Isolamento enzimático de vesículas extracelulares intersticiais do músculo esquelético

As vesículas extracelulares (EVs) são partículas de tamanho nanométrico ligadas à membrana liberadas pelas células no ambiente extracelular. Esses EVs transferem ácidos nucléicos, proteínas e lipídios para modular várias vias de sinalização após a captação pelas células receptoras. Especificamente, EVs isolados do músculo esquelético (SkM-EVs) foram implicados na degeneração, regeneração e crescimento muscular pela transferência de microRNAs reguladores miogênicos ou fatores de transcrição 1,2,3,4. À medida que nossa compreensão das subpopulações e características de SkM-EV continua a evoluir, essas vesículas se mostram promissoras como biomarcadores para diagnósticos precoces ^5,6 e como alvos terapêuticos para distúrbios neuromusculares. Este campo em expansão oferece oportunidades interessantes para investigação patológica e aplicações clínicas.

A pesquisa atual sobre SkM-EVs concentra-se predominantemente naqueles obtidos a partir de sobrenadantes de cultura de células após cultura ex vivo ^2,7,8, levantando preocupações sobre a fidelidade das linhagens celulares alvo após passagens sucessivas e a suscetibilidade das características de EV à alteração em ambientes artificiais. Isso destaca a necessidade de isolar SkM-EVs diretamente dos tecidos musculares para evitar influências de cultura ex vivo e representar melhor as condições in vivo. Embora várias abordagens para isolar EVs de tecidos musculares tenham sido desenvolvidas ^9,10, os estudos ainda variam significativamente nos detalhes do protocolo, impactando a consistência e a comparabilidade. Um protocolo padronizado para isolamento e caracterização de SkM-EV é urgentemente necessário para garantir a confiabilidade em estudos relacionados.

Considerando as características fisiológicas do músculo esquelético, desenvolvemos um protocolo para isolar e purificar SkM-EVs de amostras de músculo esquelético de roedores usando descolamento mecânico, dissociação enzimática, filtração e ultracentrifugação diferencial. Por meio de uma análise abrangente usando citometria de nanofluxo, ensaio BCA e ensaio Western blot, descobrimos que esse protocolo produz consistentemente SkM-EVs de alta pureza e quantidade dentro de um período de tempo limitado. Pode ser aplicado a amostras de músculo esquelético em várias condições, incluindo lesões musculares agudas e crônicas. Além disso, com os devidos ajustes, este método pode ser adaptado para tecidos musculares de pacientes humanos ou outros modelos animais. A padronização do processo de isolamento do SkM-EV é essencial para garantir a consistência na qualidade do SkM-EV, facilitando comparações das características do EV - como rendimento, tamanho, composição da carga e função - e avançando suas aplicações potenciais como biomarcadores de diagnóstico, bem como aprimorando nossa compreensão de seus papéis em vários processos fisiológicos e patológicos.

Este protocolo isola vesículas extracelulares (EVs) do tecido muscular esquelético usando descolamento mecânico, dissociação enzimática, filtração e ultracentrifugação diferencial. Ele permite o isolamento de EVs de grupos musculares de membros de roedores individuais ou combinados, incluindo o tibial anterior (TA), extensor longo dos dedos (EDL), sóleo (SOL), gastrocnêmio (GAS) e quadríceps (QUA). O uso de animais foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Geórgia, e o estudo cumpriu as Diretrizes do National Institutes of Health para o cuidado e uso de animais em pesquisa. Os animais foram alojados nas instalações de animais do Departamento de Ciência Animal e de Laticínios da Universidade da Geórgia. Camundongos machos adultos do tipo selvagem (C57BL/6J) foram usados neste estudo, com tecido colhido de camundongos sacrificados aos 3 meses de idade. Detalhes dos reagentes e equipamentos usados são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Descolamento mecânico de grupos musculares do camundongo

1. Eutanasiar os camundongos com CO₂, seguido de luxação cervical (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Depile os dois membros posteriores.
2. Prenda a perna do mouse em uma placa estéril com o lado anterior da perna voltado para cima (Figura 1A).
3. Faça uma pequena incisão (5 mm) na pele do lado lateral do tornozelo do rato com uma tesoura de dissecção.
4. Insira uma lâmina da tesoura cuidadosamente na incisão, posicionando-a sob a pele, mas não no tecido muscular subjacente. Em seguida, corte a pele para cima em direção ao joelho para estender o comprimento da incisão.
5. Agarre a pele ao longo da incisão usando uma pinça áspera e expanda a abertura até que o músculo fique visível.
6. Localize o músculo TA, que vai do joelho ao tornozelo na face lateral do osso da tíbia¹¹, e use uma pinça de ponta afiada para agarrar e descascar a fina camada de tecido conjuntivo que cobre o músculo (Figura 1B).
7. Próximo ao tornozelo, identifique os dois tendões no final do TA, um diretamente conectado ao músculo TA e o outro, o tendão EDL, que é menor e localizado próximo ao tendão TA na face lateral. Corte os dois tendões usando uma tesoura de dissecação.
8. Pegue os dois tendões com uma pinça áspera. Em seguida, use outra pinça áspera ou afiada para separar os tendões, separando assim o TA do EDL (Figura 1C).
9. Levante o TA pelo tendão recém-cortado com uma pinça de ponta áspera. Em seguida, corte o tendão TA próximo ao joelho usando uma tesoura de dissecção, removendo assim o músculo. Repita esse processo para remover o EDL e armazene os dois músculos em PBS no gelo.
10. Solte a perna e vire o mouse para que a face posterior fique voltada para cima.
11. Com a pele da perna agora parcialmente removida, corte a pele perto do tornozelo usando uma tesoura de dissecação. Em seguida, use uma pinça áspera para agarrar e descascar a pele para cima em direção à parte de trás do joelho, expondo o GAS.
12. Corte o tendão GAS próximo ao tornozelo usando uma tesoura de dissecção (Figura 1D).
13. Segure o tendão do GAS com uma pinça áspera e levante-o para expor a parte inferior do GAS.
14. Localize o pequeno tendão SOL na parte inferior do GAS perto do joelho (onde o GAS ainda está conectado). Corte o tendão do SOL usando uma tesoura de dissecção, fazendo com que o SOL se contraia para cima (Figura 1E).
15. Segure o tendão SOL cortado com uma pinça afiada e levante-o suavemente, destacando assim o SOL da parte inferior do GAS.
16. Corte a extremidade do SOL onde ele se liga à extremidade cortada do GAS usando uma tesoura de dissecação, separando assim os dois músculos. Preserve o SOL em PBS no gelo.
17. Corte a ponta do GAS perto do joelho e coloque-o em PBS no gelo.
18. Depois de remover os quatro músculos listados abaixo do joelho, vire o mouse para que a face anterior fique para cima.
19. Se necessário, descasque ainda mais a pele com uma pinça áspera para expor o QUA. Posicione a perna do mouse em um ângulo de 90° para forçar o QUA a flexionar. Corte o tendão mais próximo do joelho usando uma tesoura de dissecação.
    1. Separe o QUA do fêmur cortando entre o músculo e o osso até que o QUA seja conectado apenas pelo tendão proximal (Figura 1E). Em seguida, corte o tendão proximal e remova o QUA. Coloque o QUA em PBS no gelo.
20. Certifique-se de que, após os descolamentos musculares, a tíbia e a fíbula estejam claramente expostas (Figura 1F).
21. Enxágue os músculos várias vezes com PBS para remover contaminantes como pêlo e sangue (Figura 1G). Em seguida, seque os músculos suavemente com toalhas de papel. Use uma balança analítica para medir o peso muscular, que será usada posteriormente para calcular o EV coletado por grama de músculo.

2. Dissociação enzimática de pedaços musculares destacados

1. Remova suavemente os tendões musculares da amostra muscular usando pinças afiadas, pinças de lascas, bisturis ou tesouras (Figura 2A).
2. Após a remoção do tendão, corte o músculo longitudinalmente ao longo das fibras musculares (do tendão ao tendão) em pedaços de músculo de 1 mm de espessura usando uma tesoura ou bisturi para aumentar a relação área-volume da superfície (Figura 2B, C).
   NOTA: Tente limitar os danos à miofibra durante o corte. Para músculos maiores, como TA, GAS e QUA, faça cortes adicionais em comparação com músculos menores, como EDL e SOL, para garantir uma proporção aproximadamente igual de área de superfície para volume em todas as amostras de músculo (Figura 2D).
3. Prepare 10 mL de tampão de enzima digestiva fresca (DEB) para cada camundongo e mantenha-o no gelo até o uso.
   1. Para preparar DEB, misture 2 mg de enzima colagenase II por 1 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com solução de penicilina-estreptomicina a 1%. Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 μm após a mistura.
   2. Certifique-se de que o DEB tenha uma atividade enzimática de mais de 250 unidades. Vortex o DEB até que a solução esteja completamente misturada e o pó da enzima colagenase II não seja mais visível.
4. Separe o tecido muscular em alíquotas, cada uma contendo 20 mg de tecido muscular. Em seguida, adicione 1 mL de DEB a cada alíquota para dissociação enzimática.
5. Incubar o DEB e a mistura muscular num agitador na incubadora a 37 °C durante 12 h a uma velocidade de agitação de 100 rotações por minuto (rpm) (figura 2E).

3. Filtração e centrifugação de baixa velocidade para enriquecer o SkM-EV

NOTA: Defina a centrífuga refrigerada para 4 °C e deixe-a funcionar até atingir a temperatura definida. Mantenha todos os tubos e amostras necessários no gelo até que estejam prontos para uso.

1. Após os procedimentos de digestão enzimática, certifique-se de que nenhum pedaço de músculo discernível seja visível (Figura 3A). Antes da centrifugação refrigerada, extraia 10 μL de solução da mistura DEB-músculo e transfira-a para um tubo de 0,2 mL para teste de viabilidade celular, se necessário.
2. Prepare e rotule novos tubos vazios de microcentrífuga de 1,5 mL. Configure um filtro de 0,45 μm e uma seringa de 5 mL removendo o êmbolo (não descarte) e aparafusando o cubo na extremidade superior do filtro de 0,45 μm. Posicione o filtro de forma que a extremidade inferior seja colocada em um tubo vazio recém-rotulado (Figura 3D). Filtre o PBS 1x através de um filtro de 0,2 μm.
3. Centrifugue a mistura por 10 min a 1.000 x g e 4 ° C para pellet quaisquer detritos ( Figura 3B ). Transfira o sobrenadante (cerca de 1 ml) para a seringa utilizando uma micropipeta P200 (figura 3C,E).
4. Reinsira o êmbolo da seringa e empurre lentamente o sobrenadante através do filtro, permitindo que ele passe e se acumule no tubo de microcentrífuga de 1,5 mL recém-rotulado (Figura 3F).
5. Remova o êmbolo novamente e pipete cerca de 200 μL de 1x PBS na seringa.
6. Reinsira o êmbolo e empurre lentamente os 200 μL de 1x PBS através do filtro (Figura 3G) para remover qualquer sobrenadante restante do filtro e para o tubo de microcentrífuga de 1.5 mL rotulado.
7. Repita o processo de filtração para outros tubos, usando um novo filtro para cada amostra de tecido.
8. Após a filtração, certifique-se de que a solução seja transparente e desprovida de pedaços musculares residuais ( Figura 3H ).

4. Ultracentrifugação diferencial para purificação SkM-EV

NOTA: Defina a centrífuga refrigerada para 4 °C e deixe-a funcionar até atingir a temperatura definida. Mantenha todos os tubos e amostras necessários no gelo e prontos para uso.

1. Transfira a solução filtrada para novos microtubos de 1,5 mL (adequados para até 200.000 x g). Equilibre todos os microtubos com 1x PBS adicional para garantir o mesmo volume antes de colocá-los na micro-ultracentrífuga.
2. Depois de garantir que o volume de todos os tubos seja igual, feche os tubos e coloque-os no rotor da micro-ultracentrífuga a ser balanceada (Figura 4A).
3. Ligue a micro-ultracentrífuga e configure-a para funcionar por 1 h a 100.000 x g e 4 ° C (Figura 4B).
4. Coloque o rotor carregado com os tubos na micro-ultracentrífuga, feche a tampa e ligue o vácuo (Figura 4C).
5. Quando o vácuo atingir o nível 2, pressione o botão Iniciar e aguarde até que o processo de centrifugação seja concluído (Figura 4D).
6. Após a conclusão do ciclo da micro-ultracentrífuga, clique no botão de vácuo para repressurizar a câmara antes de remover o rotor e os tubos. Mantenha os tubos no gelo e posicione-os na vertical para evitar perturbar o pellet.
7. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma micropipeta P200, evitando perturbar o pellet (Figura 4E).
8. Ejete a ponta e, em seguida, adicione 50 μL de 1x PBS no tubo após remover o sobrenadante usando uma micropipeta P200. Para amostras de GAS e QUA, adicione até 500 μL de 1x PBS para ajudar na dissolução ( Figura 4F ).
9. Ressuspenda o pellet pipetando suavemente para cima e para baixo usando uma micropipeta P20 (ou micropipeta P200 se 500 μL foram adicionados) até que esteja totalmente quebrado e não seja mais visível.
10. Feche o tubo e armazene-o a 4 °C para armazenamento de curto prazo (menos de uma semana), -80 °C para armazenamento de longo prazo ou coloque o tubo de volta no gelo se a amostra for imediatamente caracterizada usando citometria de nanofluxo, Western blot ou outros ensaios.

Seguindo este protocolo, as vesículas extracelulares do músculo esquelético (SkM-EVs) foram extraídas com sucesso de vários grupos musculares, incluindo o tibial anterior (TA), extensor longo dos dedos (EDL), sóleo (SOL), gastrocnêmio (GAS) e quadríceps (QUA) de camundongos selvagens. A caracterização subsequente desses SkM-EVs foi conduzida por meio de citometria de nanofluxo, elucidando suas características distintas, conforme resumido na Tabela 1. Notavelmente, a partir de apenas 1 g de tecido muscular, foi obtido um rendimento impressionante de 1,18e14 ± 4,86e13 SkM-EVs, com um tamanho médio de partícula de 73,93 nm ± 2,70 nm e um tamanho médio de partícula de 72,55 nm ± 2,42 nm. A distribuição de tamanho apresentou variância de 13,28 nm ± 1,71 nm (Figura 5), alinhando-se precisamente com a definição reconhecida de EVs12,13.

Para garantir a integridade dos SkM-EVs isolados, o MemGlow-488, uma sonda de membrana fluorogênica, foi empregado para rotular a estrutura lipídica dentro das amostras de SkM-EV (Figura 5), revelando uma surpreendente preservação de 96,40% ± 2,42% de membranas envoltas em lipídios em toda a população isolada. Além disso, a pureza dos SkM-EVs foi rigorosamente avaliada utilizando o ensaio de proteína do ácido bicinconínico (BCA), que revelou 4,82 μg ± 2,28 μg de proteínas presentes por trilhão de EVs. A análise de Western blot demonstrou a expressão de marcadores EV-positivos (CD8114 e Alix15) em SkM-EVs isolados, confirmando sua pureza e ausência de contaminantes celulares da tubulina (Figura 6).

Em seguida, ensaios de viabilidade celular usando corante azul de tripano foram conduzidos para determinar a viabilidade das células residentes no músculo durante o processo de isolamento. Esses testes confirmaram que o protocolo não prejudicou significativamente as células residentes no músculo, registrando uma viabilidade celular em torno de 55%. Análises e caracterizações adicionais podem ser aplicadas a esses SkM-EVs para explorar e entender seu papel como mediadores vitais da comunicação intercelular no desenvolvimento e fisiologia muscular.

Figura 1: Procedimento para descolamento mecânico de grupos musculares de camundongos. (A) A perna do rato é presa em uma placa estéril com o lado anterior voltado para cima. (B) O TA está localizado e pinças de ponta afiada são usadas para agarrar e descascar a fina camada de tecido conjuntivo que cobre o músculo. (C) O EDL, adjacente ao TA, é identificado e cuidadosamente separado do TA. (D) Os tendões GAS e SOL estão localizados e cortados. (E) O músculo QUA é identificado e cuidadosamente separado do fêmur. (F) Após os descolamentos musculares, a tíbia e a fíbula ficam claramente expostas. (G) Os músculos destacados são enxaguados várias vezes com PBS para remover quaisquer contaminantes, como pêlo e sangue. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Dissociação enzimática de pedaços musculares destacados. (A) Os tendões musculares são removidos suavemente da amostra muscular. (BD) Tesouras ou bisturi são usados para cortar o músculo longitudinalmente ao longo das fibras musculares (do tendão ao tendão) em pedaços musculares de 1 mm de espessura, garantindo uniformidade de tamanho para facilitar até mesmo a dissociação enzimática. (E) A mistura DEB e muscular é incubada no agitador dentro da incubadora por 12 h a 37 ° C com uma velocidade de agitação de 100 rpm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Filtração e centrifugação de baixa velocidade para enriquecer SkM-EVs. (A) Após a digestão enzimática, nenhum pedaço de músculo discernível deve ser visível na mistura. (B) A mistura é centrifugada por 10 min a 1.000 x g e 4 ° C para granular quaisquer detritos restantes. (CE) Usando uma pipeta de 200 μL, o sobrenadante é cuidadosamente transferido 200 μL de cada vez para uma seringa. (F) O êmbolo da seringa é reinserido e o sobrenadante é empurrado lentamente através do filtro para remover quaisquer detritos restantes. (G) O êmbolo é reinserido e 200 μL de 1x PBS são empurrados lentamente através do filtro para lavá-lo. (H) Após a filtração, a solução deve ser transparente e desprovida de quaisquer pedaços de músculo residual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Ultracentrifugação diferencial para purificação de SkM-EV. (A) Depois de garantir que o volume de todos os tubos seja igual, os tubos são fechados e colocados no rotor da micro-ultracentrífuga, garantindo o equilíbrio adequado. (B) A micro-ultracentrífuga é ligada e ajustada para 100.000 g por 1 h a 4 ° C. (C) O rotor balanceado com os tubos é carregado na micro-ultracentrífuga. A tampa é fechada e o aspirador é ligado. (D) Quando o vácuo atinge o nível 2, o botão de partida é pressionado para permitir que a ultracentrífuga funcione até a conclusão. (E) O sobrenadante é cuidadosamente removido sem perturbar o pellet (indicado pela seta). (F) Após a remoção do sobrenadante, 50 μL de 1x PBS são adicionados ao tubo usando uma micropipeta de 200 μL ou 100 μL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Padrão de distribuição de tamanho e coloração MemGlow-488. Padrão de distribuição de tamanho e coloração MemGlow-488 de SkM-EVs isolados de diferentes grupos musculares, incluindo TA (A,B), EDL (C,D), SOL (E,F), GAS (G,H) e QUA (I,J). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Análise de Western blot. Análise de Western blot de tubulina, CD81 e Alix em SkM-EVs e lise do músculo esquelético. Quantidades iguais de proteína (5 μg por pista) são carregadas no gel para cada amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Caracterização de SkM-EVs isolados. A distribuição de tamanho e o teor de proteína são medidos por citometria de nanofluxo e ensaio de proteína BCA, respectivamente.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.