Teste de eficiência de tradução usando perfis polissômicos sob estresse térmico

Resumo

O protocolo aqui apresentado envolve o perfil polissômico para isolar translatome, mRNAs associados a ribossomos, em RNAs não polissomais e polissomais de Arabidopsis por meio de centrifugação por gradiente de densidade de sacarose. Este método demonstra a eficiência de tradução de Arabidopsis estressada pelo calor.

Resumo

O controle translacional de diferentes genes sob estresse térmico é uma etapa crítica para a adaptação das plantas ao ambiente. Avaliar as atividades translacionais de vários genes pode nos ajudar a entender os mecanismos moleculares subjacentes à resiliência das plantas, contribuindo para o desenvolvimento de culturas com maior tolerância ao estresse diante das mudanças climáticas globais. Este trabalho apresenta uma metodologia detalhada para avaliar a eficiência da tradução por meio de perfis polissômicos em plantas expostas ao estresse térmico. O procedimento é dividido em três partes: tratamento de estresse térmico para Arabidopsis, teste de eficiência de tradução usando perfis polissômicos e cálculo da eficiência de tradução isolando RNA não polissômico e polissômico com base no perfil. Na primeira parte, as plantas de Arabidopsis são submetidas a condições controladas de estresse térmico para mimetizar os desafios ambientais. O tratamento envolve a exposição das plantas a altas temperaturas por períodos especificados, garantindo uma indução de tensão consistente e reprodutível. Esta etapa é crucial para estudar as respostas fisiológicas e moleculares da planta ao estresse térmico. A segunda parte envolve o teste de eficiência de tradução usando perfis polissômicos. Os polissomas são extraídos por centrifugação por gradiente de sacarose, que separa os mRNAs com base na carga ribossômica. Isso permite o exame da ocupação do ribossomo em mRNAs, fornecendo informações sobre os mecanismos de controle translacional sob condições de estresse. Na terceira parte, o RNA é isolado de frações polissomais e não polissomais. O RNA spike-in é usado para medir com precisão a quantidade de RNA em cada fração. O cálculo da eficiência da tradução é realizado comparando a distribuição de mRNAs entre essas frações em condições normais e de estresse térmico. As atividades de tradução de genes específicos são avaliadas posteriormente pela realização de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) com RNA associado ao ribossomo e RNA total. Esta metodologia foca-se exclusivamente nos efeitos do stress térmico, fornecendo um protocolo detalhado para análise da regulação translacional em plantas.

Introdução

A tradução é crucial para os organismos sintetizarem proteínas funcionais a partir do mRNA, apoiando funções celulares essenciais e processos biológicos como metabolismo e sinalização e permitindo respostas ao estresse. Sem tradução, as células não podem produzir proteínas vitais, impactando sua estrutura, função e regulação, afetando assim a sustentação da vida e promovendo a diversidade biológica ^1,2. Portanto, estudar a eficiência translacional das plantas é crucial. A tradução envolve várias etapas essenciais. Primeiro, a iniciação ocorre quando o mRNA se liga a um ribossomo, facilitado por fatores de iniciação, como eIFs em eucariotos, que identificam o códon de início, normalmente AUG. Em seguida, o alongamento prossegue à medida que as moléculas de RNA de transferência (tRNA), cada uma carregando aminoácidos específicos, se ligam sequencialmente ao ribossomo. As ligações peptídicas se formam entre os aminoácidos adjacentes, alongando a cadeia polipeptídica de acordo com a sequência de mRNA. Finalmente, a terminação é iniciada ao encontrar um códon de parada (UAA, UAG ou UGA), reconhecido por fatores de liberação que levam o ribossomo a liberar a proteína recém-sintetizada. Ao longo da tradução, vários fatores de iniciação eucariótica (eIFs), fatores de alongamento e RNAs ribossômicos trabalham juntos para garantir precisão e eficiência ^3,4.

Estudos anteriores indicaram que as modificações pós-traducionais desempenham um papel crítico na regulação das interações entre os eIFs e, portanto, influenciam a eficiência da tradução. Pesquisas in vitro revelaram que a CASEÍNA QUINASE 2 (CK2) quinase fosforila eIF3c, eIF5 e eIF2β para aumentar suas interações entre si e com eIF1 ^5,6. No escuro, a ligase E3 CONSTITUTIVAMENTE FOTOMORFOGÊNICA 1 (COP1) reprime a tradução inibindo a fosforilação mediada por TOR de S6K-RPS6. O RPS6 não fosforilado é incapaz de formar ribossomos funcionais, interrompendo assim a tradução⁷. Por outro lado, sob condições de luz, o SUPRESSOR DE PHYA 105 (SPA1) quinase fosforila eIF2α para facilitar a montagem do complexo eIF2 e promover o início da tradução⁸. Essas descobertas destacam os complexos mecanismos de controle que regulam a tradução em resposta a sinais ambientais.

Estímulos ambientais moderados podem efetivamente promover processos translacionais para facilitar o crescimento, como a fotomorfogênese ^8,9. No entanto, quando os fatores ambientais são excessivos, as plantas imóveis precisam desenvolver mecanismos regulatórios adequados para mitigar os danos causados pelo estresse ambiental¹⁰. Em estudos anteriores relacionados às respostas ao estresse das plantas, a maioria se concentrou na regulação nos níveis metabólico, hormonal e transcricional 11,12,13,14. No entanto, pesquisas recentes começaram a destacar a influência da regulação translacional na tolerância ao estresse da planta 15,16,17. As plantas podem aumentar sua tolerância ao estresse reduzindo a eficiência translacional, minimizando assim o consumo desnecessário de energia. Devido à formação de grânulos de estresse não membranoso nas células vegetais, o mRNA não traduzido e as proteínas associadas se agregam dentro deles para reduzir a eficiência translacional¹⁸. Um dos estresses ambientais comuns que as plantas costumam encontrar é o estresse térmico, que foi relatado como indutor da formação de grânulos de estresse dentro das células vegetais^19,20. O aumento global das temperaturas médias devido ao aquecimento global afeta severamente o rendimento das culturas²¹. Portanto, estudar a regulação fisiológica de plantas sob estresse térmico é crucial. Um estudo anterior mostrou que o tratamento térmico do trigo resultou em uma diminuição no mRNA ligado ao polissomo. No entanto, os mRNAs armazenados em grânulos de estresse foram liberados e religados aos ribossomos, facilitando a tradução após a recuperação²². Além disso, pesquisas anteriores compararam a expressão gênica entre o mRNA total e o mRNA ligado ao polissomo em plantas submersas¹⁶. Os resultados indicaram que os níveis de mRNA no estado estacionário associados ao ácido abscísico e às respostas ao estresse abiótico aumentaram ligeiramente após a submersão. Além disso, a quantidade de mRNAs ligados ao polissomo aumentou significativamente. Esses resultados sugerem que a regulação da tradução pode desempenhar um papel mais crítico no controle da tolerância ao estresse em plantas. Portanto, um método eficaz de isolamento de RNA polissômico é crucial para estudar o translatômio de amostras tratadas com estresse.

Neste protocolo, modificamos o método de isolamento de RNA da extração de fenol/clorofórmio volumosa e de alto risco com método de precipitação de LiCl para o método de extração de tiocianato de fenol/guanidínio em pequena escala, que requer menos volume. O primeiro método envolve a mistura direta com frações polissomais, resultando em um resíduo experimental maior ^9,15,23. Em contraste, essa abordagem modificada utiliza princípios de densidade diferencial: o RNA polissômico é primeiro misturado com uma solução sem açúcar com alto teor de sal e depois precipitado por ultracentrifugação. Posteriormente, a extração de RNA é realizada usando um pequeno volume de reagente tiocianato de fenol/guanidínio. Este método reduz efetivamente a geração de resíduos orgânicos, tornando nosso experimento mais ecológico. Além disso, os solventes orgânicos utilizados apresentam menor toxicidade. Essas razões nos levaram a ajustar e melhorar os procedimentos experimentais de acordo. Além disso, os métodos anteriores não forneciam um protocolo abrangente para calcular as eficiências de tradução usando a normalização de pico, o que é essencial para análises translatômicas mais aprofundadas.

Aqui, descrevemos o perfil polissômico e o protocolo de isolamento de RNA polissômico para investigar a eficiência da tradução e análises translatômicas em Arabidopsis sob estresse por choque térmico. Este protocolo foi empregado para avaliar a eficiência da tradução no tipo selvagem Col-0 em condições normais, de choque térmico e pós-recuperação. Os resultados do perfil polissômico e a porcentagem de RNA polissômico revelaram alterações na eficiência da tradução após o tratamento com estresse térmico em mudas de Arabidopsis .

Protocolo

1. Preparação de amostra de mudas de Arabidopsis tratada com estresse térmico

1. Plaquear 250 sementes para cada repetição e cada condição com um conta-gotas no papel de filtro colocado na placa de ágar meio basal Murashige e Skoog (MS) sem sacarose (pH 5,6) suplementada com 1,2% de fitoágar.
   NOTA: Para plantar mudas em placas MS, papel de filtro estéril é colocado na placa para evitar que as raízes das mudas penetrem profundamente no meio, facilitando a amostragem. As sementes são então plantadas em cima do papel de filtro. Para excluir a influência dos açúcares no crescimento das plantas e nos resultados experimentais, recomenda-se o uso de um meio MS que não contenha sacarose para o cultivo.
2. Enrole a placa MS contendo sementes plantadas com papel alumínio para bloquear a luz e incube-a a 4 ° C por 2 dias para induzir a vernalização.
3. Transferir as sementes vernalizadas para uma câmara de crescimento a ser cultivada a 16 h: 8 h, fotoperíodo claro-escuro a 22 °C com uma intensidade de luz de 100 μmol/m²/s.
4. Para amostras de estresse térmico, sele as placas médias MS contendo mudas de 5 dias com fita adesiva à prova d'água e coloque-as em banho-maria a 40 ° C por 1 h.
5. Para amostras que se recuperam após o tratamento térmico, resfrie as placas imediatamente após o tratamento térmico. Em seguida, colocá-los em uma câmara de crescimento a 22 °C por 2 h.
6. Colha 250 mudas tratadas ou não em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para cada repetição e congele as amostras em nitrogênio líquido imediatamente.
   NOTA: Para cada condição, foram preparados dois grupos de amostras. Um é para as análises de perfil polissômico e o outro é para a extração de RNA não polissômico e polissomal.

2. Preparação do gradiente de sacarose

1. Preparar a solução gradiente contendo as seguintes concentrações de sacarose: 12,5%, 24,4%, 36,3%, 48,1% e 60%. A composição da solução inclui 50 mM de Tris-HCl, 25 mM de KCl, 10 mM de MgCl₂, 100 μg/mL de heparina e 50 μg/mL de cicloheximida (CHX).
2. Carregue as soluções de gradiente de alta para baixa concentração, começando de baixo para cima. Depois de adicionar cada concentração de solução de gradiente, congele a solução para um estado sólido antes de adicionar a próxima concentração. Para cada concentração de gradiente de sacarose, adicione 2,2 mL. Este processo resultará em um gradiente de densidade de sacarose descontínuo.
3. Conservar temporariamente o gradiente de sacarose preparado a -80 °C e descongelar durante a noite a 4 °C antes de utilizar.

3. Preparação da amostra de perfil de polissomo

1. Moer 250 mudas Col-0 de 5 dias, estressadas pelo calor ou não, que foram previamente congeladas em pó usando um homogeneizador a uma frequência de 30 ciclos/s por 1 min.
   NOTA: Quando o número de plantas com o mesmo fundo é igual, elas têm o mesmo rendimento de extração de RNA. No entanto, ao comparar plantas transgênicas ou mutantes superexpressas com diferentes origens, a quantidade de plantas utilizadas deve ser ajustada de acordo com as condições da planta.
2. Para obter uma solução de extração contendo RNA não polissômico e polissomal, adicione 500 μL de tampão de extração polissômica (200 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 50 μg / mL cicloheximida, 100 μg / mL de heparina, 2% PTE, 10% DOC, 400 U / mL Inibidor de ribonuclease) a cada tubo e misture as amostras por inversão e vórtice. Certifique-se de que as amostras sejam mantidas a 4 °C durante todo o processo.
3. Centrifugar a solução de extracção a 4 °C, 12.000 x g durante 10 min. Em seguida, filtrar o sobrenadante através de um filtro de células de 100 μm para obter uma solução de extracção límpida e sem partículas.
   NOTA: As partículas presentes na solução de extração podem sedimentar durante a ultracentrifugação, potencialmente formando um pellet que pode afetar a precisão das medições de perfil de polissomo.
4. Carregar o sobrenadante filtrado num gradiente de sacarose pré-preparado e assegurar que atinge o equilíbrio.
   NOTA: Devido à alta velocidade de rotação da ultracentrífuga, é essencial garantir a segurança e o bom funcionamento da ultracentrífuga. Para conseguir isso, é necessário confirmar que os pesos da amostra são idênticos antes da rotação. Portanto, utilizamos uma balança de precisão para verificar se os pesos dos gradientes são completamente uniformes.
5. Centrifugar o gradiente de sacarose carregado com amostras a 4 °C, 210.000 x g durante 3,5 h utilizando um rotor de balde oscilante por ultracentrifugação. Defina as taxas de aceleração e desaceleração para o máximo. Após a ultracentrifugação, o RNA não polissômico e polissômico é distribuído de acordo com sua densidade na solução de gradiente de sacarose correspondente.
   NOTA: No gradiente de sacarose, o RNA não polissômico com menor densidade se distribui na camada superior, enquanto o RNA polissomal, caracterizado por maior densidade devido à presença de numerosos ribossomos envolvidos na tradução ativa no mRNA, se distribui na camada inferior. Posteriormente, o perfil de polissomos pode ser medido usando um fracionador de gradiente de densidade.

4. Análise de perfil de polissomos

NOTA: Um fracionador de gradiente de densidade com uma bomba de seringa de microvolume é usado para medir o perfil de polissomas.

1. Prepare a solução de perseguição (70% de sacarose, 10% de glicerol e 0,02% de azul de bromofenol) para a bomba de seringa de microvolume.
2. Use o software para controlar o fracionador de gradiente de densidade. Calibre a máquina usando água deionizada. Após a calibração, use-o para realizar o perfil de polissomos.
   1. Para realizar o ajuste da linha de base, ligue o UV/VISDetector até que a luz mude de vermelho para verde. Ajuste o botão Deslocamento do gravador para alinhar a linha do marcador e, em seguida, gire o botão Ajuste da linha de base para a posição aberta mínima. Defina o botão Sensibilidade no UV/VISDETECTOR para o nível 2.0 e pressione o botão Auto Baseline . Por fim, use o botão Recorder Offset para ajustar a linha de base desejada para 20. O processo calibrado varia de acordo com a marca do mecanismo e as diferentes amostras.
3. Após a ultracentrifugação, coloque os tubos com as amostras no fracionador de gradiente de densidade usando o sistema de perfuração do tubo para que o tubo possa ser conectado à bomba de seringa com a solução de perseguição e o detector UV.
4. Mude o fracionador de gradiente de densidade para o modo de controle de software (REMOTE) e defina a taxa de fluxo de injeção da bomba de seringa de microvolume para 3 mL / min.
5. Inicie as configurações do software para iniciar e obter o gráfico de perfil de polissomo usando o fracionador medindo OD₂₅₄.

5. Isolamento de RNA não polissômico e polissômico

NOTA: Para esta parte do protocolo, um grupo diferente de amostras do mesmo lote foi usado após a realização da ultracentrifugação seguindo as mesmas etapas descritas anteriormente.

1. Com base nos resultados da medição do perfil polissômico, coletar as frações de RNA não polissômica e polissômica separadamente. Calcular os volumes de solução para as fracções não polissómicas e polissómicas e recolher a fracção não polissómica (parte superior).
   NOTA: De acordo com os perfis, a fração com mais de dois ribossomos é definida como uma fração polissomal, enquanto a fração com os picos de rRNA 40S, 60S e 80S é definida como uma fração não polissomal.
2. Misture bem as frações alvo de RNA com solução pré-fria 2x com alto teor de sal (400 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM KCl, 50 mM MgCl₂).
3. Adicione 8 μL de estoque diluído de controle de RNA poli-A eucariótico do kit.
   NOTA: Para a normalização de pico necessária para a sétima etapa. O Kit de Controle de RNA Poli-A Eucariótico inclui genes de B. subtilis , como o gene DAP , que não estão presentes nas plantas, como genes de referência. Para determinar a proporção de perda do gene de referência durante a reação após a extração, adicione uma quantidade igual do reagente contendo amostra de RNA do gene DAP a diferentes tubos com RNA não polissômico ou polissômico antes da extração. Isso permite a determinação da proporção de perda de genes de referência durante a reação após a extração e pode ser usado para fins de normalização.
4. Centrifugue a solução de alto teor de sal de RNA misturado a 4 °C, 450.000 x g, por 5 h usando um rotor de balde oscilante de ultracentrífuga.
5. Após a ultracentrifugação, o RNA precipitará na parte inferior do tubo da centrífuga. Despeje cuidadosamente o sobrenadante de cima para preservar o pellet de RNA na parte inferior.
6. Lave rapidamente o pellet de RNA com 500 μL de água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) pré-frio, repetindo esta etapa 3x.
   NOTA: Para evitar que a água tratada com DEPC dissolva novamente o RNA durante o processo de lavagem, é necessário pré-resfriar a água tratada com DEPC antes do uso para reduzir sua solubilidade. Além disso, o tempo de contato entre a água tratada com DEPC e o pellet de RNA durante a lavagem deve ser minimizado.

6. Extração de RNA não polissômico e polissômico

1. Adicione 500 μL de reagente de extração de RNA e misture com a amostra de RNA a ser extraída. Incubar por 10 min.
2. Adicione 100 μL de clorofórmio, misture bem e incube por 10 min para separação de fases.
3. Centrifugue a mistura de reação a 4 °C, 12.000 x g por 10 min. Transfira a camada aquosa clara superior contendo RNA para um novo tubo, misture-a suavemente com um volume igual de isopropanol e incube a -20 ° C por 2 h para precipitação de RNA.
4. Após a precipitação, centrifugue a 4 °C, 12.000 x g por 10 min. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e retenha o pellet de RNA na parte inferior.
5. Lave o pellet de RNA com 1 mL de etanol a 75% pré-resfriado. Centrifugue a 4 °C, 12.000 x g por 10 min, descarte o sobrenadante e seque ao ar o pellet de RNA.
6. Uma vez que o pellet de RNA esteja seco, ressuspenda o pellet de RNA em 30 μL de água tratada com DEPC e meça a concentração de RNA (OD₂₆₀) usando um espectrofotômetro de espectro completo (220 nm-750 nm).

7. Normalização de pico

1. Use 1000 ng de RNA extraído para transcrição reversa feita usando um kit qPCR seguindo as instruções do fabricante. Tanto o RNA não polissômico quanto o polissômico precisam ser transcritos reversamente em cDNA.
2. Misture 1 μL de cDNA com primers do gene DAP e use o tampão SYBR para medir o nível de expressão do gene alvo de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, use PCR em tempo real para detectar a expressão do gene DAP .
   NOTA: As sequências dos primers do gene DAP são as seguintes:
   Primer direto = 5'-ATA AAA GAA TTC AGC TAA CGC TTC C-3'
   Primer reverso = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3'
3. Comparar os níveis de expressão dos genes DAP nos grupos de RNA não polisssomal e polissômico medidos e estimar o conteúdo de RNA em condições de perda proporcional. Usando o conteúdo de RNA normalizado, calcule a proporção de RNA em polissomos.

Resultados

O tipo selvagem de Arabidopsis, Col-0, foi cultivado em meio MS sob fotoperíodo de luz de 16 h:8 h. Para o controle, foram utilizadas mudas com 5 dias de idade, sem tratamento por estresse térmico. O grupo de estresse térmico foi submetido a 1 h de tratamento térmico a 40 °C em banho-maria pré-aquecido, enquanto o grupo de recuperação foi colocado a 22 °C por 2 h imediatamente após o tratamento térmico. Ao empregar diferentes condições de tratamento térmico e condições de recuperação, podemos utilizar etapas subsequentes para medir sua eficiência translacional.

Antes da extração do RNA, o gradiente de sacarose deve ser preparado primeiro. Para separar o RNA não polissômico e polissômico com base em sua diferença de densidade, preparamos uma solução gradiente com concentrações de sacarose de 12,5%, 24,4%, 36,3%, 48,1% e 60%. Em seguida, carregamos as soluções de gradiente de alta para baixa concentração, começando pela parte inferior (Figura 1A). Posteriormente, podemos utilizar esse gradiente para separar o RNA não polissômico de baixa densidade na camada superior, enquanto o RNA polissômico de alta densidade será distribuído na camada inferior com maiores concentrações de sacarose. O RNA não polissômico e polissômico foi extraído do Col-0 tratado ou não tratado. Para evitar que as partículas na solução afetem os resultados da análise de perfil de polissomas, a solução contendo RNA deve ser filtrada através de um filtro de células para obter uma solução de extração livre de partículas. O sobrenadante filtrado foi carregado em um gradiente de sacarose pré-preparado e equilibrado. Após a ultracentrifugação das amostras carregadas com gradiente de sacarose, o RNA não polissômico e polissômico foi distribuído de acordo com a densidade dentro do gradiente de sacarose. Posteriormente, o perfil do polissomo foi realizado usando um fracionador de gradiente de densidade (Figura 1B). O fracionador de gradiente de densidade é controlado usando um software inicialmente calibrado com água deionizada. Após a calibração, as amostras são carregadas no fracionador após a ultracentrifugação. Operando no modo de controle de software, a bomba de seringa de microvolume injeta solução de sacarose com concentrações superiores ao gradiente de sacarose no gradiente, empurrando a amostra. Isso permite que a medição comece do topo do gradiente de sacarose, onde a densidade é menor, e prossiga em direção ao fundo, onde a densidade é maior. Posteriormente, as configurações do software são ativadas para iniciar a aquisição dos dados, gerando o gráfico do perfil do polissomo por meio da medição do OD₂₅₄ (Figura 1B). Quando observamos uma maior intensidade de sinal na fração polissomal, isso indica que a amostra apresenta maior eficiência de tradução.

As parcelas de perfil polissômico para mudas Col-0 de 5 dias de idade sob diferentes tratamentos são mostradas na Figura 2. Os resultados do grupo controle demonstram uma clara separação entre a fração não polissômica e a fração polissômica (Figura 2A). No entanto, após 1 h de estresse térmico a 40 °C, a intensidade do sinal da fração polissomal diminuiu significativamente (Figura 2B). Quando as mudas tratadas termicamente foram recuperadas a 22 ° C por 2 h, a intensidade do sinal da fração polissômica se recuperou para um nível semelhante ao grupo controle ( Figura 2C ). Nossos resultados demonstraram que o tratamento por estresse térmico de 1 h reduziu significativamente a eficiência de tradução de mudas de Arabidopsis. No entanto, as plantas necessitaram de 2 h de recuperação para restaurar a eficiência da tradução a níveis comparáveis aos de mudas que não sofrem de estresse térmico.

Para reunir mais evidências comparando a eficiência de tradução de plântulas de Col-0 sob diferentes condições de tratamento, isolamos e extraímos as frações de RNA não polissômica e polissomal. A coleta das frações de RNA não polissômicas e polissomais foi guiada pelos resultados das medidas do perfil polissômico. Para extração de RNA não polissômico e polissomal, usamos o reagente tiocianato de fenol/guanidínio para extrair as amostras isoladas de RNA não polissômico e polissomal. Com o método de extração de RNA que usamos, podemos obter RNA estável e de alta qualidade para nossa análise a seguir (Tabela 1). Posteriormente, normalize o RNA extraído com o Kit de Controle de RNA Poli-A Eucariótico GeneChip para mitigar erros causados por perdas de extração variáveis. Em seguida, a PCR em tempo real foi usada para quantificar a expressão dos genes DAP , que estão incluídos nos genes de B. subtilis adicionados ao kit. A análise comparativa dos níveis de expressão gênica do DAP entre os grupos de RNA não polissômico e polissômico foi realizada para estimar o conteúdo de RNA em condições de perda proporcional (Figura 3A). Calculamos a razão entre o RNA polissômico normalizado e o RNA total para esclarecer a eficiência da tradução entre eles (Figura 3B). Finalmente, a proporção de RNA nos polissomos foi calculada usando o conteúdo de RNA normalizado (Figura 3C). Os resultados da razão de RNA em polissomos sob diferentes tratamentos de Col-0 exibiram um padrão consistente com os resultados do perfil de polissomos mostrados na Figura 2A. Ambos os resultados indicam que o estresse térmico reduz significativamente a razão de RNA na fração polissomal, e esse efeito pode ser revertido após uma recuperação de 2 h a 22 ° C (Tabela 1).

A partir deste método, podemos obter toda a fração de RNA não polissômica ou polissômica com alta qualidade, em vez de separar o RNA em frações adicionais²³. Nossos resultados também demonstram que tanto os perfis de polissomos quanto a porcentagem de RNA em polissomos podem efetivamente refletir a eficiência da tradução em Arabidopsis com diferentes condições tratadas.

Figura 1: Diagrama de fluxo de trabalho de perfil de polissomo. (A) Ilustração esquemática da preparação do gradiente de sacarose em um tubo de centrífuga de 13 mL. (B) O fluxograma ilustra o processo experimental de perfil de polissomos. Em primeiro lugar, o translatômio é extraído. Posteriormente, o RNA não polissômico e polissômico é separado com base em suas diferenças de densidade usando ultracentrifugação em gradientes de sacarose de densidades variadas. O OD₂₅₄ é medido usando um fracionador de gradiente de densidade para obter o gráfico de resultados de perfil de polissomo abaixo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Perfil polissômico de Col-0 sob diferentes condições. (A, B, C) O perfil polissômico resulta de Col-0 sob condições de (A) sem tratamento térmico (controle), (B) tratamento térmico a 40 ° C por 1 h e (C) recuperação a 22 ° C por 1 h após o tratamento térmico. O RNA não polissômico e polissômico foi fracionado usando um gradiente de sacarose de 12,5% a 60%. As posições do RNA não polissômico (NP) e polissômico (PL) são indicadas nos perfis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Diagrama de fluxo de trabalho de extração de RNA não polissômico e polissomal. (A) Uma ilustração da normalização do RNA por spike in. (B) Uma ilustração da separação de RNA não polissômico e polissômico e o cálculo da porcentagem de RNA polissomal. (C) A porcentagem de RNA polissômico em Col-0 tratado com diferentes condições. As barras de erro indicam a média ± DP (n = 3 repetições biológicas). *Valor de p < 0,01, teste t de Student. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

		Conteúdo (ng)	260/280	260/230
Controle	RNANP	758.3	2.19	2.16
	RNAPL	302.3	2.21	2.13
Estresse térmico	RNANP	821.5	2.2	2.15
	RNAPL	174.3	2.19	2.21
Recuperação	RNANP	797.2	2.17	2.16
	RNAPL	300.9	2.19	2.18

Tabela 1: Conteúdo e qualidades de RNA não polissômico e polissomal. Esta tabela mostrou que os conteúdos e qualidades de RNA foram analisados. O conteúdo de RNA foi normalizado após a extração usando métodos modificados.

Discussão

Este protocolo descreve um método simples e padronizado para medir a eficiência de tradução de mudas de Arabidopsis. As etapas críticas deste protocolo são garantir a estabilidade do RNA com centrifugação secundária e extração de reagente de extração de RNA, bem como a preparação meticulosa do gradiente de sacarose. Além disso, fornecemos etapas críticas para normalizar e quantificar o RNA não polissômico e polissômico com o método de normalização spike-in. É muito importante que todos os procedimentos sejam realizados no gelo usando tampões e ferramentas livres de RNase. Além disso, garanta a preparação precisa da concentração de sacarose e minimize a agitação para reduzir seu impacto no gradiente. Em estudos anteriores 24,25,26, a pesquisa sobre respostas ao estresse tem se concentrado predominantemente em análises transcricionais e fenotípicas. Com análises de perfil de polissomos, podemos investigar ainda mais a regulação de processos translacionais em plantas sob estresse ou outros estímulos ambientais.

Compreender os processos translacionais envolve não apenas a realização de experimentos de perfil de polissomos, mas também complementá-los com experimentos de marcação de azidohomoalanina (AHA). A marcação AHA é empregada para investigar a síntese proteica e a atividade translacional²⁷. O método substitui resíduos de metionina em proteínas recém-sintetizadas por AHA, um análogo de metionina contendo um grupo azida. As células integram AHA em proteínas recém-sintetizadas durante a tradução. Posteriormente, usando técnicas baseadas em química de azida, como a química do clique, as proteínas contendo AHA podem ser marcadas e detectadas seletivamente, permitindo a análise quantitativa e a visualização de proteínas de tradução ativa²⁸. Ao combinar a marcação AHA com o perfil polissômico, os pesquisadores podem obter insights mais profundos sobre a dinâmica da síntese de proteínas nas células vegetais⁸.

Com este método de isolamento de RNA polissômico e normalização spike-in, também podemos usar o RNA extraído para análise de sequenciamento de RNA. Ao analisar o mRNA ligado ao polissomo, podemos determinar quais mRNAs estão ativamente passando por tradução. Além disso, comparar o mRNA em estado estacionário com o mRNA ligado ao polissomo nos permite identificar genes que são superexpressos no nível de tradução ou transcrição. O nível de expressão do mRNA em estado estacionário reflete a atividade transcricional, enquanto o mRNA ligado ao polissomo indica genes ativamente em tradução. A eficiência da tradução é influenciada por estímulos ambientais e modificações pós-traducionais 7,8,9,16. Portanto, este método fornece uma compreensão abrangente sobre se a proteína-alvo de interesse é efetivamente traduzida. No entanto, o limite deste método é que ainda haverá uma perda de RNA durante o procedimento de extração. A expressão relativa do RNA spike-in obtido por meio de qRT-PCR também pode resultar em pequenos erros de medição. Mais pesquisas e validação usando proteômica ou Western blot são necessárias para investigar os aspectos funcionais da proteína-alvo.

Em resumo, este protocolo representa um método simples que fornece uma abordagem direta com resultados claros para avaliar a eficiência da tradução. É importante ressaltar que sua aplicabilidade se estende além das mudas tratadas com estresse térmico para abranger mudas expostas a vários outros estímulos ambientais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo eppendorf de 1,5 mL	Labcon	3012-870-000-9	Extração de RNA
Tubo de centrífuga de 13,2 mL	Ultracentrifugação	Beckman Coulter	331372
Azul de bromofenol Honeywell		32712	Perfil de polissomo
Clorofórmio	Honeywell	32211	Extração de RNA
Cicloheximida (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Perfil polissômico
Dietil pirocarbonato (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	Extração de RNA
	Etanol Sigma-Aldrich	32221	Extração de RNA
GeneChip Eucariótico Poli-A Kit de Controle de RNA	Invitrogen	900433	Normalização
Glicerol	Honeywell	15523	Normalização
Heparina	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Perfil de polissoma
HiScript III RT SuperMix para kit qPCR	Vazyme	R323-01	Normalização
KCl	J.T.Baker	3040-01 Perfil de	polissoma
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Perfil de polissoma
MS meio basal	Phyto	M524	Cultura vegetal
Gráfico de picos Bomba de seringa	Brandel	SYN4007LS	Perfil de polissoma
Polioxietileno-10-Tridecil-Éter (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Perfil
de polissomaRNasin	Promega	N251B	Perfil de polissoma
Desoxicolato de sódio (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Perfil de polissoma
Sacarose	Sigma-Aldrich	S5391	Perfil de polissoma
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalização
TRI reagente	MRC	TR118	Extração de RNA
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Perfil de polissoma
Ultracentrífuga Beckman	Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugação
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Perfil de polissoma