Artigo de método

Modelo de biofilme agregado de fibrose cística para estudar a expressão gênica relevante para infecção

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DOI:

10.3791/67477

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18 de abril de 2025

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1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, University of Liverpool, 2Division of Molecular Microbiology, School of Life Sciences, University of Dundee

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este estudo descreve uma estrutura para o desenvolvimento de um modelo de biofilme polimicrobiano agregado e otimização de um protocolo de extração de RNA para avaliar a expressão gênica de Pseudomonas aeruginosa refletindo o ambiente pulmonar de fibrose cística. As aplicações incluem a avaliação dos efeitos antimicrobianos e o estudo de alternativas antibióticas em condições relevantes para a fibrose cística.

Resumo

Os métodos de teste pré-clínico padrão para novas terapias antimicrobianas usadas para tratar infecções pulmonares crônicas em pessoas com fibrose cística não refletem as condições ambientais do nicho pulmonar hostil. As atuais condições de teste reducionistas podem levar à progressão de compostos ao longo de um pipeline pré-clínico sem evidência de sua atividade em condições apropriadas para o nicho pulmonar de fibrose cística. Várias abordagens usadas para estudar antimicrobianos tradicionais podem não ser adequadas para alternativas antibióticas, incluindo terapias antivirulência, como agentes sensores antiquórum e inibidores de sideróforos. Este protocolo documenta um modelo de biofilme agregado de Pseudomonas aeruginosa para comparar a resistência e a expressão gênica relevante para a infecção em culturas de uma e várias espécies (Staphylococcus aureus e Candida albicans), examinando as reduções da unidade formadora de colônias (UFC) e as alterações na expressão gênica, usando algD como exemplo. O modelo foi otimizado para pequenos volumes estáticos de culturas bacterianas para permitir o estudo de novos compostos na fase de descoberta do pipeline de desenvolvimento de medicamentos, onde as quantidades de compostos podem ser limitadas. Biofilmes de P. aeruginosa de uma única espécie foram formados em meio sintético de fibrose cística 2 (SCFM2) por 24 h antes do tratamento com meropenem em diferentes concentrações (1, 16 e 256 μg/mL) por mais 24 h. Os biofilmes polimicrobianos foram estabelecidos pelo cultivo de Staphylococcus aureus e Candida albicans juntos em SCFM2, depois inoculando com P. aeruginosa por mais 24 h e tratando com meropenem. A falta de uma conexão direta entre as medidas de eficácia do composto em testes pré-clínicos e os resultados dos ensaios clínicos lançou dúvidas sobre a aplicabilidade das ferramentas atuais de triagem laboratorial. Este modelo permite compreender o impacto de fatores relevantes na expressão gênica de P. aeruginosa, incluindo genes que contribuem para a resistência e virulência, preenchendo assim essa lacuna.

Introdução

A fibrose cística (FC) é o distúrbio autossômico recessivo mais comum em populações caucasianas1. Mutações no gene Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) resultam em uma série de sintomas clínicos, incluindo a superprodução de muco no trato respiratório. O transporte iônico prejudicado resulta na desidratação dessa mucosa, como consequência da qual não é adequadamente eliminada pelo sistema mucociliar, aumentando a suscetibilidade a infecções pulmonares crônicas1. A microbiologia do pulmão da FC consiste em um grupo distinto de patógenos oportunistas, sendo Haemophilus influenzae e Staphylococcus aureus considerados organismos primários que infectam os pulmões de bebês e crianças com FC, seguido por um declínio desses organismos e subsequente colonização com Burkholderia spp., ou Pseudomonas aeruginosa durante a idade adulta1,2,3,4. Além das espécies bacterianas, os microrganismos fúngicos também são comuns no ambiente pulmonar da FC, com Candida spp e Aspergillus spp entre as espécies fúngicas mais comumente isoladas3,4,5. Embora esses organismos desempenhem papéis importantes nas infecções pulmonares por FC, avanços nas técnicas de cultura e métodos independentes de cultura mostraram que as infecções pulmonares por FC raramente se limitam a uma única espécie bacteriana, destacando assim a natureza complexa e polimicrobiana da FC lung1,6.

Apesar desse conhecimento, os métodos atuais in vitro e in vivo para o desenvolvimento e teste de antibióticos para uso em infecções pulmonares crônicas carecem de total semelhança com o nicho pulmonar da FC7, com foco na determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do fármaco contra culturas de uma única espécie. Isso fornece consideração limitada do microambiente infeccioso, que é um componente-chave da patologia pulmonar da FC8. Como tal, os métodos geralmente envolvem o crescimento de bactérias como culturas planctônicas, um estado de crescimento que provavelmente não reflete o das bactérias dentro do pulmão da FC. Isso é particularmente importante para P. aeruginosa, que normalmente se apresenta como agregados de biofilme que muitas vezes contêm adicionalmente outras espécies bacterianas e fúngicas9. Tais fatores apresentam desafios ao testar antibióticos para infecções pulmonares crônicas e destacam uma disparidade entre os métodos de teste de suscetibilidade a antibióticos e a atividade antimicrobiana no ambiente pulmonar da FC9,10. Esses desafios são exacerbados ao rastrear alternativas antibióticas, como terapêuticas antivirulência, onde os ensaios de CIM não são um indicador de atividade e não fornecem uma compreensão das interações patógeno-hospedeiro11.

O alginato, um polissacarídeo extracelular, é um componente chave dos biofilmes de P. aeruginosa no nicho pulmonar e aumenta a tolerância bacteriana a antibióticos e agentes imunológicos, além de aumentar a adesão superficial12. O alginato é um alvo atraente para o desenvolvimento de terapias antivirulência, e várias terapias direcionadas à biossíntese de alginato foram desenvolvidas, como as direcionadas ao algD, um gene chave na biossíntese de alginato13,14. Essa terapêutica pode ser usada em conjunto com terapias antibióticas em pessoas com FC para interromper os biofilmes de P. aeruginosa, convertendo bactérias em um estado planctônico. Isso aumenta a eficácia do antibiótico, pois a ruptura da matriz extracelular do biofilme permite uma maior capacidade do antibiótico de atingir o alvo bacteriano15. No entanto, apesar das evidências de atividade in vitro, a ação dessas terapêuticas dentro do nicho pulmonar da FC permanece obscura.

O modelo de biofilme agregado apresentado aqui atua para resolver esses problemas por meio da adição de S. aureus e C. albicans, que são cocolonizadores comuns com P. aeruginosa dentro do pulmão da FC. Também permite que P. aeruginosa cresça em agregados de biofilme, como visto no ambiente respiratório. O uso do meio que imita o escarro Synthetic Cystic Fibrosis Media 2 (SCFM2) como ambiente nutricional para o crescimento permite a adição de influências do hospedeiro, incluindo mucina, (e)DNA extracelular e um perfil de aminoácidos que replica o observado na FC lung16.

Para capturar ainda mais as condições do pulmão com FC, os biofilmes são expostos ao meropeném, um antibiótico frequentemente prescrito para pessoas com FC durante períodos de exacerbação pulmonar. O uso de um antibiótico dentro desse modelo é recomendado como um meio de replicar as condições clínicas nas quais um agente antivirulência pode ser prescrito, por exemplo, como uma terapia combinada associada ao tratamento com antibióticos para controlar os sintomas respiratórios durante a exacerbação. Além disso, a inclusão de meropeném permite avaliar a resposta transcricional de P. aeruginosa à exposição a antibióticos em condições relevantes para a infecção. Este modelo pode ser usado para fornecer informações sobre quais fatores seriam alvos apropriados de drogas dentro do pulmão da FC. O modelo também pode ser alterado para incluir outros antibióticos relevantes, como a tobramicina, e para avaliar a expressão de outros genes de interesse.

Aqui, este modelo polimicrobiano agregado é utilizado para avaliar os efeitos da presença de Staphylococcus aureus e Candida albicans e concentrações variáveis de meropenem (1, 16 e 256 μg/mL) na expressão de algD por P. aeruginosa. O meropeném é prescrito para tratar principalmente infecções pulmonares por P. aeruginosa e não tem efeito direto sobre S. aureus ou C. albicans, onde a CIM para ambas as espécies coabitantes é de >256 μg/mL.

Este trabalho aumentará a compreensão de como fatores relevantes, como fatores do hospedeiro dentro do SCFM2 e microrganismos cocolonizadores, podem influenciar a expressão de genes relevantes para a infecção por P. aeruginosa e fornecerá as bases para o desenvolvimento e teste de terapias antivirulência para uso em infecções respiratórias crônicas por FC.

Protocolo

1. Preparação de biofilmes de uma única espécie

  1. Reviva P. aeruginosa PAO1 de culturas de estoque de grânulos congelados, listrando um único grânulo em ágar Caldo de Lisogenia (LB) e incubando por 24 h a 37 ° C.
  2. Prepare culturas noturnas de PAO1 pegando uma única colônia da placa de estrias e adicionando-a a 5 mL de meio LB. Incubar durante a noite (18 h) e depois diluir para OD600 de 0,05 (equivalente a 1 x 108 UFC/mL) e diluir ainda mais 1:100 em SCFM2 preparado de acordo com Palmer, et al.16.
  3. Adicione 180 μL do inóculo aos alvéolos de uma placa de microtitulação de 96 poços de fundo redondo. Preparar biofilmes em triplicado biológico para enumeração por unidades formadoras de colônias (UFCs). Um total de 3 réplicas por réplica biológica são realizadas apenas para qPCR. Em 3 poços separados, adicione 180 μL de SCFM2 estéril para ser usado nos controles de mídia.
    NOTA: As placas de fundo redondo foram selecionadas em oposição às placas tradicionais de fundo plano devido à sua superioridade em permitir a exposição homogênea de todo o biofilme aos meios de crescimento circundantes17.
  4. Deixar os biofilmes formarem-se ao longo de 24 horas, incubando a 37 °C e agitando a 75 rpm.

2. Preparação de biofilmes multiespécies

  1. Reviva P. aeruginosa PAO1 e S. aureus SH1000 de culturas de estoque de grânulos congelados, conforme descrito acima. Reviva C. albicans CAF2.1 de culturas de estoque de grânulos congelados, listrando um único grânulo em ágar Saboraud dextrose e incubando por 24 h a 37 ° C.
  2. Prepare culturas noturnas de SH1000 e CAF2.1 retirando uma única colônia da placa estrial e adicionando 5 mL de LB (culturas noturnas separadas para cada organismo). Incubar durante a noite durante 18 h. Padronizar culturas noturnas de S. aureus SH1000 e C. albicans CAF2.1 em LB para valores de OD600 de 0,1, o que equivale a 1 x 109 e 1,2 x 107 UFC/mL, respectivamente17,18.
  3. Diluir o S. aureus e o C. albicans para formar um único inóculo contendo ambas as espécies nas concentrações de 1 x 106 e 1 x 105 UFC/ml, respectivamente, em SCFM2.
  4. Adicione 162 μL do inóculo aos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços. Inocular biofilmes em triplicado biológico para enumeração por unidades formadoras de colônias (UFCs). Um total de 3 réplicas por réplica biológica são realizadas apenas para qPCR. Para 3 poços separados, adicione 180 μL de SCFM2 estéril para ser usado para os controles de mídia.
  5. Deixar os biofilmes formarem-se durante 24 h, incubando a 37 °C e agitando a 75 rpm.
  6. Prepare uma cultura noturna de PAO1 pegando uma única colônia da placa de estria e adicionando-a a 5 mL de meio LB. Incubar durante a noite (18 h), depois adicionar a OD600 de 0,05 (equivalente a 1 x 108 UFC / mL) e diluir ainda mais para 1 x 105 UFC / mL em SCFM2.
  7. Adicionar 14,2 μL do inóculo PAO1 aos poços da placa de microtitulação de 96 poços, resultando no inóculo final do PAO1 sendo 1 x 104 UFC/mL.
    NOTA: Esta variação na concentração do inoculado entre as diferentes espécies é para garantir que o S. aureus e o C. albicans não sejam superados pelo P. aeruginosa e todos sejam recuperáveis por plaqueamento pontual do biofilme de 24 horas, onde não há antibióticos.
  8. Deixar que os biofilmes polimicrobianos se formem ao longo de 24 horas, incubando a 37 °C e agitando a 75 rpm.

3. DNase e tratamento antibiótico de biofilmes de uma e várias espécies

  1. Adicionar 2 μL de DNase I diretamente aos alvéolos contendo os biofilmes na concentração final de 50 μg/mL, incubar por 1 h a 37 °C e agitar a 75 rpm.
    NOTA: Isso é adicionado para diluir os biofilmes viscosos para permitir uma melhor penetração dos antimicrobianos, refletindo a dosagem de rhDNase (DNase humana recombinante) que é tomada por muitas pessoas com fibrose cística como estratégia de tratamento para exacerbações pulmonares.
  2. Prepare um estoque de antibióticos de meropenem a 2,56 mg / mL, usando água destilada como diluente. Diluir em série por um fator de 2 para atingir concentrações de 0,01 mg / mL - 2,56 mg / mL.
  3. Adicione 20 μL de cada diluição de meropeném aos biofilmes para atingir uma faixa de dosagem de 1 μg / mL - 256 μg / mL. Adicione 20 μL de água destilada aos biofilmes de controle negativo no lugar do antibiótico.
  4. Selar a placa de microtitulação de 96 poços com película transparente e incubar a 37 °C durante 24 h, agitando a 75 rpm.

4. Enumeração de células viáveis e atividade metabólica

NOTA: As etapas a seguir são apenas para os biofilmes destinados à quantificação de UFC.

  1. Adicione 10 μL de celulase (100 mg / mL, tampão citrato 0,05 M) aos biofilmes e incube a 37 ° C por 1 h, agitando a 140 rpm. A celulase é usada regularmente para romper os esqueletos de celulose dentro de biofilmes19,20,21. Interrompa ainda mais os biofilmes pipetando para cima e para baixo, se necessário, até que não haja aglomerados visíveis.
  2. Adicionar 10 μL de solução de resazurina a 0,02% para avaliar a atividade metabólica dos biofilmes de teste e dos biofilmes de controle e incubar a 37 °C por 1 h, agitando a 140 rpm.
  3. Meça a fluorescência de cada poço usando um comprimento de onda de excitação de 540 nm e um comprimento de onda de emissão de 590 nm no leitor de microplacas.
  4. Corrija a fluorescência de fundo subtraindo os valores de fluorescência das amostras de meios em branco e calcule a percentagem de redução como (média dosbiofilmes F tratados com antibióticos/média do controlo F negativo) x 100 %.
  5. Enumerar o conteúdo dos alvéolos, contendo tanto os biofilmes desfeitos como as células planctónicas, diluindo-se em série e plaqueando-se em ágar selectivo da seguinte forma:
    Ágar seletivo de Pseudomonas suplementado com glicerol a 1% e suplemento de CN para enumeração de P. aeruginosa
    Ágar sal manitol para a enumeração de S. aureus|
    Ágar Levedura Peptona Dextrose suplementada com penicilina (250 U/mL), estreptomicina (250 μg/mL, sulfato de gentamicina (30 μg/mL) e vancomicina (3 μg/mL) para a enumeração de C. albicans.
    NOTA: Todo o conteúdo dos poços é enumerado devido aos desafios de separar o biofilme agregado flutuante das células planctônicas. No entanto, essa abordagem reflete com mais precisão as condições presentes no pulmão com fibrose cística. Pode haver condensação na tampa após a incubação. Para garantir que não haja contaminação entre os poços, coloque os controles estéreis em ágar seletivo.
  6. Após a colocação no ágar selectivo, incubar as placas durante 24 h a 37 °C antes da recenseamento.

5. Preparação de biofilmes para extração de RNA

NOTA: Todas as etapas a partir deste ponto são apenas para biofilmes destinados à análise RT-qPCR.

  1. Remova a placa de microtitulação de 96 poços contendo os biofilmes da incubadora a 37 ° C e transfira-os para um tubo de microcentrífuga de 1 mL. Ao transferir, certifique-se de que as réplicas de biofilme sejam agrupadas para cada repetição biológica realizada. Isso garante que haja biomassa suficiente para a extração de RNA.
  2. Centrifugue os tubos de 1,5 mL contendo os biofilmes a 16.000 x g por 5 min. Se realizar a extração de RNA no mesmo dia, prossiga para a etapa 6.2.1. Se a extracção do ARN não for efectuada no mesmo dia, retirar o sobrenadante e conservar o sedimento em 250 μL de solução de estabilização do ARN a -20 °C. Esta solução tem sido usada para armazenar pellets bacterianos em vários estudos22,23.

6. Extração de RNA

  1. Extraia biofilmes de RNA bacteriano de uma e várias espécies usando um kit comercial. Prepare os tampões conforme as instruções das diretrizes do fabricante.
  2. Remova o sobrenadante do meio de cultura e descarte-o. Se o pellet foi armazenado em uma solução de estabilização, descongele-o à temperatura ambiente e centrifugue a 16.000 x g por 5 min. Ressuspenda o pellet em 600 μL de reagente de extração de RNA e, em seguida, interrompa-o manualmente usando uma agulha de 0,2 mm conectada a uma seringa de 2 mL (aspire 5x-10x ou até que o pellet esteja completamente interrompido).
  3. Execute as etapas de purificação do RNA conforme as instruções das diretrizes do fabricante.
  4. Quantifique o RNA usando um espectroscópio UV, um kit de ensaio RNA BR e tubos. Os limites detectáveis de RNA usando o kit de ensaio são de 10 a 1200 ng/μL, portanto, o rendimento mínimo aceitável de RNA para este protocolo é de 10 ng/μL.
    1. Configure o número necessário de tubos para amostras e padrões (são necessários 2 padrões).
    2. Preparar a solução de trabalho adicionando 199 μL de tampão e 1 μl de reagente por número de amostras (+ 2 padrões e 2 para erro).
    3. Adicione 190 μL de solução de trabalho e 10 μL de Padrão 1 e Padrão 2 em tubos separados.
    4. Adicione 199 μL de solução de trabalho e 1 μL de amostra de RNA em tubos separados. Vortex por 30 s e depois armazene em local escuro por 5 min.
    5. No fluorômetro, selecione RNA > RNA de ampla faixa e siga as instruções.
    6. Avaliar a qualidade do RNA usando um espectrofotômetro. Anular o espectrofotómetro pipetando 1 μL de água isenta de DNase/RNase no espectrofotómetro. Limpe a água com um pano sem fiapos e ajuste a proporção de absorbância para 260/280 nM. Pipetar 1 μL de RNA para o espectrofotómetro. Se o RNA for puro, um único pico será observado entre 260 e 280 nM, e uma proporção de ~ 2,0 será mostrada.
  5. Converta o RNA extraído em DNA complementar (cDNA) usando um kit de síntese de cDNA. Para qualquer amostra de RNA que exceda 50 ng/μL, primeiro dilua para 50 ng/μL usando água livre de DNase/RNase.
    1. Usando tubos, prepare a mistura de reação de cDNA de acordo com a Tabela 1.
    2. Coloque os tubos em um termociclador usando as seguintes condições: 25 ° C por 5 min, 42 ° C por 30 min, 85 ° C por 5 min. Use o cDNA imediatamente ou armazene-o congelado a -20 ° C.

7. qPCR

  1. Execute o qPCR usando um qPCR Master Mix. Use os seguintes primers algD e do gene de manutenção (16S) (Tabela 2).
    NOTA: Os primers foram projetados usando a ferramenta online NCBI-primer Blast com referência a toda a sequência do genoma de P. aeruginosa e, em seguida, sintetizados por meio de um fornecedor comercial. Os primers foram validados quanto à especificidade nos biofilmes polimicrobianos por meio de correspondência de sequência usando a ferramenta NCBI-primer Blast.
  2. Diluir os primers a 4 μM (4 pm / μL) diluindo 20 μL de primer em 480 μL de água livre de DNase / RNase. Estes podem ser congelados para vários usos.
  3. Preparar a solução de trabalho da master mix de qPCR de acordo com as instruções da Tabela 3.
    NOTA: A solução de trabalho algD contém solução suficiente para 3x repetições biológicas e 3x repetições técnicas por concentração de meropenem, 6x controles negativos e 2x erro. As soluções de trabalho 16S contêm solução suficiente para 2x padrões de concentração de RNA conhecida e 2x erro.
  4. Adicione 18 μL de solução de trabalho algD aos tubos de reação qPCR apropriados. Isso incluirá um total de 36 tubos para análise de expressão de algD e 6 tubos para controles negativos.
  5. Adicione 2 μL de RNA a cada um dos tubos de reação qPCR ou 2 μL de água livre de DNase / RNase aos controles negativos.
  6. Adicione 18 μL de solução de trabalho 16S aos tubos de reação qPCR apropriados. Isso incluirá um total de 2 tubos. Adicione 2 μL de RNA de concentração conhecida aos tubos de reação qPCR.
  7. Realize a qPCR de acordo com as seguintes condições: 2 min a 95 °C, 15 s a 95 °C (40 ciclos), 1 min a 60 °C.
  8. Analise os resultados de qPCR usando o método 2-ΔΔCt, conforme descrito anteriormente24. Ao analisar a expressão de algD, use a expressão de algD a 0 μg/mL como controle para as respectivas composições de biofilme e considere a expressão de mudança de dobra relevante para culturas não tratadas

Resultados

Os resultados mostrados na Figura 1A destacam a resiliência dos biofilmes de Pseudomonas monoespecíficos quando submetidos ao tratamento com meropenem, já que nenhuma diminuição significativa foi observada em nenhuma das doses testadas. O controle negativo, que não foi exposto ao meropenem, apresentou uma recuperação de 8,31 ± 0,07 Log10CFU/mL, enquanto a maior redução de células viáveis ocorreu em 16 µg/mL, resultando em uma recuperação de 8,06 ± 0,10 Log10CFU/mL. No entanto, esse nível de resistência é esperado, pois a literatura mostra que os biofilmes de P. aeruginosa são muito mais resistentes ao meropenem do que suas contrapartes planctônicas, necessitando de uma concentração >256 µg/mL para ser bactericida contra os biofilmes25,26, em comparação com as células planctônicas, que possuem uma MIC de 2 µg/mL.

Figura 1B mostra a porcentagem média de redução na atividade metabólica dos biofilmes monoculturais de P. aeruginosa em cada concentração de antibiótico em comparação com o biofilme controle, que não foi exposto à meropenema. Uma redução na fluorescência traduz-se em menor atividade metabólica, considerada um indicador indireto da redução no número de células viáveis. Os cultivos tratados com meropenema apresentaram aumento da atividade metabólica (indicado por uma redução percentual negativa), o que indica ausência (ou muito limitada) de atividade bactericida.

A atividade metabólica aumentada sem recuperação aumentada de UFC pode indicar a resposta metabólica das bactérias à exposição ao antibiótico. Entre os biofilmes de espécie única e os biofilmes multiespécies (Figura 2), o crescimento geral de P. aeruginosa diferiu apenas ligeiramente, sendo a recuperação de células viáveis do biofilme de espécie única 0,74 ± 0,17 Log10CFU/mL maior do que a observada no biofilme polimicrobiano na ausência de antibiótico. S. aureus foi recuperado do biofilme polimicrobiano em 6,95 ± 0,11 Log10CFU/mL, e C. albicans foi recuperado em 1,66 ± 2,88 Log10CFU/mL. C. albicans, no entanto, está presente apenas nos locais onde não foi adicionado meropenem e não foi recuperado de nenhum biofilme onde o antibiótico foi administrado. Como o meropenem não tem efeito direto sobre Candida, o que já foi demonstrado em ensaios anteriores de CMI realizados em laboratório com culturas monoculturais de C. albicans, onde o valor de CMI do meropenem foi >256 µg/mL, é provável que seja a resposta ao estresse bacteriano das outras espécies conviventes, S. aureus e P. aeruginosa, à exposição ao antibiótico que resulta em condições hostis para o fungo.

Como os biofilmes de P. aeruginosa, tanto em monocultura quanto com patógenos co-colonizadores, não apresentam redução na recuperação de células viáveis em concentrações de meropenem até 256 µg/mL, isso destaca a necessidade de terapias alternativas, como terapias anti-virulência, para combater essas infecções crônicas na clínica, as quais podem atuar em conjunto com antimicrobianos para reduzir efetivamente a carga bacteriana.

algD expressão em biofilmes de espécie única de P. aeruginosa PAO1
A expressão de algD em P. aeruginosa PAO1 exposta a diferentes concentrações de meropenem (1, 16 e 256 µg/mL) cultivada em SCFM2 foi avaliada utilizando RT-qPCR com SYBR-Green. A expressão foi então analisada pelo método 2-ΔΔCt, utilizando 16S como gene controle (Figura 3). A expressão de algD não diferiu significativamente entre as concentrações de meropenem utilizadas, sugerindo que, quando cultivada como biofilme de espécie única, a expressão de algD em PAO1 não é fortemente afetada pela presença de meropenem.

algD expressão em biofilmes multiespecíficos de P. aeruginosa PAO1
A expressão de algD também foi avaliada em P. aeruginosa PAO1 cultivada em biofilmes constituídos por S. aureus SH100 e C. albicans CAF2.1, para verificar se a presença de organismos co-colonizadores influenciava a expressão de algD ou a resposta à meropenema em PAO1. Nenhuma diferença significativa na expressão de algD foi observada entre as concentrações de 0-16 µg/mL de meropenem. No entanto, em 256 µg/mL, a expressão de algD foi significativamente maior em comparação com as outras concentrações do antibiótico (0 µg/mL versus 256 µg/mL, p = 0,0075; 1 µg/mL versus 256 µg/mL, p = 0,035; 16 µg/mL versus 256 µg/mL, p = 0,0048), sendo aproximadamente 7 vezes maior do que na condição controle (Figura 4). Isso destaca que, quando cultivada na presença de S. aureus e C. albicans, há um aumento na expressão de algD na concentração mais elevada de meropenem, em comparação com quando P. aeruginosa é cultivada isoladamente, sugerindo um aumento na produção de alginato no contexto polimicrobiano. Apesar de demonstrar diferenças na expressão de algD entre biofilmes monoespecíficos e multiespecíficos, não está claro se esse aumento na expressão é induzido pela presença de uma espécie específica (S. aureus ou C. albicans) ou se interações envolvendo ambos os microrganismos estão promovendo essa alteração na expressão gênica.

Esses resultados destacam a importância de compreender o impacto de terapêuticas e do ambiente sobre a expressão gênica, particularmente no contexto de testes futuros de terapêuticas direcionadas à virulência.

Gráficos de barras de inibição do crescimento bacteriano para P. aeruginosa, S. aureus e C. albicans em função da concentração.
Figura 1: Biofilmes de espécie única constituídos por Pseudomonas aeruginosa PAO1. Os biofilmes foram cultivados por 24 h em SCFM2, tratados com 50 µg/mL de DNase I por 1 h e, posteriormente, tratados com meropenem em diversas concentrações por mais 24 h. (A) Média de Log10CFU/mL. A linha tracejada indica uma redução de 2 log (equivalente a 99 % de redução) na recuperação de P. aeruginosa em relação ao controle negativo. (B) Porcentagem de redução nas unidades de fluorescência relativa. A linha tracejada indica uma redução de 50% na fluorescência, sendo o primeiro ponto acima desse valor considerado o valor de MIC50. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Concentração de meropenema versus crescimento bacteriano (A) e redução da fluorescência (B) em gráficos.
Figura 2: Biofilmes multiespécies constituídos por Pseudomonas aeruginosa PAO1, Staphylococcus aureus SH1000 e Candida albicans CAF2.1. Os biofilmes foram cultivados por 24 h em SCFM2, tratados com 50 µg/mL de DNase I por 1 h e tratados com meropenema em várias concentrações por mais 24 h. A linha tracejada indica uma redução de 2 log (equivalente a 99 % de redução) na recuperação de P. aeruginosa em relação ao controle negativo. A significância foi determinada por ANOVA de dois fatores, onde **** p < 0,0001. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráfico de barras da expressão relativa versus concentração (µg/ml), mostrando o resultado da análise estatística (ns).
Figura 3: Expressão de algD extraída de culturas puras de P. aeruginosa PAO1. Os biofilmes foram cultivados por 24 h em SCFM2, tratados com 50 µg/mL de DNase I por 1 h e expostos a concentrações variáveis de meropenem (0, 1, 16, 256 µg/mL). A expressão gênica foi analisada utilizando o método 2-ΔΔCt. O gene de referência 16S foi utilizado na análise. A significância foi determinada pelo teste de comparação múltipla de Tukey. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráfico de barras da expressão relativa versus concentração; significância estatística; análise de expressão gênica.
Figura 4: Expressão de algD extraída de biofilmes multiespécies constituídos por P. aeruginosa PAO1, S. aureus SH1000 e C. albicans CAF2.1. Os biofilmes foram cultivados em SCFM2, tratados com 50 µg/mL de DNase I por 1 h e tratados com meropenem em várias concentrações (0, 1, 16, 256 µg/mL) por mais 24 h. A expressão gênica foi analisada utilizando o método 2-ΔΔCt. O gene de referência 16S foi utilizado na análise. **p < 0,01 determinado pelo teste de comparação múltipla de Tukey. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Volume por reação de cDNA (μL)
5X iscript Reaction mix4
iscript Reverse Transcriptase1
Água livre de DNase/RNase14
2,5 ng de RNA1
Volume total da reação20

Tabela 1: Soluções de trabalho da mistura mestra de cDNA. Componentes e volumes necessários por reação de cDNA.

GenePrimer sentidoPrimer antissentido
algDCGCCGAGATGATCAAGTACATGTAGTAGCGCGACAGGTTG
16SACCGCATACGTCCTACGGCGAAGACCTTCTTCACACACG

Tabela 2: algD e 16S primers direto e reverso de qPCR

Volume por reação (µL)Volume de trabalho de algD (µL)Volume de trabalho de 16S (µL)
GoTaq qPCR Master Mix (2X)1044040
Primer direto1444
Primer reverso1444
Água livre de DNase/RNase626424
Total 1879272

Tabela 3: Soluções de trabalho da mistura mestra de qPCR. Componentes e volumes necessários para as soluções da mistura mestra de qPCR de algD e 16S.

Figura Suplementar 1: Biofilmes multiespécies constituídos por Pseudomonas aeruginosa LESB58, Staphylococcus aureus SH1000 e Candida albicans CAF2.1. Os biofilmes foram cultivados durante 24 h (n = 3) em SCFM2, tratados com 50 µg/mL de DNase I por 1 h e, posteriormente, tratados com meropenem em diversas concentrações por mais 24 h. A linha tracejada indica uma redução de 2 log (equivalente a 99% de redução) na recuperação de P. aeruginosa em relação ao controle negativo. A análise estatística foi realizada por ANOVA de dois fatores. *p=0.0242, ** p=0.0013, **** p <0.0001. Clique aqui para baixar esta figura.

Discussão

Esses resultados mostram que, apesar de seu uso frequente no manejo de exacerbações pulmonares em pessoas com FC, o meropeném não influenciou significativamente o crescimento de P. aeruginosa no modelo de biofilme de uma ou várias espécies. Um ligeiro aumento na recuperação de P. aeruginosa foi observado em ambos os modelos após o tratamento com 128 μg/mL e 256 μg/mL de meropenem, como também observado para S. aureus no biofilme multiespécie; no entanto, esses aumentos foram insignificantes. A diminuição de C. albicans quando submetida ao meropenem pode ser devido a condições hostis para o fungo ser criado pela bactéria em resposta ao estresse do antimicrobiano. Não foram observadas diferenças significativas na expressão de algD entre as concentrações de meropenem quando P. aeruginosa foi cultivada como um biofilme de uma única espécie. No entanto, a expressão de algD foi significativamente maior em biofilmes multiespécies quando tratados com 256 μg/mL de meropeném, sugerindo que a produção de alginato pode ser aumentada nessas condições. As diferenças na expressão de algD observadas entre as composições de biofilme e as concentrações de meropeném mostram como a presença de fatores relevantes pode influenciar a expressão gênica relevante para a infecção e destaca a importância de considerar o uso de antimicrobianos e o status de infecção polimicrobiana ao desenvolver e testar alternativas antibióticas.

Apesar da utilidade dos modelos, existem várias considerações para garantir uma aplicação bem-sucedida. O estabelecimento de S. aureus e C. albicans dentro dos biofilmes é essencial antes da infecção por P. aeruginosa, devido aos riscos de S. aureus e C. albicans serem superados pelo Gram negativo. Neste modelo de biofilme, C. albicans parece ser um parceiro ruim devido às suas taxas de sobrevivência significativamente mais baixas em comparação com S. aureus e P. aeruginosa, mesmo na ausência de antibióticos. Isso sugere que a levedura é superada por recursos ou é impactada negativamente por interações interespécies dentro do biofilme 27,28. A ausência de C. albicans na presença de meropeném, apesar de o antibiótico não ter atividade antifúngica direta, sustenta a ideia de que a resposta ao estresse de S. aureus ao meropeném pode criar um ambiente inóspito para C. albicans29,30. No entanto, é importante notar que a escolha da cepa pode afetar a quantidade de C. albicans que pode ser recuperada do modelo de biofilme polimicrobiano. Diferentes tendências são observadas ao usar P. aeruginosa LESB58 em vez de PAO1 (Figura Suplementar 1). Com LESB58, C. albicans é recuperável em todas as concentrações de meropenem e, na verdade, mostra um ligeiro aumento à medida que a concentração de P. aeruginosa diminui como resultado do antimicrobiano, permitindo que a composição da comunidade mude. No entanto, apesar dessas diferenças, a PAO1 é utilizada neste modelo por ser uma cepa de referência laboratorial, o que fornece uma linha de base consistente e bem caracterizada para estudos comparativos. Essa consistência é crucial para a reprodutibilidade e para tirar conclusões confiáveis sobre as interações dentro do biofilme.

Pode ser um desafio extrair grandes quantidades de RNA de bactérias cultivadas em SCFM2, devido à natureza viscosa do meio. Portanto, a ruptura do biofilme com agulhas de 0,2 mm antes da extração do RNA é um passo importante para aumentar o rendimento do RNA e garantir que concentrações suficientes (≥10 ng/μL) sejam extraídas para RT-qPCR. O RNA é altamente suscetível à degradação31, portanto, após a extração, certifique-se de que todas as atividades a jusante que usam RNA sejam realizadas no gelo. O congelamento regular de primers de RNA, cDNA e qPCR pode aumentar a probabilidade de degradação do produto. Portanto, deve ser limitado o máximo possível. Outro desafio comum na aplicação desses modelos é o risco de contaminação durante a extração de RNA ou ensaio de qPCR. Esse risco pode ser minimizado pulverizando o equipamento com solução de degradação de DNA antes da extração do RNA e usando pontas de pipeta sem DNase/RNase durante todo o procedimento. A substituição regular de água livre de DNase/RNase também ajudará a reduzir o risco de contaminação no ensaio de qPCR.

Este protocolo optou por focar no algD como o gene de interesse devido à sua necessidade na produção de alginato, que é descrito como um fator chave de virulência de P. aeruginosa durante infecções agudas e crônicas32. Assim, o alginato está sendo cada vez mais estudado como alvo para terapêuticas antivirulência33,34. Embora este modelo tenha sido usado para avaliar a expressão de algD, ele pode ser aplicado para avaliar a expressão de outros genes de P. aeruginosa para diferentes alvos de drogas anti-virulência. O meropeném foi utilizado neste estudo devido a evidências que sugerem que o antibiótico influencia a expressão de genes de biossíntese de alginato, particularmente quando P. aeruginosa é cultivada na presença de C. albicans35. Além disso, o meropeném é frequentemente prescrito clinicamente para tratar e controlar infecções respiratórias por P. aeruginosa, destacando seu emprego relevante dentro desse modelo36. No entanto, a adição de diferentes antibióticos, ou mesmo tratamentos duplos, também é possível com esses modelos. A incorporação de antibióticos dentro deste modelo também permitiria que este modelo fosse usado para estudar mudanças evolutivas nos mecanismos de resistência bacteriana, como o desenvolvimento de resistência mediada por porinas por P. aeruginosa aos carbapenêmicos37. Este modelo de biofilme polimicrobiano pode ser adaptado para incluir outras espécies relevantes, por exemplo, bactérias comensais, como Rothia sp. e Streptococcus sp., ou substituído por outros micróbios causadores de infecções, como Aspergillus sp., para refletir os requisitos do candidato a medicamento que está sendo examinado.

Modelos de biofilme polimicrobiano que mimetizam o pulmão da FC foram desenvolvidos anteriormente38. O modelo descrito aqui baseia-se em trabalhos anteriores com o objetivo de aumentar o rendimento usando uma configuração passível de culturas microbianas de pequeno volume. Isso é vantajoso para testar novos compostos onde o material disponível pode ser limitado. Como o modelo é de pequena escala e estático, é possível cultivar os biofilmes em diferentes disponibilidades de oxigênio para refletir mais de perto o ambiente microaerofílico nos pulmões39,40. Para facilitar a reprodutibilidade e por razões de custo-efetividade, os biofilmes relatados neste estudo foram cultivados aeróbicos.

Apesar dos valiosos insights obtidos com este estudo, várias limitações devem ser reconhecidas. Em primeiro lugar, a ausência de células hospedeiras limita sua utilidade para o estudo de fatores de virulência que possuem um alvo celular direto em mamíferos. Isso descreve os desafios de estabelecer modelos in vitro adequados para o estudo de fatores de virulência e destaca a necessidade de desenvolvimento adicional de modelos que reproduzam o ambiente hostil de infecções crônicas. Além disso, embora considerado um fator de virulência, o alginato é uma característica fundamental dos biofilmes e é produzido por P. aeruginosa tanto em laboratório quanto no meio ambiente. O uso de modelos in vitro para estudar agentes antibiofilme pode ser menos desafiador do que o uso de modelos para estudar outras terapias antivirulência, como agentes antiexotoxinas, onde o alvo tem ação direta nas células eucarióticas41.

Embora a escolha da cepa de P. aeruginosa de PAO1 seja adequada para reprodutibilidade e padronização do modelo in vitro , pode ser desejável incluir isolados de infecção crônica. Experimentos futuros usando este modelo com uma cepa isolada de amostras de pacientes devem ser realizados para observar o efeito dos antimicrobianos em cepas adaptadas ao nicho respiratório.

O uso de SCFM2 como imitador de escarro neste modelo in vitro permite a observação padronizada e replicável das alterações comportamentais de biofilmes agregados cultivados em um ambiente relevante para as vias aéreas durante o tratamento com antibióticos. O SCFM2 foi selecionado em vez da versão original do SCFM devido à inclusão de DNA extracelular (eDNA) e mucina, que são fatores importantes no suporte à formação de biofilmes. No entanto, é importante observar que outras variantes do meio sintético de escarro também estão disponíveis, como SCFM3, que contém ácido p-aminobenzóico, NAD+, adenina, guanina, xantina e hipoxantina42, e SCFM4, que é uma versão deficiente em ferro. Além disso, o uso de meios sintéticos de escarro, como fibrose cística pulmonar média (CFLM) e fibrose cística sinusal média (CFSM), desenvolvidos por Ruhluel e colegas43, permitiria a compartimentalização das vias aéreas para visualizar o comportamento e o efeito da terapêutica antivirulência em biofilmes polimicrobianos em diferentes ambientes.

Embora o AlgD seja uma enzima chave na via biossintética do alginato, seu nível de expressão por si só não deve ser tomado como uma indicação da produção de alginato. Outros fatores, como modificações pós-transcricionais e pós-traducionais, bem como mecanismos regulatórios, podem influenciar a quantidade de alginato produzida, levando à redução da formação de biofilme, aumento da suscetibilidade ao estresse ambiental e aumento da sensibilidade aos antibióticos onde a produção de alginato é reduzida12,14. Existem várias terapias antivirulência em desenvolvimento que visam a proteína alginato, onde este modelo não seria apropriado para determinar sua eficácia e onde seria mais benéfico medir diretamente a produção de alginato ou uma leitura funcional44. Além disso, algumas terapias antivirulência podem ter como alvo diferentes estágios da biossíntese ou regulação do alginato, portanto, medir a produção de alginato captura diretamente o efeito líquido da terapia no fator de virulência44. No entanto, várias das terapias antivirulência em estudos atuais têm como alvo os principais genes do alginato, e modelos de expressão gênica como esses seriam apropriados para estudar os efeitos de tais terapias13,14. Técnicas como essa também podem ser facilmente adaptadas para triagem de alto rendimento, permitindo a avaliação rápida de várias amostras ou condições, o que é benéfico em estudos em larga escala envolvendo triagem inicial de potenciais compostos antivirulência.

No geral, os modelos de biofilme de uma única e várias espécies representam ferramentas valiosas para estudar a expressão de genes relevantes para a infecção de P. aeruginosa em condições apropriadas para FC. O lançamento em larga escala da terapia moduladora revolucionou o cenário dos cuidados de saúde para FC. No entanto, apesar da variedade de benefícios clínicos dos moduladores da FC, estudos têm mostrado que linhagens clonais de Pseudomonas ainda estãocirculando, destacando que novas terapias para o manejo de infecções pulmonares por P. aeruginosa ainda são necessárias45,46. Apesar das limitações discutidas, a aplicação desses modelos pode ser útil na fase de descoberta do pipeline de desenvolvimento de medicamentos para avaliar a eficácia de compostos dentro do nicho pulmonar da FC e as interações de novos compostos antivirulência com antibióticos conhecidos nesse ambiente.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

HL, DN e JF receberam apoio financeiro para o Centro de Pesquisa Estratégica (SRC) Uma estrutura pré-clínica baseada em evidências para o desenvolvimento de terapêutica antimicrobiana na fibrose cística (PIPE-CF; Projeto nº. SRC 022) do UK Cystic Fibrosis Trust e da US Cystic Fibrosis Foundation. O TH é apoiado por uma bolsa de estudos de doutorado da MRC Discovery Medicine North Doctoral Training Partnership. Agradecemos o financiamento ao CF Trust e à CF Foundation (SRC022) e ao esquema MRC DiMEN DTP

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Membrana de vedação respirável para placas multipoços Sigma Aldrich 
Bico de
Celulase (100 mg/mL)Cambridge Bioscience Suplemento CN HY-B2220-5g
 Sigma Aldrich 1.07624
Kit Miniprep de RNA Direct-zolZymo ResearchR2050
Dnase I Thermo Fisher ScientificEN0521
Água livre de DNase/RnaseVWRJ60610.
XC Gentamycin Sulfato (30 µ g/mL)Sigma Aldrich G3632
Glicerol (1 %)Thermo Fisher Scientific15514029
GoTaq qPCR Master Mix Promega Kit de Síntese de Cdna iScript A6101
 Bio-Rad1708890
Penicilina (250 U/mL)Suprimentos de Laboratório CientíficoP3032-10MU
Qubit 4 FluorômetroThermo Fisher ScientificQ33238
Qubit RNA BR Kit de Ensaio Thermo Fisher ScientificQ10210
Tubos de qubitThermo Fisher ScientificQ32856
Solução de resazurina (0,02%)Thermo Fisher ScientificR12204
RNAlater SolnInvitrogenAM7021
Estreptomicina (250 µ g/mL)Sigma Aldrich Termociclador S9137
(usamos o Termociclador T100)Biorad1861096
TRIzol Reagent Invitrogen15596026
Vancomicina (3 µ g/mL)Sigma Aldrich 
Z763624Bunsen1709007

Referências

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