulha injetada obliquamente em torno de 3 mm e remova rapidamente a mão direita.
  5. Realize o pré-tratamento com eletroacupuntura
    1. Ligue a máquina de terapia de eletroacupuntura e ajuste para onda intermitente, 1 Hz. Para cada camundongo, realize o tratamento de eletroacupuntura por 15 min.
    2. Use o clipe energizado correspondente da máquina de terapia de eletroacupuntura para segurar a alça da agulha, um clipe para uma alça de agulha.
    3. Ajuste a corrente do botão com o clipe conectado a 1 mA (Figura 3).
    4. Aguarde 15 minutos e observe o estado dos camundongos durante o pré-tratamento com eletroacupuntura.
    5. No final do tratamento, solte o clipe e remova a agulha de acupuntura. Ajuste as abas de fechamento e solte os mouses do dispositivo de fixação por eletroacupuntura.
    6. Examine todo o corpo dos camundongos e observe se os camundongos estão feridos ou apresentam alguma anormalidade.
  6. Realize tratamentos de acupuntura em dias alternados após 7 dias de injeção de solução de estreptozotocina para um total de 18 tratamentos em um acessório de eletroacupuntura de camundongo do dia 36 ao dia 70.
  7. Finalize o experimento no dia 112 (final da semana 16).
    1. Anestesiar por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 2% e confirmar a anestesia por resposta de pinça do dedo do pé. Meça a função cardíaca dos camundongos usando um ecocardiograma.
      1. Registre o diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo (DDVE), o diâmetro sistólico final do ventrículo esquerdo (DSVE), a fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) e o encurtamento fracionário do ventrículo esquerdo (SFVE).
    2. Eutanásia dos camundongos por luxação cervical. Remova o coração, lave em solução salina fisiológica e mergulhe em paraformaldeído a 4%.

3. Coloração de hematoxilina-eosina (HE)

  1. Desidrate, incorpore, fatie, desparafine o coração e realize a coloração HE de acordo com o procedimento padrão.
  2. Observe as alterações patológicas do tecido cardíaco do camundongo sob um microscópio óptico.

4. Observações em camundongos

  1. Meça o açúcar no sangue usando um medidor de glicose no sangue nos dias 27, 36 e 49.
  2. Observe o quanto os ratos comem, quantifique a ingestão de água e o volume de micção todos os dias e registre suas mudanças de peso.

5. Análise estatística

  1. Colete dados de glicose no sangue e use ANOVA unidirecional para identificar significância estatística. Estabelecer significância estatística como p < 0,05.
  2. Quantifique os dados por assistentes que são cegos para as condições experimentais. Expresse os dados como média ± desvio padrão.

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Resultados

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Seguimos o procedimento descrito acima e estabelecemos um modelo de camundongo de cardiomiopatia diabética. Como pode ser observado nas figuras coradas com HE (Figura 4), os camundongos do grupo controle tinham estrutura de tecido miocárdico intacta, arranjo regular de cardiomiócitos e sem lesões óbvias. No grupo modelo, as células miocárdicas estavam dispostas irregularmente, algumas células miocárdicas estavam danificadas e desintegradas (seta preta) e foi observada evidente infiltração de...

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Discussão

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Neste estudo, camundongos que apresentavam glicemia elevada e apresentavam sinais de diabetes foram obtidos por injeção intraperitoneal da solução de estreptozotocina, que é um método eficaz e reconhecido de modelagem27. O PC6 foi selecionado como o ponto de Biao e o ST36 foi selecionado como o ponto de Ben de acordo com a teoria dos pontos de acupuntura de Biaoben28. Todos esses pontos estão nos membros do camundongo, portanto, os tubos de...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho é apoiado por uma bolsa do projeto conjunto 2022CFD024 da Hubei Natural Science Foundation; Fundação Nacional de Ciências Naturais da China, nº 81704142; Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Hubei 2023 projeto de pesquisa científica especial chave de construção de primeira classe dupla, 2023ZZXT005; Estudar o mecanismo de pré-condicionamento da eletroacupuntura de acupuntura Biaoben na regulação da ferroptose de células miocárdicas em ratos com lesão de isquemia-reperfusão miocárdica (MIRI) sob o projeto-chave da Administração Provincial de Medicina Tradicional Chinesa de Hubei, ZY2025D001; Projeto de Inovação do Conhecimento do Departamento de Ciência e Tecnologia de Wuhan, nº 2023020201010172; Projeto de Engenharia de Talentos Hubei Shi Zhen, E Wei Han [2024]256.

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Materiais

agulha de acupuntura

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Henan ZhikeZK-GDQde plástico oco acrílico
Hwato0,3 mm x 13 mm
C57BL/6  camundongosHubei Centro Provincial de Controle e Prevenção de Doenças
ácido cítrico monohidratadoSigmaC1909
instrumento de terapia de eletroacupunturaHwatoSDZ-V
balança eletrônicaHenan ZhikeZK-DST
medidores de glicoseLifeScanOneTouch VerioVue
tira de teste de glicoseLifeScanOneTouch Verio
estreptozotocinaSigmaS0130
citrato trissódico di-hidratadoSigmaW302600
pinçasLabshark130302001

Referências

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Etiquetas

Mouse Fixation DeviceBlood GlucoseAcupoint StimulationStreptozotocin InjectionCardiac Function IndicesEchocardiography AnalysisMyocardial TissueBiaoben Acupoints

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