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Artigo de método

Visualização da Sialilação Intracelular com Química Click e Microscopia de Expansão

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DOI:

10.3791/67479

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7 de fevereiro de 2025

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1Univ. Lille, CNRS, UMR 8576 - UGSF - Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, 2Univ. Lille, CNRS, UMR 8520 - IEMN – Institut d’Electronique, de Microelectronique et de Nanotechnologie, 3Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, US 41 - UAR 2014 - PLBS

Neste artigo

Resumo

Aqui, propomos um protocolo simples que combina engenharia de oligossacarídeos metabólicos, química de clique e microscopia de expansão que permite a bioimagem de N-glicoproteínas sialiladas intracelulares com resolução aprimorada usando equipamentos de microscopia de rotina.

Resumo

As técnicas de marcação metabólica permitem a incorporação de repórteres bioortogonais em glicanos, permitindo a bioconjugação direcionada de corantes moleculares dentro das células por meio de clique e química bioortogonal. A engenharia de oligossacarídeos metabólicos (MOE) tem atraído considerável interesse devido ao papel essencial da glicosilação em vários processos biológicos que envolvem reconhecimento molecular e seu impacto em patologias que vão desde câncer a distúrbios genéticos e infecções virais e bacterianas.

Embora o MOE seja mais conhecido pela detecção de glicoconjugados de superfície celular, também é uma metodologia muito importante para o estudo de glicanos intracelulares em contextos fisiológicos e patológicos. Tais estudos se beneficiam muito da alta resolução espacial. No entanto, a microscopia de super-resolução não está prontamente disponível na maioria dos laboratórios e apresenta desafios para a implementação diária. A microscopia de expansão é uma alternativa recente que aumenta a resolução da microscopia ampliando fisicamente as amostras biológicas marcadas com marcadores fluorescentes. Ao incorporar a amostra em um gel expansível e fazer com que ela se expanda isotropicamente por meio de tratamento químico, as estruturas subcelulares podem ser visualizadas com maior precisão e resolução sem a necessidade de técnicas de super-resolução.

Neste trabalho, ilustramos a capacidade da microscopia de expansão em visualizar glicanos sialilados intracelulares através do uso combinado de MOE e química de clique. Especificamente, propomos um procedimento para marcação bio-ortogonal e microscopia de expansão que emprega um repórter direcionado à sialilação, que pode estar associada à imunofluorescência para estudos de co-localização. Este protocolo permite estudos de localização da biossíntese de sialoconjugados, tráfego intracelular e reciclagem.

Introdução

A microscopia de fluorescência, embora amplamente utilizada para rotular e visualizar moléculas específicas dentro das células, é inerentemente limitada em resolução pelo limite de difração de luz1 de Abbe, que restringe a capacidade de distinguir entre objetos mais próximos do que aproximadamente 200-250 nm. Essa limitação surge da natureza ondulatória da luz e da abertura numérica da lente objetiva do microscópio, introduzindo um desafio ao obter imagens de estruturas subcelulares. A superação dessas limitações fornece melhores insights sobre certos processos biológicos em escala nanométrica.

Para ultrapassar o limite de difração da luz, técnicas de microscopia de super-resolução como STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) e STED (Stimulated Emission Depletion) foram desenvolvidas 2,3. O STORM depende da ativação estocástica de fluoróforos, permitindo que apenas um subconjunto esparso seja fotografado a qualquer momento. Isso permite a localização precisa de fluoróforos individuais, o que permite a reconstrução de uma imagem de alta resolução. O STED, por outro lado, melhora a resolução usando um laser de depleção para extinguir seletivamente a fluorescência ao redor da periferia do ponto de excitação, estreitando efetivamente a função de propagação do ponto.

Essas abordagens contrastam com a microscopia de campo amplo ou confocal, onde todos os fluoróforos são detectados simultaneamente, resultando em uma imagem que combina todos os padrões de difração e evita a distinção entre fluoróforos individuais próximos, levando a uma perda de resolução. No entanto, esses métodos de super-resolução requerem fontes de luz, equipamentos, preparação de amostras e/ou fluoróforos muito específicos, tornando essas tecnologias caras, de difícil acesso na maioria dos laboratórios e difíceis de implementar em experimentos de rotina. Essas restrições levaram a comunidade científica a buscar soluções alternativas para obter maior resolução, que fossem compatíveis com equipamentos de microscopia prontamente disponíveis e protocolos de coloração de rotina. Em 2015, um método para contornar as limitações da microscopia óptica expandindo fisicamente a amostra foi desenvolvido por Boyden e colaboradores, denominado Microscopia de Expansão (ExM)4.

O ExM é um método de três etapas que fornece detalhes em nanoescala de amostras biológicas sem ultrapassar o limite de difração da luz (Figura 1). Em vez disso, ele usa microscópios convencionais limitados por difração para obter imagens de amostras que foram fisicamente ampliadas de maneira isotrópica. A primeira etapa, chamada gelificação, consiste em incorporar a amostra biológica, normalmente células ou tecidos fixos, em um hidrogel polieletrolítico expansível à base de acrilato de sódio e acrilamida. A amostra biológica então passa por tratamento enzimático para degradar parcialmente certos componentes, como proteínas ou membranas, e quebrar estruturas celulares densas para garantir que as células possam se expandir uniformemente. Essa etapa, chamada de digestão, ajuda a conseguir isso homogeneizando os componentes estruturais da amostra em relação às propriedades mecânicas, evitando a expansão diferencial que poderia levar à distorção da amostra. Finalmente, na última etapa, chamada de expansão, a amostra embebida em hidrogel e digerida é colocada em água deionizada, fazendo com que ela inche. Essa tecnologia resulta na expansão da amostra por um fator de ampliação linear de aproximadamente 4-5x em todas as dimensões, permitindo a visualização de detalhes celulares finos usando técnicas de microscopia padrão. Dada a natureza isotrópica da expansão, a amostra biológica ampliada dentro da matriz de gel retém seus detalhes geométricos tridimensionais e as relações espaciais entre seus vários componentes estruturais. A informação espacial é, portanto, preservada após o inchaço, enquanto a distância entre os marcadores fluorescentes ancorados em gel ou biomoléculas aumenta uniformemente em todas as direções. Isso permite uma melhor separação de sinais, resultando em resolução aprimorada.

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Figura 1: Visão geral do protocolo ExM. (a) Gelificação: A amostra biológica é ancorada e incorporada em um hidrogel polieletrolítico expansível. (b) Digestão: As propriedades mecânicas da amostra são homogeneizadas através do uso de enzimas e detergentes, quebrando proteínas e membranas lipídicas que, de outra forma, restringiriam a expansão e criariam distorções. (c) Expansão: O hidrogel é imerso em água deionizada, fazendo com que se expanda isotropicamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Desde 2015, o ExM tem visto melhorias tecnológicas significativas na preservação de informações espaciais. Em particular, várias âncoras moleculares foram projetadas para ligar biomoléculas covalentemente diretamente ao hidrogel expansível 5,6. Neste protocolo, usamos N-acriloxisuccinimida (NAS), que reage com os grupos amina livres de biomoléculas (tipicamente, resíduos de lisina ou posições N-terminais de proteínas) para bioconjugar um grupo acriloil às proteínas da célula, incluindo glicoproteínas. Este grupo acriloil então reage com outros monômeros por meio de reações de reticulação durante a gelificação, ancorando essas biomoléculas diretamente ao polímero.

O ExM é compatível com uma ampla gama de métodos de rotulagem, incluindo Engenharia de Oligossacarídeos Metabólicos (MOE). O MOE é uma ferramenta poderosa que permite a marcação de glicanos incorporando análogos de precursores metabólicos equipados com uma alça química bio-ortogonal7. Esses análogos, conhecidos como repórteres químicos, integram-se às vias metabólicas sem causar toxicidade. Na abordagem MOE, os monossacarídeos repórteres são metabolicamente processados em açúcares nucleotídeos ativados e, em seguida, transferidos para glicoconjugados nascentes. Nosso foco principal é o estudo da sialilação, particularmente a dinâmica intracelular e o tráfego de N-glicoproteínas siailiadas, que é crucial no contexto da saúde e da doença devido aos seus papéis nas interações célula-célula, regulação imunológica e desenvolvimento. A sialilação anormal está implicada em doenças como câncer 8,9,10,11, doençasinfecciosas12 e distúrbios genéticos 13,14,15, tornando-se um alvo chave para o desenvolvimento terapêutico e descoberta de biomarcadores. Compreender a sialilação aprimora os insights sobre a glicobiologia e os mecanismos da doença.

A sialilação pode ser sondada usando MOE com análogos do ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac), o ácido siálico mais abundante em humanos, ou com análogos da N-acetilmanosamina (ManNAc), um precursor metabólico do Neu5Ac, com uma alça bio-ortogonal 8,16. ManNAc é convertido em Neu5Ac no citosol, depois ativado em ácido citidina-5'-monofosfo-N-neuramínico (CMP-Neu5Ac) no núcleo. Uma vez ativadas em um açúcar nucleotídeo, as sialyl transferases no aparelho de Golgi transferem unidades Neu5Ac para as posições terminais das cadeias de glicanos em crescimento (Figura 2). Após a incorporação metabólica de derivados não naturais de ManNAc, os glicanos sialilados marcados podem ser ligados covalentemente a um fluoróforo com um grupo reativo complementar ao cabo repórter por meio da química do clique bio-ortogonal. Isso permite a observação direta de glicoconjugados in vivo ou ex vivo.

Para a maioria dos repórteres monossacarídeos, uma forma peracetilada é necessária para atravessar a membrana plasmática por difusão passiva. No entanto, tanto os repórteres peracetilados quanto os desprotegidos demonstraram investigar eficientemente a sialilação16. Repórteres de sialilação desprotegidos são capazes de entrar nas células por mecanismos de transporte ativos, ou seja, pinocitose para análogos de Neu5Ac e um transportador ainda não identificado para ManNAc. Embora os açúcares desprotegidos exijam uma concentração mais alta (normalmente 100-500 μM) para obter efeitos comparáveis, uma vez dentro da célula, eles podem entrar diretamente na via metabólica do ácido siálico. Em contraste, os açúcares peracetilados precisam ser totalmente desacetilados por esterases intracelulares não específicas antes de se tornarem metabolicamente ativos. Embora possam ser usados em concentrações mais baixas (normalmente 10-50 μM), a desacetilação incompleta pode interferir na atividade enzimática ou levar à incorporação de análogos do ácido siálico parcialmente acetilados, potencialmente distorcendo a análise a jusante. Além disso, a liberação de ácido acético pode afetar o pH localmente, potencialmente impactando a função celular. Chen e colegas também demonstraram que os açúcares per-O-acetilados reagem com resíduos de cisteína livre nas proteínas por meio de um mecanismo não enzimático, levando à incorporação fora do alvo e aumento do sinal não específico17,18. No presente protocolo, portanto, empregamos repórteres ManNAc desprotegidos.

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Figura 2: Engenharia de oligossacarídeos metabólicos e marcação de ácidos siálicos. UDP-GlcNAc é convertido em ManNAc pelo domínio UDP-GlcNAc 2-epimerase de GNE/MNK no citosol. ManNAc é então fosforilado no citosol pelo domínio ManNAc 6-quinase de GNE/MNK para formar ManNAc-6-fosfato. A N-acetilneuraminato sintase catalisa a condensação de ManNAc-6-P com fosfoenolpiruvato para produzir Neu5Ac-9-fosfato, que é subsequentemente desfosforilado pela fosfatase do ácido siálico para produzir Neu5Ac. Neu5Ac também pode ser fornecido pela via de salvamento via endocitose e reciclagem lisossômica8. Após o transporte para o núcleo, ele é convertido em CMP-Neu5Ac pela CMP-ácido siálico sintetase. No aparelho de Golgi, CMP-NeuAc é o substrato de sialiltransferases que introduzem uma porção Neu5Ac nas posições terminais dos glicanos em glicoconjugados em maturação, que são eventualmente expressos na membrana celular ou secretados. Os repórteres químicos ManNAz com uma alça bio-ortogonal podem penetrar na célula através de um transportador ativo não identificado e entrar na via metabólica. As unidades Neu5Az marcadas incorporadas em glicanos após a biossíntese são então marcadas por meio da conjugação mediada por CuAAC de uma sonda fluorescente. Abreviaturas: NAc = N-acetil; UDP-GlcNAc = Difosfato de uridina N-acetilglucosamina; ManNAc = N-acetilmanosamina; GNE = UDP-GlcNAc 2-epimerase; MNK = ManNAc 6-quinase; ManNAc-6-P = ManNAc-6-fosfato; SNAN = N-acetilneuraminato sintase; PEP = fosfoenolpiruvato; Neu5Ac = ácido N-acetilneuramínico; Neu5Ac-9-P = Neu5Ac-9-fosfato; NANP = fosfatase do ácido siálico; CMP = citidina-5'-monofosfato; CMAS = CMP-ácido siálico sintetase; STs = sialiltransferases; ManNAz = N-azidoacetilmanosamina; Neu5Az = ácido N-azidoacetilneuramínico Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Entre as possíveis reações bio-ortogonais, focamos nosso interesse na cicloadição de azida-alcino catalisada por cobre (CuAAC) 16 , 19 . De acordo com nossa experiência, o CuAAC é a melhor opção para marcar glicanos intracelulares em células fixas. Essa reação está bem estabelecida, exaustivamente estudada em química bio-ortogonal e foi padronizada para uso em ambientes biológicos complexos, fornecendo uma base sólida de conhecimento e protocolos otimizados. Sua cinética rápida realmente oferece alta eficiência e especificidade de reação, e envolve grupos azida e alcino que são fáceis de sintetizar, estáveis, ausentes dos sistemas vivos e inertes em relação às biomoléculas nativas, tornando-o ideal para aplicações de células fixas onde a toxicidade do cobre não é um problema. A cicloadição de alcino-azida promovida por cepa (SPAAC) 20 , 21 , embora evite a toxicidade do cobre, tem cinética mais lenta e sondas mais volumosas, o que tende a levar a um sinal de fundo mais alto e menor relação sinal-ruído para aplicações intracelulares devido ao aprisionamento hidrofóbico, enquanto o Diels-Alder de demanda de elétrons inverso (IEDDA) 22 , 23, embora rápido e livre de cobre, envolve uma síntese de sonda mais complexa e requer grupos de repórteres mais volumosos que ainda não foram totalmente caracterizados em aplicações MOE. Como o ExM requer exclusivamente células fixas, o CuAAC oferece uma solução robusta e eficiente para marcação bio-ortogonal.

Este artigo apresenta um protocolo para a visualização de glicoproteínas sialadas intracelulares em células, combinando marcação metabólica, química de clique bio-ortogonal e microscopia de expansão. Nos procedimentos experimentais descritos neste artigo, utilizamos N-azidoacetilmanosamina (ManNAz) como repórter químico, e a ligação de CuAAC de pequenos fluoróforos orgânicos é realizada antes do procedimento de expansão. As glicoproteínas são ancoradas ao hidrogel com NAS antes da gelificação, digestão e expansão. A marcação de ácidos siálicos pelo MOE pode ser associada a abordagens de imunofluorescência para avaliação de co-localização, como exemplificado aqui com um anticorpo primário anti-GM130 de camundongo localizado no aparelho cis-Golgi. Este protocolo pode ser aplicado a células em seu estado fisiológico ou a células que foram submetidas a tratamento químico. Para ilustrar isso, a cloroquina foi usada para inibir a função lisossômica, que afeta o processamento e o tráfego de glicoproteínas dentro das células. A coloração nuclear é usada como um ponto de referência, não apenas para localizar células, mas também como um indicador da qualidade do processo ExM. O fator de expansão pode de fato ser medido comparando o tamanho do núcleo pré-expansão (preExM) e pós-expansão (postExM).

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Protocolo

1. Semeadura celular

NOTA: Execute as próximas etapas em condições estéreis sob uma capela de fluxo laminar. Este método pode ser aplicado a qualquer uma das linhagens celulares utilizadas no presente trabalho (HeLa, MCF7, fibroblastos primários), ou à maioria dos modelos de linhagens celulares aderentes comumente utilizados em pesquisas 20,24,25.

  1. Cultivar células em meio DMEM com alto teor de glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em um frasco T75 a 37 ° C sob uma atmosfera de 5% de CO2 .
  2. Assim que as células atingirem a confluência total, remova o meio de cultura celular e lave as células com 4 mL de PBS.
    NOTA: As soluções PBS usadas nesta etapa e todas as etapas de lavagem subsequentes devem ser esterilizadas por filtração através de uma membrana de PTFE de 0.2 μm antes do uso.
  3. Incubar as células durante 5 min a 37 °C em 2 ml de 1x solução de tripsina-EDTA contendo 0,5 g/L de tripsina, para as libertar do fundo do frasco.
  4. Adicione 8 mL de meio DMEM com alto teor de glicose contendo 10% de FBS e misture bem para garantir que cada célula seja destacada do fundo do frasco.
  5. Transferir as células para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar durante 5 min a 200 × g. Enquanto isso, adicione uma lamínula (diâmetro 12 mm, espessura 130-160 μm) a cada alvéolo de uma placa de 12 poços.
    NOTA: A espessura da lamínula deve ser ajustada para corresponder aos requisitos do microscópio usado nas etapas subsequentes de imagem.
  6. Remova o sobrenadante após centrifugação e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio de cultura celular.
  7. Determine o número médio de células/mL por hemocitometria em pelo menos duas medições.
  8. Dilua a suspensão celular até uma concentração de 300.000 células por mL em meio de cultura celular e semeie 1 mL da suspensão em cada poço.
  9. Deixar as células assentarem durante 24 h em meio DMEM com elevado teor de glucose contendo 10% de FBS a 37 °C sob uma atmosfera de 5% de CO2 antes dos passos seguintes.

2. Tratamento com cloroquina (opcional)

NOTA: As etapas 2.1-2.8 ilustram como usar o protocolo em células tratadas com um reagente externo (inibidor, efetor, medicamento), usando a cloroquina como exemplo. Ignore estas etapas para células não tratadas com reagentes externos.

  1. Pese a quantidade correta de sal de difosfato de cloroquina (CQ) para preparar um volume suficiente de uma solução-mãe de 10 mM.
    NOTA: Execute as próximas etapas em condições estéreis sob uma capela de fluxo laminar.
  2. Solubilizar o CQ sólido na quantidade desejada de água deionizada para uma concentração final de 10 mM.
  3. Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 μm.
  4. Alíquota de 1 ml da solução-mãe de 10 mM em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e armazená-los a -20 °C.
  5. Lave a amostra de célula preparada na etapa 1.9 com 1 mL de PBS.
  6. Adicione 100 μL de 10 mM CQ em 9,9 mL de meio DMEM com alto teor de glicose contendo 10% de FBS, para uma concentração final de 100 μM de CQ.
  7. Incubar células por 8 h em 1 mL de um meio suplementado com 100 μM de CQ a 37 ° C sob uma atmosfera de 5% de CO2 .
  8. Lave as células 3x com 1 mL de PBS.

3. Engenharia de oligossacarídeos metabólicos

  1. Preparar uma solução-mãe de ManNAz a 5 mM (ou ManNAc para a condição de controlo negativo) em meio DMEM com elevado teor de glucose contendo 10% de FBS.
    NOTA: Esta solução estoque deve ter volume suficiente para que cada poço possa ser tratado com 1 mL de solução análoga de açúcar. Execute as próximas etapas em condições estéreis sob uma capela de fluxo laminar.
  2. Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 μm e conservar em alíquotas de 1 ml a -20 °C até que seja necessário.
  3. Prepare um meio suplementado com 500 μM de ManNAz ou ManNAc diluindo uma alíquota de solução estoque de 1 mL preparada na etapa 3.2 com 9 mL de meio DMEM com alto teor de glicose contendo 10% de FBS.
  4. Incubar as células preparadas na etapa 1.9 (para experimentos em células não tratadas) ou na etapa 2.8 (para experimentos em células tratadas com CQ) em 1 mL do meio suplementado com 500 μM de ManNAz (ou 500 μM de ManNAc para o grupo de controle) por 24 h a 37 ° C sob uma atmosfera de 5% de CO2 .

4. Fixação e permeabilização

NOTA: Todas essas etapas são realizadas sob uma hotte.

  1. Lave as amostras com 1 mL de PBS.
  2. Fixe as células em cada lamínula adicionando 500 μL de paraformaldeído a 5%. Deixe descansar por 15 min em temperatura ambiente.
  3. Lave 3x com 1 mL de PBS.
  4. Prepare uma câmara úmida personalizada usando uma caixa opaca suficientemente grande (por exemplo, uma caixa de poliestireno) com tampa. Coloque um pedaço de papel mata-borrão úmido no fundo da caixa e, em seguida, coloque uma camada de parafilme em cima dele.
    NOTA: A câmara úmida deve proteger completamente a amostra de fontes de luz externas quando fechada.
  5. Coloque as lamínulas no parafilme, com as células voltadas para cima.
    NOTA: Rotule o parafilme com o nome ou referência das amostras com antecedência.
  6. Realize a permeabilização celular usando 200 μL de Triton X-100 a 0,5% (v/v) em PBS por 15 min em temperatura ambiente.
  7. Lave 3x com 200 μL de PBS.

5. Rotulagem de fluorescência

  1. Marcação CuAAC de glicanos sialilados marcados
    NOTA: O tampão de reação CuAAC deve ser preparado recentemente antes do uso, e os reagentes devem ser adicionados na ordem especificada, com o ascorbato de sódio sendo adicionado por último. Em soluções aquosas oxigenadas, os íons(I) formados pela redução de(II) com ascorbato irão gradualmente reoxidar em(II), levando a uma diminuição na concentração de ascorbato ao longo do tempo. Para manter a reprodutibilidade dos resultados, o tampão não deve ser armazenado por mais de alguns dias a 4 °C e é preferencialmente utilizado no mesmo dia.
    1. Para rotular os glicanos sialilados modificados com azida projetados na seção 3, prepare um tampão de reação CuAAC consistindo de 5 μM de alcino AlexaFluor 488 (AF488Alk), 150 μM de CuSO4, 300 μM 2-(4-((bis((1-(terc-butil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)ácido acético (BTTAA), 0,1 M K2HPO4 e 2,5 mM de ascorbato de sódio em água deionizada. Prepare solução suficiente para aplicar 200 μL em cada lamínula.
    2. Adicione 200 μL de tampão CuAAC em cada lamínula para iniciar a reação. Certifique-se de que a amostra esteja homogênea coberta com a gota e deixe reagir por 45 min em temperatura ambiente, protegida da luz.
    3. Lave 3x com 200 μL de PBS para interromper a reação e remover o excesso de sonda e reagentes.
  2. Coloração do núcleo
    1. Para marcação nuclear com Hoechst 33342, diluir uma solução estoque de 10 mg / mL a 1: 2000 em PBS.
      NOTA: Contra-corantes nucleares equivalentes, como 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), podem ser usados para o mesmo efeito.
    2. Cubra as células com 200 μL desta solução e incube por 5-10 min em temperatura ambiente, protegido da luz.
    3. Lave 3x com 200 μL de PBS.
  3. Coloração de imunofluorescência
    1. Prepare um tampão bloqueador de albumina de soro bovino (BSA) contendo 0,1 g de gelatina, 1 g de BSA, 1 mL de FBS e 49 mL de PBS para 50 mL de tampão.
    2. Incubar as amostras durante 1 h a 4 °C em 200 μL de tampão de bloqueio BSA. Proteja a amostra da luz.
    3. Para coloração por imunofluorescência do aparelho de Golgi usando um anticorpo anti-GM130 de camundongo purificado (epítopo reconhecido: Rat GM130 aa. 869-982 | RRID: AB_398142), diluir o anticorpo primário a 1:100 no tampão de bloqueio BSA preparado.
      NOTA: Esta etapa pode ser adaptada para coloração de imunofluorescência direcionada a outras organelas usando qualquer anticorpo primário relevante, caso em que o fator de diluição deve ser adaptado de acordo com a orientação do fabricante.
    4. Adicionar 70 μl da solução contendo o anticorpo às lamínulas e incubar durante 1 h a 4 °C, ao abrigo da luz.
    5. Lave 3x com 200 μL de PBS.
    6. Dilua o anticorpo secundário fluorescente (Alexa Fluor 546 anti-mouse IgG) a 1:600 em tampão de bloqueio BSA e adicione 100 μL em cada lamínula.
    7. Incubar as amostras durante 1 h à temperatura ambiente, ao abrigo da luz.
    8. Lave 3x com 200 μL de PBS.
    9. Transfira as lamínulas para uma placa de 6 poços. Armazene as amostras em 2 mL de PBS a 4 °C por alguns dias, protegidas da luz.
      NOTA: é aconselhável sempre preparar uma réplica exclusivamente para visualização preExM como referência para fins de comparação antes e depois da expansão e para garantir que o padrão de rotulagem não tenha sido distorcido após a expansão.

6. Imagem pré-expansão de amostras

NOTA: As etapas a seguir dependem do equipamento de bioimagem usado e podem precisar ser ajustadas aos requisitos da máquina. Siga as regras do laboratório local ou da plataforma de bioimagem. As etapas 6.1-6.13 aqui são realizadas em um microscópio confocal de varredura a laser.

  1. Ligue o microscópio e certifique-se de que as fontes de luz (lasers) estejam aquecidas. Abra o software de aquisição de bioimagem.
  2. Selecione os comprimentos de onda de excitação do laser correspondentes aos fluoróforos para criar os canais (por exemplo, 405 nm para coloração nuclear, 488 nm para glicanos sialilados marcados com AF488Alk e 546 nm para marcação de imunofluorescência). Ative os lasers de acordo.
  3. Coloque e prenda uma lamínula de 32 mm de diâmetro (130-170 μm de espessura) em um suporte adaptado ao microscópio.
  4. Colocar a amostra preparada no passo 5.3.9, com as células viradas para baixo, sobre a lamínula de 32 mm. Adicione uma gota de água deionizada para evitar que a amostra seque.
  5. Selecione uma lente objetiva apropriada, aqui uma objetiva de imersão em óleo de 63x com uma abertura numérica de 1,4 ou equivalente.
    NOTA: A abertura numérica mais alta fornece a melhor resolução. Ao usar uma objetiva de imersão em óleo, lembre-se de adicionar uma gota de óleo entre a objetiva e a lamínula.
  6. Coloque o suporte na platina do microscópio acima da objetiva.
  7. Use o modo de fluorescência de campo claro ou de baixa intensidade de laser para localizar uma área de interesse na amostra.
  8. Defina o foco.
  9. Visualize as células no software no modo de fluorescência ao vivo . Defina a intensidade do laser para cada canal. Comece com baixa potência do laser para evitar o fotobranqueamento. Aumente lentamente a potência do laser e ajuste o ganho e o deslocamento do detector para amplificar o sinal sem introduzir ruído excessivo conforme necessário para visualizar a fluorescência claramente sem superexposição.
    NOTA: Os parâmetros devem ser ajustados para minimizar o ruído de fundo e evitar a saturação do sinal. É crucial manter configurações consistentes em todas as amostras em uma série de experimentos, incluindo controles negativos.
  10. Defina parâmetros de imagem como tamanho do orifício (por exemplo, 1 unidade de ar), velocidade de digitalização (por exemplo, 8), fator de zoom (por exemplo, 1), intervalo de valores de brilho (por exemplo, 16 bits) e número médio (por exemplo, 2), modo (por exemplo, linha) e método (por exemplo, média) conforme necessário para alcançar a observação desejada.
    NOTA: Esses valores dependem do sistema e da amostra e devem ser otimizados antes da aquisição. O tamanho do orifício depende da abertura numérica, ampliação e comprimento de onda: diminuí-lo pode melhorar a resolução às custas da relação sinal-ruído. É aconselhável definir a velocidade de digitalização para valores rápidos (correspondentes ao pequeno tempo de permanência por pixel) para evitar o fotobranqueamento.
  11. Realize a aquisição e salve os dados no formato desejado com os devidos metadados para referência futura.
  12. Terminada a aquisição, coloque a amostra de volta na placa de 6 poços adicionando uma pequena quantidade de água deionizada para facilitar a transferência com uma pinça.
    NOTA: A etapa 6.12 só é realizada se a expansão desta amostra específica for necessária. Caso contrário, descarte a amostra e use outras réplicas para as etapas a seguir.

7. Protocolo de microscopia de expansão

NOTA: As amostras são protegidas o máximo possível da luz para evitar fotobranqueamento. As etapas de ancoragem e gelificação são realizadas sob uma capela de exaustão.

  1. Ancoragem
    1. Incubar as amostras com N-acriloilsuccinimida (NAS) a uma concentração de 3,2 mg/ml em PBS num agitador mecânico durante 1 h à temperatura ambiente. Prepare uma quantidade suficiente de solução para adicionar 500 μL de solução por alvéolo (solução estoque: 16 mg / mL NAS em DMSO).
      NOTA: O NAS reage com os resíduos de lisina e N-terminais das proteínas para enxertar um grupo acriloil, permitindo que as proteínas se ancorem ao hidrogel nas etapas subsequentes.
    2. Lave 3x com 1 mL de PBS.
  2. Gelificação
    1. Prepare uma solução monômera composta da seguinte forma: em 50 mL de 1x PBS (pH 7,4), adicione 5,843 g de NaCl, 1,25 g de acrilamida, 0,075 g de bis-acrilamida e 4,313 g de acrilato de sódio. Preparar solução suficiente para aplicar 70 μL em cada lamínula. Congele alíquotas de 1 mL pelo menos 24 h antes da gelificação.
      CUIDADO: Os monômeros são tóxicos; Devem ser manuseados com cuidado com equipamento de protecção adequado e pesados sob um exaustor.
    2. Em um pedaço de parafilme, uma gota de 70 μL de solução de monômero é colocada, seguida pela adição de 1,4 μL de 10% (v/v) de N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina (TMEDA), depois 1,4 μL de persulfato de amônio (APS) a 10% (p/v), que são misturados à gota.
      NOTA: Os reagentes reticuladores devem ser adicionados nesta ordem específica, primeiro TMEDA e depois APS.
    3. Rapidamente, coloque a lamínula cuidadosamente sobre a solução com as células voltadas para baixo.
    4. Deixar a solução polimerizar durante 1 h à temperatura ambiente numa câmara húmida.
  3. Digestão
    1. Prepare uma solução tampão de digestão composta por 1x tampão TAE, 0,5% (v / v) Triton X-100, 0,8 M guanidina HCl e 8 U / mL proteinase K.
      NOTA: O tampão de digestão deve ser preparado e pré-incubado por 30 min a 37 °C antes do uso.
    2. Adicione 1 mL de tampão de digestão ao hidrogel formado na etapa 7.2. Deixar a digestão prosseguir durante 3 h a 37 °C num agitador mecânico.
    3. Remova o tampão de digestão e lave suavemente o gel 3x com 2 mL de água deionizada.
      NOTA: O hidrogel se expandirá ligeiramente e se desprenderá da lamínula.
  4. Expansão
    1. Deixe o hidrogel se expandir em 3 mL de água deionizada por 2 h. Troque a água a cada 30 min.

8. Imagem pós-expansão de amostras

  1. Coloque uma lamínula de 32 mm de diâmetro (130-170 μm de espessura) e prenda-a em um suporte.
  2. Recorte um pedaço do hidrogel e coloque-o na lamínula, com as células na parte inferior do gel.
    NOTA: As peças excisadas devem ser grandes o suficiente para fornecer área de superfície adequada para observação, mas não muito grandes, pois isso pode dificultar o manuseio do gel e aumentar o risco de quebra (tamanho recomendado: 5 a 8 mm). Coloque pedaços de hidrogel suficientes para cobrir toda a superfície da lamínula; Isso ajudará a prender as peças no lugar e evitar qualquer desvio durante a imagem. Em caso de problemas de deriva, o pré-revestimento das lamínulas com poli-D-lisina pode ser vantajoso6.
  3. Coloque o suporte na platina do microscópio acima da objetiva.
  4. Realize a aquisição da imagem em um microscópio confocal de varredura a laser com uma objetiva de imersão em óleo, conforme descrito na etapa 6.

9. Cálculo do fator de expansão (EF) no ImageJ

  1. Abra os dados de imagem no freeware ImageJ ou equivalente.
  2. Se estiver trabalhando em uma imagem de vários canais, divida os canais e trabalhe apenas no canal do núcleo navegando até Selecionar imagem | Cor | Canais divididos.
  3. Para medir o diâmetro do núcleo, destaque o sinal correspondente ao núcleo determinando um limite clicando em Selecionar imagem | Ajustar | Limiar.... Escolha um método no menu suspenso padrão que melhor se adapte à imagem (por exemplo, Otsu) e ajuste o limite até que a forma do núcleo seja claramente cortada do fundo.
    NOTA: A configuração de limite precisa ser ajustada para cada imagem, pois uma configuração pode não caber em todas as imagens ou em todas as amostras.
  4. Defina a medida para determinar o diâmetro de Feret clicando em Selecionar Analisar | Definir medidas.... No menu, selecione Diâmetro de Feret e ajuste o decimal , se necessário.
  5. Para iniciar a análise da imagem, clique em Selecionar Analisar | Analise as partículas para definir o tamanho das partículas; Para o núcleo, escolha 5-infinito μm² | Exibir resultados | Adicionar ao gerente | Exclua nas bordas e sobreposição. Inicie a análise.
  6. Quando a análise começar, várias janelas serão exibidas. Nos resultados da janela, procure o diâmetro máximo de Feret de cada núcleo na coluna Feret. Copie e cole os dados brutos em uma planilha e calcule o tamanho médio do núcleo para amostras pré-expandidas e expandidas .
    NOTA: Certifique-se de que as regiões de interesse (ROIs) correspondentes a cada núcleo sigam toda a periferia do núcleo.
  7. Calcule o fator de expansão (EF) da seguinte forma:
    EF = figure-protocol-1
    NOTA: O fator EF determina o quanto a amostra foi expandida.

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Resultados

Abaixo está a aplicação do protocolo para visualizar glicoproteínas siailiadas em células HeLa (Figura 3A) e células MCF7 (Figura 3B), omitindo o tratamento CQ (seção 2 do protocolo) e a coloração de co-localização de imunofluorescência (etapa 5.3 do protocolo).

figure-results-1
Figura 3...

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Discussão

O presente protocolo de marcação CuAAC não inclui aminoguanidina no tampão de reação. Por se destinar à visualização de glicoconjugados intracelulares, é realizado em células que são fixadas após a etapa de incorporação metabólica, para evitar qualquer problema de citotoxicidade e melhorar a captação do sistema catalítico. O uso de aminoguanidina é tipicamente recomendado para a marcação da superfície celular de células vivas para evitar reações colaterais entre o desidroascorbato e os resíduos de arginina, histidina e l...

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Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos às instalações da TisBio e à plataforma PLBS por fornecer o ambiente técnico propício para a realização deste trabalho. Este trabalho foi apoiado por bolsas do CNRS e do Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. Gostaríamos de agradecer ao Dr. François Foulquier, Dra. Zoé Durin, Sra. Dorothée Vicogne e Sra. Céline Schulz por estimular as discussões e por nos fornecer a linhagem celular Fibroblast 533T e o anticorpo primário GM130.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
(+) L-ascorbato de sódioSigma Aldrich11140
placa de cultura de células de 12 poçosCorning3513
AcrilamidaSigma AldrichA8887
Ácido acrílico N-hidroxisuccinimida éster Sigma AldrichA8060
Alexa Fluor 488 alcino Jena BioscienceCLK-1277-5
Alexa Fluor 546 cabra anti-rato IgGInvitrogenA11003
Persulfato de amônioSigma Aldrich9913
Bis-AcrilamidaSigma Aldrich146072
BSASigma AldrichA7906
BTTAAJena BioscienceCLK-067-100
Tubo de centrifugação 2 mLEPPENDORF30120094
Sal de difosfato de cloroquinaSigma AldrichC6628
Tubo cônico 15 mLFalcon352097
lamínulas 12 mm #1eprediaCB00120RA120MNZ0
lamínulas 32 mm #1eprediaCB00320RA140MNZ0
CuSO4Sigma Aldrich209198
DMEM meio de glicose alta DutscherL0104-500
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) DutscherL0615-500
Soro Fetal BovinobiowestS1810-500
Fibroblasto 533T--Coletado de indivíduo saudável
FIJI ImageJ 2.9.0--
GelatinaBio-RAD170-6537
Guanidina HClSigma Aldrich50950
HeLa célulasATCCCCL-2
Hoechst 33342Sigma Aldrich14533
Imaris 10.2--
K2HPO4EuromedexPB0447-BAnhydrous
LSM 780 Microscopia Confocal Zeiss-MCF7
ATCCHTB-22
N-acetilmanosamina (ManNAc)BIOSYNTHMA05269
NaClCarlo Erba479687
N-azidoacetilmanosamina (ManNAz)BIOSYNTHMA46002
Objectif "Plan-Apochromat" 63x/1,4 Óleo DIC M27Zeiss420782-9900-799 
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 10xEuromedexET330
Proteinase KSigma AldrichP2308de  Tritirachium album
purificado camundongo GM130 anticorpoBD Bioscience61082250 µ g
de acrilato de sódio Sigma Aldrich408220
T75 FrascoCorning430641
TEMEDSigma AldrichT9281
tris Acetato EDTA (TAE) 10xEuromedexEU0202-B
Triton X-100Sigma AldrichX-100
Trypan BlueDutscher702630
Trypsine-EDTA 1xDutscherL0930-100

Referências

  1. De Souza, N. Light microscopy at the limit. Nat Cell Biol. 11 (Suppl 1), S22(2009).
  2. Tam, J., Merino, D. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) in comparison with stimulated emission depletion (STED) and other imaging methods. J Neurochem. 135, 643-658 (2015).
  3. Jeong, S., Widengren, J., Lee, J. C. Fluorescent probes for STED optical nanoscopy. Nanomaterials. 12 (1), 21(2021).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543548(2015).
  5. Kang, S., et al. Expansion microscopy with a thermally adjustable expansion factor using thermoresponsive biospecimen-hydrogel hybrids. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (24), 2896228974(2021).
  6. Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nat Methods. 18 (1), 107113(2020).
  7. Dube, D., Bertozzi, C. Metabolic oligosaccharide engineering as a tool for glycobiology. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 616625(2003).
  8. Scache, J., et al. Switching azide and alkyne tags on bioorthogonal reporters in metabolic labeling of sialylated glycoconjugates: a comparative study. Sci Rep. 12 (1), 22129(2022).
  9. Holst, S., Wuhrer, M., Rombouts, Y. Glycosylation characteristics of colorectal cancer. Adv Cancer Res. 126, 203256(2015).
  10. Boyaval, F., et al. N-Glycomic signature of stage II colorectal cancer and its association with the tumor microenvironment. Mol Cell Proteomics. 20, 100057(2021).
  11. Ferreira, J. A., et al. Protein glycosylation in gastric and colorectal cancers: Toward cancer detection and targeted therapeutics. Cancer Lett. 387, 32-45 (2017).
  12. Jennings, M. P., Day, C. J., Atack, J. M. How bacteria utilize sialic acid during interactions with the host: snip, snatch, dispatch, match and attach. Microbiology. 168 (3), 001157(2022).
  13. Gilormini, P. A., et al. A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways. Chem Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).
  14. Vanbeselaere, J., et al. Alkynyl monosaccharide analogues as a tool for evaluating Golgi glycosylation efficiency: application to Congenital Disorders of Glycosylation (CDG). Chem Commun. 49 (96), 11293-11295 (2013).
  15. Gilormini, P. A., et al. Chemical glycomics enrichment: imaging the recycling of sialic acid in living cells. J Inherit Metab Dis. 4 (3), 515523(2018).
  16. Rigolot, V., Biot, C., Lion, C. To view your biomolecule, click inside the cell. Angew Chem. 60 (43), 2308423105(2021).
  17. Qin, W., et al. Artificial cysteine S-glycosylation induced by per-O-acetylated unnatural monosaccharides during metabolic Glycan Labeling. Angew Chem. 130 (7), 1835-1838 (2018).
  18. Qin, K., Zhang, H., Zhao, Z., Chen, X. Protein S-glyco-modification through an elimination-addition mechanism. J Am Chem Soc. 142 (20), 9382-9388 (2020).
  19. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A. Stepwise Huisgen cycloaddition process: Copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem. 41 (14), 25962599(2002).
  20. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide−alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126 (46), 15046-15047 (2004).
  21. Mbua, N. E., et al. Strain-promoted alkyne-azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 19121921(2011).
  22. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine ligation: Fast bioconjugation based on inverse-electron-demand Diels-Alder reactivity. J Am Chem Soc. 130 (41), 1351813519(2008).
  23. Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-based cycloadditions: Application to pretargeted live cell imaging. Bioconjug Chem. 19 (12), 22972299(2008).
  24. Bird, R. E., et al. Bioorthogonal chemistry and its applications. Bioconjug Chem. 32 (12), 2457-2479 (2021).
  25. Slade, P. G., et al. Identifying the CHO secretome using mucin-type O-linked glycosylation and click-chemistry. J Proteome Res. 11 (12), 61756186(2012).
  26. Gambarotto, D., Hamel, V., Guichard, P. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM). Methods Cell Biol. 161, 5781(2021).
  27. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nat. Methods. 16, 71-74 (2019).
  28. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).
  29. Santiago, F., et al. Synthesis and swelling behaviour of poly(sodium acrylate)/sepiolite superabsorbent composites and nanocomposites. Polym Int. 55 (8), 843848(2006).
  30. Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 78607867(2020).
  31. Wen, G., et al. Current progress in expansion microscopy: Chemical strategies and applications. Chem Rev. 123 (6), 32993323(2023).
  32. Drelich, L., et al. Toward high spatially resolved proteomics using expansion microscopy. Anal Chem. 93 (36), 12195-12203 (2021).
  33. Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nat Commun. 11 (1), 3388(2020).
  34. Liu, J., et al. Expansion microscopy with multifunctional polymer dots. Adv Mater. 33 (25), 2007854(2021).
  35. Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nat Biotechnol. 41 (6), 858869(2023).

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