É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Estabelecimento de modelos de ratos imitando terapias hormonais de afirmação de gênero

2.2K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/67470

⸱

10 de janeiro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Gender-Specific Medicine, Istituto Superiore di Sanità, 2Department of Biomedicine and Prevention, University of Rome “Tor Vergata”, 3Centre Animal Research and Walfare, Istituto Superiore di Sanità

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O protocolo descreve o desenvolvimento de dois modelos de roedores que imitam terapias hormonais de afirmação de gênero por meio da administração subcutânea de testosterona ou estradiol mais acetato de ciproterona (usado em terapias humanas para pessoas transgênero): definição das doses, identificação de biomarcadores relevantes e avaliação dos efeitos.

Resumo

Pessoas transgênero (TG) são indivíduos cuja identidade de gênero e sexo atribuídos no nascimento não correspondem. Freqüentemente, são submetidas à terapia hormonal de afirmação de gênero (GAHT), uma intervenção médica que permite a aquisição de características sexuais secundárias mais alinhadas à sua identidade de gênero individual, proporcionando resultados consistentes na melhora de inúmeras variáveis sociopsicológicas. No entanto, o GAHT tem como alvo diferentes sistemas do corpo, e alguns efeitos colaterais são registrados, embora ainda não totalmente identificados e caracterizados. Portanto, as pessoas TG submetidas ao GAHT podem ser consideradas um subgrupo suscetível da população e atenção específica deve ser dada no âmbito da avaliação de risco, por exemplo, por meio do uso de modelos animais direcionados. O presente trabalho descreve os procedimentos estabelecidos para implementar dois modelos de ratos que mimetizam o GAHT: o modelo desmasculinizante-feminizante (dMF) que imita o GAHT para mulheres TG e o modelo desfeminizante-masculinizante (dFM) que imita o GAHT para homens TG. Os modelos foram implementados através da administração dos mesmos hormônios usados para GAHT humano, ou seja, β-estradiol mais acetato de ciproterona para dMF e testosterona para dFM, pelas mesmas vias de exposição por um período de 2 semanas. Os ratos são verificados diariamente durante o tratamento para avaliar o estado de saúde e comportamentos potencialmente agressivos. No sacrifício, o sangue e os tecidos-alvo foram amostrados e armazenados para análise bioquímica, molecular e histopatológica. Parâmetros específicos do sexo, a saber, contagem de espermatozóides e dimensões do clitóris, também foram avaliados. Além disso, as isoformas do CYP450, expressas exclusiva e/ou preferencialmente no fígado de ratos machos e fêmeas, são identificadas e caracterizadas como novos biomarcadores para verificar o sucesso do GAHT e definir o modelo. O envolvimento da tireoide também tem sido explorado como um alvo chave no sistema endócrino.

Introdução

A percepção psicológica do indivíduo de ser homem, mulher, nenhum, ambos ou algo entre1 é chamada de identidade de gênero. Pode corresponder ao sexo biológico (cisgênero) ou pode ser diferente (transgênero - TG). Um homem TG é um indivíduo nascido como mulher, mas que se identifica como homem. Uma mulher TG nasce como homem, mas se identifica como mulher2. Estima-se que, atualmente, existam 25 milhões de TG em todo o mundo3, a maioria delas portadoras de disforia de gênero, condição psicológica caracterizada pela incongruência entre o gênero e o que lhes foi atribuído ao nascer4, que pode resultar em discriminação social e dificuldades no trabalho e na família, muitas vezes levando à depressão, ansiedade e estresse5. Por essas razões, as pessoas TG geralmente passam por terapia hormonal de afirmação de gênero (GAHT) e/ou cirurgia de afirmação de gênero. O GAHT para homens do GT é caracterizado pela administração de testosterona (T) (Tabela 1) e, para mulheres do GT, estrogênios (E2) mais antiandrogênios (Tabela 2)6.

O GAHT geralmente dura toda a vida do indivíduo, atuando continuamente no sistema endócrino 7,8. Portanto, é importante analisar o impacto do GAHT na saúde das pessoas TG e seus potenciais efeitos duradouros. Além disso, as pessoas TG são expostas, como a população em geral, a contaminantes químicos - em particular, os desreguladores endócrinos (DE) - que visam o sistema endócrino como o GAHT, resultando em superestimulação9.

A disfunção erétil é um grupo de substâncias químicas que afetam os organismos e/ou sua progênie, alterando diferentes processos hormonais e metabólicos, como secreção, ativação, síntese, liberação e ligação de hormônios naturais. Como a disfunção erétil é generalizada no meio ambiente, alimentos e produtos de uso diário (por exemplo, garrafas e recipientes plásticos, forros de latas metálicas de alimentos, detergentes, retardadores de chama, alimentos, brinquedos, cosméticos e pesticidas, etc.) a população em geral está continuamente exposta durante toda a vida10. Além disso, mesmo a exposição a baixas doses de DEs pode levar a danos nos tecidos e órgãos, e um fenômeno comum associado à exposição ao DE é a ocorrência de efeitos específicos do sexo em animais de laboratório e em humanos11. Como exemplo, a exposição ao material em contato com alimentos, o bisfenol A (BPA), está ligada a riscos à saúde, como endometriose e síndrome dos ovários policísticos em mulheres, bem como à redução da fertilidade, devido aos seus efeitos estrogênicos12. Nos homens, o BPA pode diminuir os níveis e diminuir a qualidade do esperma13. Além disso, os pesticidas estão associados a um maior risco de câncer de mama em mulheres e problemas significativos de fertilidade em homens13. Até o momento, não há ferramentas específicas disponíveis para estudar os efeitos toxicológicos de contaminantes ambientais, incluindo DE, em pessoas TG9.

O presente estudo tem como objetivo descrever métodos e parâmetros selecionados para o desenvolvimento de dois modelos animais TG: um modelo desmasculinizante-feminizante (dMF) e um modelo desfeminizante-masculinizante (dFM). Em particular, a seleção de níveis de dose adequados, tempo e forma de administração dos hormônios com base nas terapias humanas atuais são avaliadas14. Além disso, biomarcadores teciduais e funcionais que definem os modelos de forma única são identificados e caracterizados. Além disso, a eficácia e a tolerabilidade da terapia em animais, bem como a seleção dos marcadores mais apropriados para uso em estudos de longo prazo, são descritas em detalhes, juntamente com as técnicas usadas para tais fins.

Para caracterizar os modelos, são analisados os seguintes desfechos: nível sérico de testosterona (T) (o melhor biomarcador para avaliar o sucesso do GAHT em ambos os modelos 9,15); nível sérico de estradiol (E2) (ambos os modelos); hormônio estimulante da tireoide (TSH) e tiroxina (T4) (modelo dMF); contagem de espermatozóides (modelo dMF); dimensão do clitóris (modelo dFM); análise histopatológica dos órgãos reprodutivos, fígado e tireoide (para ambos os modelos). Além disso, a expressão gênica das seguintes isoformas do citocromo P450 hepático específico do sexo (CYP450s, para ambos os modelos) também é analisada16,17: CYP2C11 (expressa especificamente no fígado masculino), CYP3A18 (expressa 25 vezes mais no fígado masculino do que na feminina), CYP2C12 (expressa especificamente no fígado feminino) e CYP2C6 (predominantemente expressa no fígado feminino, mas presente em níveis mais baixos, também no macho).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Os estudos são realizados de acordo com a Diretiva 2010/63/UE, o Decreto Legislativo Italiano n. 26 de 4 de março de 2014 e os Princípios de Boas Práticas de Laboratório (BPL) da OCDE. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Ministério da Saúde italiano (autorização nº 806/2021-PR). Aqui, 16 ratos Sprague-Dawley jovens sexualmente maduros de ambos os sexos (304 ± ratos machos de 13 g e 190 ± ratos fêmeas de 7 g, 8-9 semanas de idade) são comprados e alojados em duas gaiolas em condições laboratoriais padrão (22 ± 0,5 ° C, 50% -60% de umidade relativa, 12 h de alternância de luz escura com 12-14 trocas de ar por hora) com água e comida disponíveis ad libitum. Em todas as gaiolas, para o enriquecimento ambiental de cada animal, insira blocos de roer madeira e substitua-os semanalmente.

NOTA: Os animais com idade entre 8 e 9 semanas foram escolhidos, uma vez que o GAHT pode se iniciar durante a adolescência (estágios 2 a 3 de Tanner), correspondendo a 8 a 9 semanas em roedores, e dura muito tempo, potencialmente por toda a vida das pessoas com TG9.

1. Dimensionamento do grupo e cuidados com os animais

  1. Utilizar ratos Sprague-Dawley adultos jovens machos e fêmeas (8-9 semanas de idade) como modelo, uma vez que o rato é a espécie preferida indicada pela OCDE (por exemplo, Diretriz 421 Teste de Rastreio de Toxicidade Reprodutiva/de Desenvolvimento) e a única espécie de roedor proposta e considerada na Diretriz 407 da OCDE (estudo de toxicidade oral de 28 dias em dose repetida em roedores, atualizado com os parâmetros para a deteção de EI).
  2. Use o software G*Power para o dimensionamento do grupo. Para os modelos dFM e dMF, selecionar quatro grupos de teste: um grupo controle (C) e três grupos de animais tratados com diferentes doses de GAHT. Faça o dimensionamento com referência à comparação entre dois grupos (dose de tratamento versus C) com o teste de Mann-Whitney, um nível de significância bicaudal alfa = 0,0167 (correspondente a alfa = 0,05 com correção de Bonferroni aplicada às 3 comparações entre cada dose de tratamento e o C) e poder 1-beta = 0,80.
    1. O número calculado de ratos/grupos é o seguinte:
      para o modelo dFM, animais/grupo n=4, de acordo com Kinnear et al.18 indicando após 2 semanas de tratamento, os seguintes níveis: no grupo controle: 0,2 ± 0,3 ng/mL, no grupo hormonioterapia: 16 ± 5 ng/mL (média ± desvio padrão), correspondendo a uma dimensão de efeito medida com o d de Cohen = 4,46 (efeito muito grande).
      para o modelo de dMF: animais/grupo n=3, de acordo com Gómez et al.19 indicando após 2 semanas de tratamento, os seguintes níveis: grupo controle: 1,901 ± 0,413 ng/mL e grupo hormonioterapia: 0,043 ± 0,023 ng/mL (média ± erro padrão) correspondendo a uma dimensão de efeito medida com o d de Cohen = 6,35 (efeito muito grande).
    2. Para alinhar os dois modelos, escolha n=4 animais por sexo/grupo, para um total de N = 32 animais.
  3. Após 1 semana de aclimatização, dividir os ratos por sexo em dois grupos experimentais (dMF e dFM, 4 ratos/grupo), cada um composto por um C (macho controle, CM e fêmea controle, FC) e três grupos de tratamento do GAHT selecionado.
  4. Monitore todos os ratos 2x ao dia (às 8h30 e 16h00) para verificar as condições gerais de saúde e a potencial agressividade devido à administração de GAHT. Registre o peso corporal (pc) e o consumo de ração 2x por semana, usando uma balança analítica com a função de pesagem dinâmica ideal para o peso dos animais de laboratório.
  5. No modelo experimental dFM, medir o diâmetro do clitóris de todos os ratos imediatamente antes do início do tratamento (ponto 0) e no final do tratamento (ponto 13), usando um medidor digital para leituras de precisão.
  6. Pesar todos os animais antes do sacrifício e, no modelo dMF, imediatamente após o sacrifício retirar o epidídimo para realizar a contagem de espermatozoides.

2. Seleção e preparação da dose

  1. Use as seguintes três doses de hormônios a serem administrados a ratos dFM: 5, 10,5 e 22,5 mg / kg por semana, para o modelo dMF, use os seguintes três níveis de dose selecionados (DL): DL1 E2 0,045 mg / kg + CPA 0,2 mg / kg, DL2 E2 0,09 mg / kg + CPA 0,2 mg / kg e DL3 E2 0,18 mg / kg + CPA 0,2 mg / kg.
    NOTA: Todas as doses são selecionadas levando-se em consideração as principais diretrizes clínicas humanas utilizadas para pessoasTG15 e os dados limitados disponíveis na literatura.
  2. Prepare todas as soluções de estoque semanalmente usando uma capa de segurança química. Misture adequadamente todas as substâncias no óleo de gergelim como veículo, garantindo sua solubilização completa.
    NOTA: Para ambos os modelos, use uma calculadora de conversão de dose (https://dosecal.cftri.res.in/) para inserir a dose a ser convertida, a espécie para a qual a dose foi definida, a espécie animal e o peso para o qual converter a dose. Para o modelo dFM (Tabela 3), terapia hormonal humana, uma dose máxima de 100 mg de T por semana20. A dose calculada em ratos é de 10,5 mg/kg de T por semana. A segunda dose é de 22,5 mg/kg por semana em ratos18. A terceira dose é de 5 mg/kg por semana, identificada pela manutenção do fator de 2,1 entre as duas doses calculadas. Para o modelo dMF, consulte a Tabela 4, as dosagens são baseadas em regimes recomendados para humanos21 e dados disponíveis por meio de estudos in vivo 14 , 19 , 22 .

3. Tratamento animal

  1. Realize a administração subcutânea de T (para o modelo dFM) e E2 mais CPA (para o modelo dMF) beliscando e levantando a pele no local da injeção, formando uma espécie de cortina. Em seguida, insira a agulha de uma seringa de 1 mL paralela ao dorso do animal. Uma vez dentro, injete lentamente o volume necessário (100 μL para T; 200 μL para E2 + CPA) 23.
    1. Trate os animais da seguinte forma: para o modelo dFM, administrar enantato de T dissolvido em óleo de gergelim (veículo) 2x/semana por 2 semanas (100 μL para cada injeção subcutânea de T). Para o modelo dMF, administrar E2 mais acetato de CPA dissolvido em óleo de gergelim (veículo) 5x/semana por 2 semanas (200 μL para cada injeção subcutânea). Trate os ratos do grupo C da mesma forma apenas com o veículo (óleo de gergelim).

4. Amostragem de sangue, sacrifício e amostragem de tecido

  1. Após 2 semanas de tratamento, pouco antes do sacrifício, use um sistema de anestesia gasosa e anestesiar todos os animais. Induza a anestesia por dose variando de 2% a 3,5% de isoflurano em oxigênio a 100% a uma taxa de 1,5 L / min até a perda dos reflexos em uma câmara de indução de poliestireno transparente. Coloque o rato em decúbito ventral na almofada de aquecimento e regule a dose de isoflurano em uma dose de manutenção variando de 1,5% a 3,5% administrada por uma máscara de nariz de rato padrão durante todo o procedimento de coleta de sangue intracardíaco.
  2. Prepare uma seringa de 5 mL com uma agulha 21G, eliminando o vácuo. Sondando o coração com os dedos, insira cuidadosamente a agulha na parede torácica lateral perpendicular ao corpo aproximadamente no ponto dos cotovelos flexionados, entre as costelas 5 e 6. Uma vez dentro do ventrículo cardíaco, o sangue entra na seringa por capilaridade. Retraia o pistão da seringa lenta e continuamente até que o sangue seja coletado.
  3. Após a coleta de sangue, coloque os ratos na câmara de CO2 para realizar a eutanásia por asfixia com CO2 com uma taxa de preenchimento de 30% a 70% de deslocamento do volume da câmara por minuto. Após 2-3 min, verifique a morte dos animais monitorando a respiração e os batimentos cardíacos24.
  4. Após o sacrifício, coloque todos os animais na mesa de dissecação em decúbito dorsal, com as patas dianteiras voltadas para cima e as traseiras voltadas para baixo, e fixe-os com alfinetes. Polvilhe o abdômen do animal com uma solução desinfetante.
  5. Extirpar os seguintes órgãos: testículos, epidídimo, útero, ovários, fígado e tireoide. Pese e armazene-os em tubos de 50 mL com 35 mL de formalina tamponada a 10% (todos os órgãos) ou solução de Bouin (apenas testículos) ou colete-os em tubos criogênicos (um órgão/tubo) e congele-os imediatamente em nitrogênio líquido (para armazenamento a -80 °C).
    1. Em primeiro lugar, corte a pele com uma tesoura na linha média, do púbis até a parte superior do abdômen. Faça dois cortes laterais na caixa torácica e reflita a pele em ambos os lados da incisão para expor as vísceras torácicas.
    2. Remova os órgãos reprodutivos primeiro; Em ratos machos, remova os testículos, órgãos pareados de forma oval localizados na cavidade abdominal, na posição intra-abdominal (saco escrotal). Corte e pressione o saco escrotal para garantir que os testículos estejam saindo e, em seguida, segure-os suavemente. Segure a gordura visceral com um alicate e corte os testículos das vísceras. Após a excisão, pesar e armazenar os testículos na solução de Bouin para análise histopatológica.
    3. Em ratos fêmeas, primeiro agarre o útero delicadamente, depois corte os ovários (que estão localizados no final de ambos os cornos uterinos) do tecido adiposo visceral. Após a excisão, pesar os ovários.
    4. Em ratos fêmeas e machos, passe para o lado direito da cavidade abdominal, onde o fígado está localizado. O fígado é um órgão multilobulado e é possível identificar muitas partes: medial esquerda (menor), lateral esquerda (maior), medial direita (menor), lateral direita (maior), caudado e lobo quadrado25. Agarre o fígado com uma pinça, tomando cuidado para não quebrá-lo. Segure o processo xifóide com um alicate e corte completamente o diafragma com uma tesoura.
    5. Use uma pinça para levantar o processo xifóide e extrair o fígado da cavidade abdominal. Separe o fígado do diafragma com uma tesoura. Depois disso, pese o fígado e guarde.
    6. Para a extração da tireoide, com a ajuda de uma tesoura, corte perpendicularmente ao longo do pescoço do animal, remova a pele e a musculatura e apare suavemente as extremidades da traqueia, na qual a glândula tireoide está localizada. Armazene a tireoide para análise posterior26.
  6. Realize a contagem de espermatozóides conforme descrito abaixo.
    1. Após a remoção do testículo, pegue o epidídimo, que está preso à margem posterior do respectivo testículo e contido no escroto.
    2. Neste experimento, amostras de sêmen são retiradas da cauda do epidídimo direito. No momento da coleta, limpe a cauda da gordura e do tecido conjuntivo com uma tesoura, separe-a da parte restante e coloque-a em uma placa de Petri (35 mm x 10 mm) contendo 1 mL de DMEM. Corte com tesoura e flua com uma pipeta Pasteur para facilitar a liberação do conteúdo.
    3. Transferir todo o líquido obtido para um tubo de 15 ml e levar o volume a 10 ml com DMEM (factor de diluição 1:10=0,1). Pipetar o conteúdo para homogeneizar e criar uma suspensão. Após uma leve agitação, pegue 10 μL da suspensão para carregar a câmara de Neubauer. Carregue a câmera e após 3 minutos de carregamento da câmera, inicie a contagem.

5. Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)

  1. Colete amostras de sangue (cerca de 2-5 mL por animal) em tubos de 2 mL e deixe-os coagular em temperatura ambiente por 1 h. Centrifugar todas as amostras de sangue numa centrífuga 2x durante 15 min a 4 °C e 3000 x g.
  2. O sangue centrifugado tem uma aparência de várias camadas com três camadas de cores diferentes. A camada superior consiste em plasma (geralmente amarelo ou transparente), a porção líquida do sangue; a camada abaixo do plasma pode ter uma coloração esbranquiçada ou cinza e é a pelagem Buffy. A camada mais baixa contém glóbulos vermelhos e a cor pode parecer vermelho escuro ou vermelho brilhante. Para determinar os níveis de hormônios sexuais, colete o soro de todas as amostras com uma pipeta (sem tocar na camada leucocitária ou nas camadas eritrocitárias), divida-as em alíquotas (500 μL) e armazene-as a -80 °C.
  3. Em ambos os modelos, realizar teste ELISA para detectar e/ou medir a presença de proteínas, anticorpos ou antígenos na amostra para a determinação de hormônios sexuais. Use o método direto e siga as instruções de cada kit ELISA. Neste estudo, os níveis séricos dos seguintes hormônios foram determinados em ratos: E2, ELISA de estradiol de rato; T, camundongo / rato testosterona Elisa; TSH, Kit ELISA de Ratos e T4, Kit ELISA de Ratos.

6. Análise histopatológica

  1. Prepare lâminas histológicas de tecidos de acordo com os seguintes procedimentos.
  2. Fixe as amostras do útero, ovário, tireoide e fígado no momento da extração em formalina tamponada a 10% por pelo menos 48 h.
    CUIDADO: Trabalhe sob uma capa química. Não inale a substância/mistura. Evite gerar vapor/aerossóis.
  3. Lavar as amostras em água corrente durante 1 h e depois conservar em álcool etílico a 80% (C2H5OH) até ao processamento, para preservar a estrutura protoplasmática das alterações resultantes da morte celular.
  4. Fixe o testículo na solução de Bouin consistindo de 15 mL de solução saturada de ácido pícrico, 5 mL de formalina concentrada (33%-40%) e 1 mL de ácido acético glacial por 48 h. Lave as amostras com álcool etílico a 80%.
    CUIDADO: Trabalhe sob uma capa química.
  5. Realize a inclusão em parafina sólida usando um processador automático de tecidos. Ao final do processo de inclusão, coloque as amostras em pequenos recipientes de metal nos quais a parafina derretida foi despejada e deixe esfriar em um prato congelado, formando os blocos para o corte. Oriente-os de acordo com a seção de corte desejada.
  6. Depois disso, corte as amostras usando um micrótomo rotativo. Colete seções de 5-6 μm usando pincéis pequenos, espalhe-as em água a 37 ° C por alguns segundos e coloque-as em lâminas de vidro do microscópio. Deixar as lâminas escorrerem perpendicularmente durante alguns minutos e secá-las na estufa a 36 °C durante pelo menos 1 h.
  7. Realize a coloração de hematoxilina e eosina conforme descrito abaixo.
    1. Desparafinize as lâminas mergulhando-as em agente de limpeza de origem terpeno (substituto do xileno) por 5 min.
    2. Reidrate as lâminas mergulhando-as na seguinte série de etanol graduado. Para cada solução, 2 min por mergulho: 100% etanol, 95% etanol, 80% etanol, 50% etanol e água destilada.
      NOTA: Pode ser um ponto de parada para o protocolo, e as lâminas podem ser deixadas em RT na água por várias horas. Opcionalmente, as lâminas também podem ser armazenadas a 4 °C em água.
    3. Coloque as lâminas na hematoxilina de Mayer por 5 min. Transfira-os imediatamente de volta para o recipiente com água da torneira por 5 min. Deixe correr água da torneira no canto traseiro do recipiente mais distante das seções. Esvazie periodicamente o recipiente até que a coloração roxa na água não esteja mais presente.
      NOTA: Para evitar que as seções se soltem dos slides, não deixe correr água diretamente nos slides.
    4. Coloque as lâminas na solução aquosa de eosina Y 1% por 2 min. Transfira as lâminas para água destilada por 15 s. Desidrate as lâminas mergulhando-as na seguinte série de etanol graduado. Para cada solução, 15 s por imersão: 50% de etanol, 80% de etanol, 95% de etanol.
    5. Coloque as lâminas em 100% de etanol por 1 min e troque por 100% de etanol fresco por mais 1 min. Coloque as lâminas em um agente de limpeza de origem terpeno (substituto de xileno) por 2 min e troque-o por um novo agente de limpeza de origem terpeno (substituto de xileno) por mais 2 min. Remova uma lâmina de cada vez e coloque uma lamínula.
    6. Cubra as seções com suporte de montagem e coloque uma lamínula na parte inferior do slide.
      NOTA: Certifique-se de que o meio de montagem puxe o slide para a posição. Se a lamínula não estiver plana, bata suavemente no lugar. Seque qualquer excesso de meio de montagem usando uma toalha de papel.
    7. Mergulhe um lenço de limpeza no agente de limpeza de origem terpeno (substituto do xileno) e limpe a parte de trás da lâmina para remover qualquer meio pingado. Coloque o slide em uma superfície sólida móvel, como um pedaço de papelão. Adicionar lamínula a todos os restantes slides, conforme descrito no passo 6.7.6. Deixe as corrediças secarem e o meio de montagem endurecer em RT no exaustor.
      CUIDADO: Trabalhe sob uma capa química.
  8. Após a coloração, cubra as amostras com uma lamínula e avalie-as usando um microscópio óptico. As alterações histopatológicas foram descritas com base na distribuição, gravidade e características morfológicas.
  9. Realizar a pontuação da lesão de forma semiquantitativa, utilizando uma escala de avaliação de 5 pontos (0 a 4), considerando a gravidade das alterações com base em critérios explicados por Shackelford et al.27 e resumidos da seguinte forma:
    Grau 0: sem alteração
    Grau 1: alteração mínima. O efeito é pouco visível no tecido; pequeno e pouco frequente. Afeta uma porção de tecido menor ou igual a 10%.
    Grau 2: mudança de luz. Representa uma pequena alteração histológica. Este grau é usado quando o tecido, ou sua estrutura, apresentou uma mudança de volume entre 11% e 20%.
    Grau 3: mudança moderada. A mudança é evidente no tecido. O grau indica a presença de variações entre 21% -40% do tecido ou de sua estrutura
    Grau 4: mudança acentuada. Alteração histológica avassaladora do tecido ou de sua estrutura. As variações afetam 41% a 100% do tecido.
  10. Realizar análises histomorfométricas quantitativas no útero, ovário, testículo e tireoide. Examine as seções de tecido usando um sistema de análise de imagem aplicado a um microscópio óptico e siga as etapas descritas abaixo.
    1. Útero: Usando uma objetiva 2x, meça a área total de cada seção transversal do corno uterino direito, o miométrio externo e interno e o lúmen uterino. Calcule a área do endométrio e do miométrio e a razão entre a área do endométrio e o miométrio28.
    2. Ovário: Use uma das seções inteiras na posição central do ovário para revelar folículos em vários estágios de desenvolvimento; conte os folículos primário, secundário, corpo lúteo, Graaf e atrésico usando uma objetiva 4x. Realize a classificação dos folículos de acordo com a Fortune29. Além disso, medir a área do ovário para cada amostra e sua densidade folicular (número de folículos/área do ovário x 100)30.
    3. Testículo: Usando a objetiva de 10x, meça 20 túbulos/amostra; Além disso, medir a área total do lúmen, a área total, o diâmetro longitudinal e o diâmetro transversal28.
    4. Tireoide: Meça os seguintes parâmetros: densidade folicular (razão entre o número de folículos e uma determinada área, objetivo de 10x); altura das células foliculares indiretas (razão média da área folicular e da área colóide em cinco folículos selecionados aleatoriamente/amostra 40x objetivo); a razão média das áreas do epitélio folicular e o número de núcleos (no mesmo folículo para determinar a maturação folicular); altura das células foliculares (média de cinco células em cinco folículos/amostra selecionados aleatoriamente, objetivo de 64x)31.

7. Expressão gênica

  1. Para ambos os modelos, realizar a análise da expressão gênica usando amostras de fígado armazenadas a -80 °C. Siga o protocolo de purificação total do RNA usando um kit, a partir de um lisado de tecido animal.
    1. Para obter o lisado hepático, triturar a amostra de tecido (10 mg) com um minipinner, adicionar 600 μL de RL BUFFER (fornecido com o kit) à amostra de tecido e continuar a triturar até que a amostra tenha sido homogeneizada.
  2. Imediatamente após a extração, quantificar o RNA obtido e avaliar sua qualidade (para desnaturação ou presença de quaisquer resíduos proteicos) usando um fluoroespectrômetro. Realizar leituras espectrofotométricas de absorbância nos comprimentos de onda de 260 nm e 280 nm, onde os ácidos nucléicos e as proteínas são absorvidos, respectivamente.
  3. Após a avaliação da concentração total de RNA, usando um Kit de Síntese de cDNA seguindo as instruções do fabricante, transcreva reversamente o volume apropriado contendo 1 μg de RNA total de cada amostra para o cDNA.
  4. Analise o cDNA obtido por RT-PCR.
    1. Para analisar as expressões gênicas de genes de interesse, primers diretos e reversos específicos foram projetados para cada gene alvo, bem como para o gene de referência expressado constitutivamente gliceraldeído fosfato desidrogenase (GAPDH). Use o aplicativo web Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) para escolher os melhores primers que garantam a especificidade do emparelhamento apenas com o gene de interesse e obter os oligonucleotídeos sintetizados por um fornecedor comercial. As sequências dos pares de primers usados são relatadas na Tabela 5.
    2. Ressuspender os primers liofilizados com água destilada livre de RNAse a uma concentração final de 100 mM. Use um kit dedicado para realizar a análise de qPCR. Efectuar as reacções num volume final de 20 μL, diluindo o cDNA recozido 1:40. Carregue cada amostra em duplicata em placas de PCR de 96 poços.
    3. Execute qPCR em termociclador seguindo este programa: 1 ciclo a 95 °C por 10 min; 40 ciclos a 95 ° C por 15 s, 58 ° C por 30 s e 72 ° C por 1 min. No final, execute um ciclo de dissociação de 55 ° C a 95 ° C (30 s / ° C) para verificar a especificidade do ampproduto lificado. Usando o software dedicado da máquina, obtenha valores de ciclo limite (Limite de Ciclo, Ct) para cada amostra. Expresse os resultados como ΔΔ Ct (delta delta Ct) de acordo com a fórmula de Pfaffl32:
      Gene alvo ΔCt = Controle de Ct - Ct tratado
      Gene de referência ΔCt = Controle de Ct - Ct tratado
      ΔCt = ΔCt Gene alvo - ΔCt Gene de referência

8. Análise dos dados

  1. Realize o gerenciamento de dados usando uma planilha. Realize análises usando software de análise estatística. Projete gráficos usando software específico.
  2. Representam o ganho de peso corporal, o consumo de ração, o peso absoluto e relativo dos órgãos, os níveis séricos hormonais, os dados morfométricos teciduais e os dados de expressão gênica como média ± desvio padrão. Realizar uma análise não paramétrica de Kruskal-Wallis, seguida de comparações post-hoc pareadas (teste de Mann-Whitney).
  3. Analise os dados histológicos usando um teste exato de Fisher de 2 vias para identificar diferenças significativas do grupo de controle, incluindo amostras atribuídas a uma categoria sem qualquer referência a gradações de gravidade (incidência total de achados). Use o teste de tendência de Cochran-Armitage para identificar a tendência dose-resposta. Considere as diferenças entre os grupos como significativas se o valor de p for < 0,05.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Conforme demonstrado por Tassinari et al.14 e por Tammaro et al.33, os resultados a seguir mostraram o sucesso do GAHT em ratos e a adequação dos modelos.

Nenhuma mortalidade ou comportamento anormal, como agressividade, é registrada, e nenhum sinal clínico de toxicidade ou sofrimento (por exemplo, diminuição da atividade, piloereção e aparência não preparada)é observado 14.

As concentrações pla...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

A implementação de modelos de roedores que imitam o GAHT é crucial para estudar a potencial suscetibilidade e vulnerabilidade específica de pessoas TG e os resultados a longo prazo das terapias, geralmente durando toda a vida.

Dado o escasso número de estudos semelhantes na literatura, o ponto crítico deste experimento é a seleção das doses para definir os modelos; Essas doses devem ser suficientemente baixas para serem compatíveis com a administração a longo ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida sem quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem criar um conflito de interesses.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Balança analítica ABJ 320-4NMKernZ741091
BouinBiooptica05-M01008
Centrífuga 5415 REppendorfPara eppendorf
Acetato de ciproteronaSigma-AldrichC3412
D-MEM médioGibco
ExcelTaq 2X Fast Q-PCR Master Mix (SYBR, ROX), 200 RXNSmobio TQ1210
Solução de formalina, tamponado neutro, 10%Sigma-AldrichHT501128
Software GraphPad Prism versão 5.0  para WindowsSoftware GraphPad Hematoxylin
Biooptica05-06002/L
HeosinBiooptica05-10007/L
Software de imagemNikonNIS-BR
Software estatístico JMP 10SAS Institute 
MicromThermo ScientificHM 325
MicroscopiaNikon Microphot FX
Mouse/Rato Testosterona ELISABiovendorRTC001R96T
NanoDrop 1000 EspectrofotômetroThermo ScientificND-1000
ParaffinaBiooptica087910
Balanças Portáteis SCOUT STX2202OHAUSbr/> 30253064
PrimersLifeDesenvolvido por PrimerBlast
Estradiol de Rato ELISABiovendorRTC009R96T
Kit ELISA de TSH de Rato (Hormônio Estimulante da Tireoide) ELKBiotechnology ELK228396T
Kit ELISA de TSH de Rato (Hormônio Estimulante da Tireoide) ELKBiotechnologyELK228396T
Kit de Síntese SensiFASTcDNABiolineBIO-6505350 reações
Óleo SesamACROSAC241000010
ratos Sprague Dawley  masculino e femininoEnvigo8/9  semanas de idade
Dietas padrãoMucedola4RF18
T4 (tiroxina) ELISA Kit ELKBiotecnologia ELK871696T
Enantato de testosteronaSigma-AldrichT3006
Thermal Cycler LineGene 9600 Plus BioerAurogene
Processador de tecidosShandon Excelsior ES, Thermo Scientific)
KIT de purificação total de RNANorgen1720050 colunas
Victor 3 Leitor multietiquetador Perkin Elmer
β-Estradiol 17-valerateSigma-AldrichE1631
< Technologies

Referências

  1. Rokach, A., Patel, K. Human sexuality: Function, dysfunction, paraphilias, and relationships. , Academic Press. (2021).
  2. American Psychological Association. Guidelines for psychological practice with transgender and gender nonconforming people. Am Psychol. 70 (9), 832-864 (2015).
  3. Ammari, T., Sluiter, E. C., Gast, K., Kuzon, W. M. Female-to-male gender-affirming chest reconstruction surgery. Aesthet Surg J. 39 (2), 150-163 (2019).
  4. Garg, G., Elshimy, G., Marwaha, R. Gender Dysphoria. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2023).
  5. Chan, A. S. W., Wu, D., Lo, I. P. Y., Ho, J. M. C., Yan, E. Diversity and inclusion: Impacts on psychological wellbeing among lesbian, gay, bisexual, transgender, and queer communities. Front Psychol. 13, 726343(2022).
  6. Unger, C. A. Hormone therapy for transgender patients. Transla Androl Urol. 5 (6), 877(2016).
  7. Sofer, Y., et al. Gender‐affirming hormone therapy effect on cortisol levels in trans males and trans females. Clin Endocrinol. 100 (2), 164-169 (2024).
  8. Pirtea, P., Ayoubi, J. M., Desmedt, S. T. ’, Sjoen, G. Ovarian, breast, and metabolic changes induced by androgen treatment in transgender men. Fertil Steril. 116 (4), 936-942 (2021).
  9. Tassinari, R., Maranghi, F. Rodent model of gender-affirming hormone therapies as specific tool for identifying susceptibility and vulnerability of transgender people and future applications for risk assessment. Int J Environ Res Public Health. 18 (23), 12640(2021).
  10. Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. J Steroid Biochem Mol Biol. 127 (3-5), 204-215 (2011).
  11. van Larebeke, N., Fucic, A. Challenges in endocrine disruptor toxicology and risk assessment. , The Royal Society of Chemistry. (2020).
  12. You, H. H., Song, G. Review of endocrine disruptors on male and female reproductive systems. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 244, 109002(2021).
  13. Sifakis, S., Androutsopoulos, V. P., Tsatsakis, A. M., Spandidos, D. A. Human exposure to endocrine disrupting chemicals: effects on the male and female reproductive systems. Environ Toxicol Pharmacol. 51, 56-70 (2017).
  14. Tassinari, R., et al. Risk assessment of transgender people: Development of rodent models mimicking gender-affirming hormone therapies and identification of sex-dimorphic liver genes as novel biomarkers of sex transition. Cells. 12 (3), 474(2023).
  15. T’Sjoen, G., Arcelus, J., Gooren, L., Klink, D. T., Tangpricha, V. Endocrinology of transgender medicine. Endo Rev. 40 (1), 97-117 (2019).
  16. Dhir, R. N., Shapiro, B. H. Interpulse growth hormone secretion in the episodic plasma profile causes the sex reversal of cytochrome P450s in senescent male rats. Proc Natl Acad Sci. 100 (25), 15224-15228 (2003).
  17. Robertson, G. R., Farrell, G. C., Liddle, C. Sexually dimorphic expression of rat CYP3A9 and CYP3A18 genes is regulated by growth hormone. Biochem Biophys Res Comm. 242 (1), 57-60 (1998).
  18. Kinnear, H., et al. A mouse model to investigate the impact of testosterone therapy on reproduction in transgender men. Human Reprod. 34 (10), 2009-2017 (2019).
  19. Gómez, Á, et al. Effects of adult male rat feminization treatments on brain morphology and metabolomic profile. Hormones Behav. 125, 104839(2020).
  20. T'Sjoen, G., et al. European society for sexual medicine position statement "Assessment and hormonal management in adolescent and adult trans people, with attention for sexual function and satisfaction". J Sex Med. 17 (4), 570-584 (2020).
  21. Coleman, E., et al. Standards of care for the health of transgender and gender diverse people, version 8. Int J Transgender Health. 23 (sup 1), S1-S259 (2022).
  22. Sudhakar, D., Huang, Z., Zietkowski, M., Powell, N., Fisher, A. R. Feminizing gender‐affirming hormone therapy for the transgender and gender diverse population: An overview of treatment modality, monitoring, and risks. Neurourol Urodynamics. 42 (5), 903-920 (2023).
  23. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Laboratory Animal Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  24. Hickman, D. L. Minimal exposure times for irreversible euthanasia with carbon dioxide in mice and rats. J Am Assoc Laboratory Animal Sci. 61 (3), 283-286 (2022).
  25. Vdoviaková, K., et al. Importance rat liver morphology and vasculature in surgical research. Med Sci Monit. 22, 4716(2016).
  26. Fiette, L., Slaoui, M. Necropsy and sampling procedures in rodents. Methods Mol Biol. 691, 39-67 (2011).
  27. Shackelford, C., Long, G., Wolf, J., Okerberg, C., Herbert, R. Qualitative and quantitative analysis of nonneoplastic lesions in toxicology studies. Toxicol Pathol. 30 (1), 93-96 (2002).
  28. Tassinari, R., et al. short-term exposure to titanium dioxide nanoparticles in Sprague-Dawley rat: focus on reproductive and endocrine systems and spleen. Nanotoxicology. 8 (6), 654-662 (2014).
  29. Fortune, J. The early stages of follicular development: activation of primordial follicles and growth of preantral follicles. Animal Reprod Sci. 78 (3-4), 135-163 (2003).
  30. Maranghi, F., et al. Effects of the food contaminant semicarbazide following oral administration in juvenile Sprague-Dawley rats. Food Chem Toxicol. 47 (2), 472-479 (2009).
  31. Rasinger, J., et al. Low dose exposure to HBCD, CB-153 or TCDD induces histopathological and hormonal effects and changes in brain protein and gene expression in juvenile female BALB/c mice. Reprod Toxicol. 80, 105-116 (2018).
  32. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45(2001).
  33. Tammaro, A., et al. Risk assessment of transgender people: implementation of a demasculinizing–feminizing rodent model including the evaluation of thyroid homeostasis. Biology Direct. 19 (1), 5(2024).
  34. Falvo, R. E., Kaltenbach, C. C., Pancoe, W. L. Determination of testosterone concentration in the plasma of normal and androgen-sterilized female rats, using a competitive protein binding technique. Neuroendocrinology. 10 (4), 229-234 (1972).
  35. Gibbs, R. B. Testosterone and estradiol produce different effects on cognitive performance in male rats. Horm Behav. 48 (3), 268-277 (2005).
  36. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: a visual demonstration. J Vis Exp. (64), e4013(2012).
  37. Cooke, P. S., Nanjappa, M. K., Ko, C., Prins, G. S., Hess, R. A. Estrogens in male physiology. Physiol Rev. 97 (3), 995-1043 (2017).
  38. Raja, N. S., Rubin, E. S., Moravek, M. B. A Review of animal models investigating the reproductive effects of gender-affirming hormone therapy. J Clin Med. 13 (4), 1183(2024).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Terapia Hormonal de Afirmação de GêneroSaúde TransgêneroAdministração de TestosteronaEstradiol Acetato de CiproteronaBiomarcadores Específicos de SexoSuscetibilidade a Produtos Químicos AmbientaisAnálise HistopatológicaContagem de EspermatozoidesGlândula Tireoide
Estabelecimento de modelos de ratos imitando terapias hormonais de afirmação de gênero
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.