Artigo de método

Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração

DOI:

10.3791/67436

⸱

1 de novembro de 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Integration of Chinese and Western Medicine, School of Basic Medical Sciences, Peking University, 2Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os pericitos na vasculatura retiniana foram examinados por coloração imunofluorescente com receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas β após injeção retro-orbital de lectina fluorescente de tomate. A retina marcada foi posteriormente tratada com o método de limpeza de tecido e toda montada para visualizar as vistas tridimensionais dos pericitos ao redor da vasculatura retiniana sob um microscópio confocal.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os pericitos retinianos são essenciais para o desenvolvimento vascular e estabilidade da retina, desempenhando um papel fundamental na manutenção da integridade da vasculatura retiniana. Para fornecer uma visão detalhada das características morfológicas dos pericitos, este estudo descreveu uma nova abordagem que combina a injeção retro-orbital de um agente fluorescente, coloração imunofluorescente e tratamento de limpeza de tecidos. Em primeiro lugar, a lectina fluorescente do tomate foi injetada no seio retro-orbital do camundongo vivo para marcar a vasculatura da retina. Após 5 minutos, o camundongo foi sacrificado e sua retina intacta foi cuidadosamente removida do copo da retina e corada por imunofluorescência com β do receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas para revelar os pericitos. Além disso, a retina corada foi tratada com reagente de limpeza de tecido e toda montada na lâmina do microscópio. Por meio dessas abordagens, a vasculatura retiniana e os pericitos foram claramente observados na retina transparente. Sob um microscópio confocal, obtivemos mais oportunidades de obter imagens de alta resolução para posterior reconstrução e análise das características morfológicas dos pericitos ao longo da árvore vascular da retina em uma visão tridimensional. Metodologicamente, este protocolo oferece uma abordagem eficaz para visualizar pericitos dentro da vasculatura da retina, fornecendo informações valiosas sobre seu papel em condições fisiológicas e patológicas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os pericitos da retina estão embutidos na membrana basal ao longo do lado abluminal das células endoteliais vasculares, exibindo um padrão semelhante a uma malha de processos de curto alcance enrolados nos vasos sanguíneos da retina1. Esse contato íntimo entre os pericitos e a vasculatura retiniana contribui para a manutenção da homeostase ambiental da retina2. Embora numerosos estudos tenham fornecido evidências morfológicas de pericitos na vasculatura retiniana, a maior parte de nossa compreensão das características morfológicas dos pericitos retinianos vem de técnicas histológicas convencionais3.

De acordo com esses estudos, projetamos este estudo para mostrar efetivamente mais detalhes morfológicos de pericitos na microvasculatura da retina, combinando técnicas histológicas tradicionais com métodos científicos modernos de ponta. A abordagem aqui integra três técnicas principais: injeção retro-orbital de lectina fluorescente de tomate em camundongos vivos, coloração imunofluorescente com receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas β (PDGFR-β) e a estratégia de limpeza de tecido à base de solvente. A injeção retro-orbital de lectina fluorescente de tomate tem se mostrado eficaz e confiável para observar a vasculatura da retina de camundongos em ambientes in vivo e in vitro 4,5. O PDGFR-β serve como um biomarcador comumente usado para a coloração imunofluorescente de pericitos6. Para capturar imagens de alta resolução de pericitos dentro das retinas mais espessas e de montagem total, a estratégia de limpeza do tecido aumenta a transparência histológica 2,7,8.

Embora cada uma dessas técnicas tenha sido aplicada individualmente em estudos de retina, sua compatibilidade combinada para investigar pericitos na vasculatura retiniana de camundongos permanece incerta. Como a espessura média da retina do camundongo é de aproximadamente 180-220 μm9, a marcação de anticorpos e a imagem confocal nesse tecido espesso sem tratamento de limpeza geralmente resultam em altos sinais de fundo, complicando a observação da relação espacial entre pericitos e vasos sanguíneos10. Por meio das abordagens descritas aqui, pretendemos fornecer um método direto para visualizar pericitos dentro da vasculatura retiniana em uma visão tridimensional (3D) sob um microscópio confocal. Essa informação celular aprimorada dos pericitos na vasculatura retiniana pode melhorar nossa compreensão da homeostase ambiental da retina e ressaltar estratégias potenciais para proteção vascular, melhorando assim os resultados funcionais em distúrbios vasculares da retina.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para este estudo, foram utilizados três camundongos C57BL/6 machos adultos jovens (8-10 semanas de idade, pesando 20-25 g). Eles foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12 h com temperatura e umidade controladas e permitiram livre acesso a alimentos e água. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Acupuntura e Moxabustão, Academia Chinesa de Ciências Médicas Chinesas (aprovação nº 2023-03-14-04) e conduzido de acordo com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Academy Press, Washington, DC, 1996).

1. Injeção retro-orbital in vivo de lectina fluorescente de tomate

  1. Injete 50 mg / kg de pentobarbital por via intraperitoneal para anestesiar o camundongo. Avalie a profundidade da anestesia avaliando a ausência de resposta a um estímulo de pinça do dedo do pé.
  2. Coloque o mouse em decúbito lateral direito com a cabeça voltada para a esquerda.
  3. Pressione dois dedos suavemente na área periorbital para expor o olho esquerdo do camundongo para permitir a administração mais fácil da injeção no seio retroorbital esquerdo do animal11.
  4. Use uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha 27G para perfurar suavemente cerca de 2-3 mm no seio venoso orbital do camundongo com o chanfro da agulha voltado para a frente em um ângulo de 45°.
  5. Injete 0,1 mL (1 mg / mL) de lectina fluorescente de tomate no seio venoso orbital do camundongo.

2. Perfusão e enucleação dos olhos

  1. Aos 5 minutos após a injeção retroorbital, injete solução de tribromoetanol (250 mg / kg) por via intraperitoneal para anestesiar profundamente o camundongo. Posteriormente, eutanasiar o animal por meio de exsanguinação e perfusão cardíaca. Quando a respiração parar, abra a cavidade torácica com uma tesoura cirúrgica12.
  2. Quando a respiração parar, abra a cavidade torácica com uma tesoura cirúrgica. Esterilize os instrumentos cirúrgicos com antecedência e opere em uma capela de exaustão. Use uma agulha 24G e insira-a 2 mm no ventrículo cardíaco esquerdo através do ápice do ventrículo esquerdo. Realize perfusão a uma taxa de 3 mL / min com 20 mL de solução salina fisiológica a 0,9% seguida de 20 mL de formaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1 M (PB, pH 7,4).
  3. Coloque o rato sacrificado de lado e remova a pele que cobre os olhos com uma tesoura. Enuclee os olhos com tesoura e fórceps.
  4. Corte o nervo óptico e os tecidos circundantes, retire o olho e transfira para uma placa de 12 poços para pós-fixação em formaldeído a 4% em 0,1 M PB por 2 h.
  5. Crioproteja o tecido em sacarose a 25% em 0,1 M PB (pH 7,4) a 4 ° C até que ele afunde no fundo da solução.
    NOTA: Como o tecido ocular desidrata bem em uma solução de sacarose, a retina pode ser mais fácil e completamente descolada, facilitando estudos abrangentes subsequentes.

3. Dissecção de retinas

  1. Transfira os olhos para uma placa de Petri contendo 0,1 M PB (pH 7,4) usando uma pipeta de plástico Pasteur.
  2. Fure a borda da córnea com uma tesoura afiada, corte ao redor da córnea e da íris e descarte.
  3. Use uma pinça para remover a lente e o humor vítreo. Em seguida, puxe a retina em forma de taça para longe do centro do olho com uma pinça fina. Enxágue a retina com 0,1 M PB (pH 7,4) em uma placa de Petri limpa.

4. Coloração imunofluorescente e limpeza de tecidos de retinas

  1. Remova cuidadosamente a retina em forma de copo e incube-a em uma solução Triton X-100 a 2% em 0,1 M PB (pH 7,4) durante a noite a 4 ° C.
  2. Transfira a retina para a solução de bloqueio (0,1 M PB + 1% Triton-X 100 + 0,2% de azida sódica + 10% de soro de burro normal) e gire a 72 rpm no agitador durante a noite a 4 ° C.
  3. Transferir a retina para a solução que contém os anticorpos primários de cabra anti-PDGFR-β (10 μg/ml) em tampão de diluição (0,1 M PB + 0,2% Triton-X 100 + 0,2% azida sódica + 1% de soro de burro normal) num tubo de microcentrífuga e rodar no agitador durante 2 dias a 4 °C.
  4. Lave a retina 2x com tampão de lavagem (0,1 M PB + 0,2% Triton-X 100) à temperatura ambiente e, em seguida, mantenha-os em tampão de lavagem durante a noite a 4 °C no shaker.
  5. No dia seguinte, transfira a retina para a solução mista contendo o anticorpo secundário 1 mg / mL de anticorpo anti-cabra 488 de burro e 0,2 ng / mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol nuclear (DAPI) em um tubo de microcentrífuga e gire a 72 rpm no agitador por 5 h a 4 ° C.
  6. Lave a retina em uma placa de 6 poços com tampão de lavagem por 1 h, 2x, em temperatura ambiente. Mantenha a retina em tampão de lavagem no agitador durante a noite a 4 °C. Realize imagens e análises de acordo com a etapa 5 para obter as visualizações antes da limpeza do tecido.
  7. Transferir a retina para o reagente de limpeza dos tecidos e rodá-la suavemente a 60 rpm no agitador durante 1 h a 37 °C.
  8. Após o tratamento de limpeza do tecido, enxágue a retina em forma de xícara com 0,1 M PB (pH 7,4) em uma placa de Petri limpa.
  9. Faça 4 incisões radiais atingindo aproximadamente 2/3 do raio da retina usando uma tesoura de mola para criar uma forma de pétala.
  10. Alise e monte a retina em uma lâmina de microscópio e, em seguida, remova qualquer excesso de PB com um pequeno pedaço de papel absorvente. Mantenha o interior da retina voltado para cima na lâmina.
  11. Circule a retina montada com um espaçador e preencha a lacuna com um reagente de limpeza de tecido fresco e uma lamínula.

5. Imagiologia e análises

  1. Obtenha as vistas externas da retina antes (após concluir a etapa 4.6) e após o tratamento de limpeza de tecidos.
  2. Digitalize as visualizações de montagem da retina marcada com o scanner panorâmico de fatias de tecido. Use uma lente objetiva 2x com NA de 0,08.
  3. Tire as imagens de maior ampliação pelo sistema de imagem confocal equipado com as seguintes lentes objetivas: lente 10x com NA de 0,40 e lente 40x com NA de 0,95. Defina o orifício confocal em 152 μm (lente objetiva de 10x) e 105 μm (lente objetiva de 40x). Defina a resolução espacial da captura de imagem em 1024 x 1024 pixels (lente objetiva de 10x) e 640 x 640 pixels (lente objetiva de 40x).
  4. Capture 50 imagens (pilha Z) em quadros de 2 μm da retina marcada. Integre todas as imagens em um único foco no modo de projeção/topografia. Para a configuração, clique em Definir plano focal inicial > Definir plano focal final > Definir tamanho do passo > Escolher padrão de profundidade > Captura de imagem > série Z.
  5. Capture imagens usando os seguintes comprimentos de onda de excitação e emissão para diferentes sinais de fluorescência: Sinais de fluorescência verde em 499 nm e 519 nm; sinais de fluorescência vermelha a 591 nm e 618 nm; e sinais de fluorescência azul em 401 nm e 421 nm.
  6. Reconstrua as imagens no padrão tridimensional importando imagens confocais de pilha Z para um software de análise selecionando Adicionar novas superfícies > Escolher configurações de volume > Escolher canal de origem > Ajustar exibição > Ajustar ângulo de superfície > Instantâneo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das vistas externas da retina de montagem total, a transparência do tecido da retina de montagem total foi aumentada usando o tratamento de limpeza de tecido em comparação com a da retina sem limpeza de tecido (Figura 1).

Para o exame histológico da retina de montagem total, a vasculatura retiniana foi marcada em vermelho com lectina fluorescente de tomate por meio da injeção retro-orbital, e os pericitos retinianos são mostrados em verde com PDGFR-β (Figura 2, Figura 3 e Figura 4). Embora essa marcação pudesse ser observada na amostra antes e depois da limpeza do tecido, como comparação, o ruído de fundo da amostra da retina foi reduzido pelo tratamento de limpeza do tecido (Figura 2). O tratamento também tornou os pericitos e a vasculatura da retina marcados mais claros sob o scanner panorâmico de corte de tecido (Figura 2) e o microscópio confocal de varredura a laser (Figura 3).

A distribuição gradativa dos pericitos retinianos também é demonstrada aqui ao longo da árvore vascular da retina (Figura 3). Da parte central da retina até sua região periférica, os pericitos estão localizados na membrana basal da vasculatura retiniana, incluindo o tronco e ramos vasculares e os capilares (Figura 3).

Com base na observação acima, a correlação espacial dos pericitos e da vasculatura retiniana foi avaliada com as imagens de pilha Z mais ampliadas da amostra retiniana limpa (Figura 4). Com o auxílio do sistema de processamento de imagem, fornecemos ainda as visualizações 3D para demonstrar que os pericitos estavam firmemente enrolados ao redor da vasculatura retiniana em diferentes diâmetros (Figura 4). A Figura 4A0-D0 representa a ramificação hierárquica dos vasos da retina do mais alto para o mais baixo. Como os pericitos são mais abundantemente distribuídos nos capilares, a coloração PDGFRβ na Figura 4D0 mostra intensidade e sinal mais fortes em comparação com a Figura 4A0-C0.

Em contraste com a retina de camundongos sem tratamento de limpeza de tecidos (Figura 1A, Figura 2A, Figura 3A0-D0), a presente abordagem reduziu efetivamente os sinais de fundo da retina para demonstrar a relação espacial entre pericitos e vasos sanguíneos da retina de montagem total (Figura 1B, Figura 2B, Figura 3A1-D1).

figure-results-1
Figura 1: Comparação da transparência óptica de toda a retina de montagem sem e com tratamento de limpeza de tecido. (A, B) As vistas externas de toda a retina de montagem antes (A) e depois (B) do tratamento de limpeza de tecido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Comparação das características de marcação dos pericitos e vasculaturas da retina de toda a retina de montagem sem e com tratamento de limpeza de tecido. (A, B) Visualizações de montagem representativas de toda a retina de montagem antes (A) e depois (B) do tratamento de limpeza de tecido foram tiradas sob o Virtual Slide System. A vasculatura está em vermelho (lectina fluorescente do tomate), os pericitos estão em verde (PDGFR-β) e o núcleo celular está em azul (DAPI). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Comparação da resolução de imagem dos pericitos retinianos gradativamente ao longo da árvore vascular retiniana antes e depois do tratamento de limpeza de tecidos. (A-D) As imagens representativas da retina marcada antes do tratamento de limpeza de tecidos (A0-D0) e após o tratamento de limpeza de tecidos (A1-D1) mostram a distribuição de pericitos ao redor da vasculatura retiniana em ordem de tronco vascular (A0, A1), os ramos de primeira ordem (B0, B1), os ramos de segunda ordem (C0, C1) e o capilar (D0, D1). A vasculatura está em vermelho (lectina fluorescente do tomate), os pericitos estão em verde (PDGFR-β) e o núcleo celular está em azul (DAPI). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Correlação espacial dos pericitos com a vasculatura retiniana em diferentes diâmetros. (A-D) Imagens representativas de alta resolução da retina marcada ao longo da árvore vascular da retina mostrando a distribuição de pericitos ao redor da vasculatura retiniana em diferentes diâmetros, incluindo tronco vascular (A0, A1), ramos de primeira ordem (B0, B1), ramos de segunda ordem (C0, C1) e capilar (D0, D1). A1-D1: As imagens correspondentes dos painéis A0-D0 foram reconstruídas para mostrar a correlação espacial dos pericitos com a vasculatura retiniana em diferentes diâmetros nas incidências tridimensionais e ainda demonstrar as incidências ampliadas das regiões locais nos painéis A1-D1 (setas) com inserções. A vasculatura está em vermelho (lectina fluorescente do tomate), os pericitos estão em verde (PDGFR-β) e o núcleo celular está em azul (DAPI). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste estudo, detalhamos o processo técnico para demonstrar a morfologia dos pericitos na vasculatura retiniana usando injeção retro-orbital de lectina fluorescente de tomate, exame de imunofluorescência com PDGFR-β e limpeza tecidual à base de solvente. Os resultados mostram que essas técnicas são altamente compatíveis para destacar pericitos na retina de montagem total. A combinação dessas metodologias oferece uma abordagem eficaz para visualizar as características morfológicas dos pericitos na vasculatura da retina a partir de uma perspectiva 3D detalhada.

Uma das principais técnicas, a injeção retro-orbital em camundongos, provou ser um método simples e ideal para fornecer agentes de marcação vascular, superando os métodos de injeção intraperitoneal e da veia da cauda para observar a vasculatura retiniana de camundongos13,14. Embora o princípio e o mecanismo por trás da marcação vascular por meio de injeção retroorbital não sejam totalmente compreendidos, é evidente que esse método marca de forma robusta a vasculatura retiniana com lectina fluorescente de tomate. A marcação fluorescente permanece estável por meio do processamento histoquímico e da limpeza do tecido. Portanto, além de seu uso em imagens in vivo, a injeção retroorbital com lectina fluorescente de tomate marca efetivamente o lúmen do vaso sanguíneo, oferecendo uma visão clara da vasculatura retiniana para exame histológico in vitro e ex vivo.

Para marcar os pericitos retinianos, utilizamos coloração imunofluorescente com PDGFR-β15. Considerando que a retina corada foi submetida a tratamento adicional com reagente de limpeza de tecido para reduzir o espalhamento de luz tecidual sob exame morfológico microscópico, a retina foi incubada na solução de coloração por mais tempo para aumentar a penetração do anticorpo16,17.

A retina de montagem total é relativamente transparente, permitindo uma visão geral da vasculatura da retina18. No entanto, devido ao espalhamento de luz com sua espessura, limita a penetração da luz e a imagem de alta resolução19. Com o auxílio de técnicas de limpeza de tecidos, tornou-se possível visualizar os pericitos na retina de montagem total de uma perspectiva de alta resolução19,20. No entanto, esses métodos ainda não foram amplamente aplicados à investigação de pericitos retinianos de camundongos. Neste estudo, a abordagem de limpeza de tecido à base de solvente aumentou significativamente nossa capacidade de visualizar pericitos na vasculatura da retina, permitindo-nos obter imagens de pilha Z de alta resolução usando um microscópio confocal de varredura a laser.

Os pericitos, distribuídos ao longo da árvore microvascular, desempenham papéis essenciais na complexa distribuição espacial e temporal do sangue dentro da rede capilar da retina22. Sua morfologia altamente plástica e capacidades contráteis adaptativas tornam os pericitos ideais para regular o fluxo sanguíneo capilar em resposta à atividade neuronal local em condições fisiológicas e patológicas23. Como peça-chave da barreira sangue-retina ou acoplamento neurovascular retiniano, os pericitos retinianos também chamam a atenção na manutenção da neovascularização, angiogênese e transmigração de leucócitos24.

Como limitação técnica, deve-se ter em mente que, além do PDGFR-β, outros marcadores como NG-2 e CD13 também têm sido utilizados para identificar pericitos 22,24,25. Portanto, selecionar um marcador específico de pericito adequado para demonstrar os pericitos de forma inequívoca ainda é um desafio. Este estudo fornece mais evidências de que o PDGFR-β é um candidato melhor para revelar as características morfológicas dos pericitos.

Em resumo, demonstramos que a combinação de injeção retro-orbital de lectina fluorescente de tomate, coloração imunofluorescente e limpeza tecidual permitiu a aquisição de imagens de alta resolução, revelando a morfologia detalhada dos pericitos na vasculatura retiniana de camundongos em condições fisiológicas. Esses achados sugerem que esse método pode ser valioso para futuras investigações sobre as alterações dos pericitos retinianos em condições patológicas.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sem conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais de Pequim (nº 7244480), pelo Fundo de Inovação CACMS (nº. CI2021A03407), a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 82004492) e os Fundos de Pesquisa Fundamental para os institutos centrais de pesquisa de bem-estar público (nºs ZZ-YQ2023008, ZZ14-YQ-032, ZZ-JQ2023008, ZZ-YC2023007).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD3571Proteger da luz
Alexa Fluor 488 burro anti-cabra IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-11055Proteger da luz
C57BL/6 ratoBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.SCXK (Jing) 2021-0006
Sistema de imagem confocalOlympusFV1200
Cabra anti-PDGFR-βPesquisa e DesenvolvimentoAF104225 µ g 
Imaris softwareOxford Instrumentsv.9.0.1
Lycopersicon esculentum(Tomato) lectina, DyLight594Thermo Fisher ScientificL324711 mg
Tubo de microcentrífugaAxygenMCT-150-C1,5 mL
Soro de burro normalJackson ImmunoResearch017-000-12110 mL
Scanner panorâmico de fatias de tecidoOlympusVS120-S6-W
Photoshop e  IlustraçãoAdobeCS6
RapiClear 1.52 SoluçãoSunJin LabRC15200110 mL
Placa de seis poçosTesoura de mola Costar3335
 Ferramentas de Fine Science15003-08
Superfrost Plus lâmina de microscópioThermo Fisher Scientific4951PLUS-00125 mm x 75 mm x 1 mm

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dreisig, K., Blixt, F. W., Warfvinge, K. Retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes. J Vis Exp. (140), e57733(2018).
  2. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. J Vis Exp. (77), e50546(2013).
  3. Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nat Commun. 8, 15296(2017).
  4. Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (8), 2795-2806 (2004).
  5. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights. Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).
  6. Hutter-Schmid, B., Humpel, C. Platelet-derived growth factor receptor-beta is differentially regulated in primary mouse pericytes and brain slices. Curr Neurovasc Res. 13 (2), 127-134 (2016).
  7. Wang, X., et al. Demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches. J Vis Exp. (183), e63807(2022).
  8. Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. J Vis Exp. (167), e61742(2021).
  9. Batista, A., et al. Normative mice retinal thickness: 16-month longitudinal characterization of wild-type mice and changes in a model of Alzheimer's disease. Front Aging Neurosci. 15, 1161847(2023).
  10. Huang, H. Pericyte-endothelial interactions in the retinal microvasculature. Int J Mol Sci. 21 (19), 7413(2020).
  11. Dong, X., et al. Exosome-mediated delivery of an anti-angiogenic peptide inhibits pathological retinal angiogenesis. Theranostics. 11 (11), 5107-5126 (2021).
  12. Li, S., et al. Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).
  13. Riew, T. R., Jin, X., Kim, S., Kim, H. L., Lee, M. Y. Temporal dynamics of cells expressing ng2 and platelet-derived growth factor receptor-β in the fibrotic scar formation after 3-nitropropionic acid-induced acute brain injury. Cell Tissue Res. 385 (3), 539-555 (2021).
  14. Susaki, E. A., et al. Advanced cubic protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  15. Liang, H., et al. Cubic protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. J Vis Exp. (114), e54401(2016).
  16. Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. Imaging the retinal vasculature. Annu Rev Vis Sci. 7, 129-153 (2021).
  17. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced clarity for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  18. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nat Neurosci. 22 (2), 317-327 (2019).
  19. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  20. Alarcon-Martinez, L., Yemisci, M., Dalkara, T. Pericyte morphology and function. Histol Histopathol. 36 (6), 633-643 (2021).
  21. Dessalles, C. A., Babataheri, A., Barakat, A. I. Pericyte mechanics and mechanobiology. J Cell Sci. 134 (6), jcs240226(2021).
  22. Alarcon-Martinez, L., et al. Neurovascular dysfunction in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 97, 101217(2023).
  23. Uemura, M. T., Maki, T., Ihara, M., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. Brain microvascular pericytes in vascular cognitive impairment and dementia. Front Aging Neurosci. 12, 80(2020).

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Pericitos RetinianosVasculatura RetinianaColora o ImunofluorescenteClareamento de TecidosMicroscopia ConfocalImagem TridimensionalMarca o com Lectina de TomateColora o PDGFR BetaRetina em Montagem IntegralAn lise Morfol gica

Artigos relacionados