Um fluxo de trabalho rápido e simples para quantificação de estruturas externas de Drosophila adulta

Resumo

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho rápido e de baixo custo para imagens de alta resolução de olhos adultos de Drosophila para quantificar defeitos de padronização e crescimento. Descrevemos nosso protocolo para preparação de amostras por montagem em ponto, aquisição de imagem de alta resolução e análise de imagem.

Resumo

O olho composto de Drosophila é um tecido padronizado com precisão que revelou mecanismos moleculares e processos biológicos que impulsionam a morfogênese. É uma estrutura simples de olhos unitários repetitivos, denominada omatídeos, que é usada para caracterizar interações genéticas e funções gênicas. Mutações que afetam a arquitetura do olho podem ser facilmente detectadas e analisadas; portanto, esse sistema é frequentemente usado em instituições com poucos recursos. A análise fenotípica adicional geralmente inclui um microscópio eletrônico de varredura (SEM) para gerar imagens de alta ampliação adequadas para análise quantitativa. No entanto, os SEMs são caros e requerem reagentes caros; a preparação da amostra se estende por dias; e, muitas vezes, eles precisam de pessoal em tempo integral para preparação de amostras e manutenção de instrumentos. Isso limita sua utilidade em instituições com poucos recursos ou durante a austeridade orçamentária. Em entomologia, o uso de tecnologia de imagem digital de alta resolução é uma prática comum para a identificação e caracterização de espécies. Este artigo descreve um método que combina estratégias e permite imagens digitais de alta resolução de estruturas adultas de Drosophila e análise quantitativa usando o software aberto ImageJ. O fluxo de trabalho é uma alternativa rápida e amigável ao aluno que corrige as limitações de instalações de pesquisa subfinanciadas e com poucos recursos com uma abordagem econômica e rápida para a análise fenotípica quantitativa.

Introdução

Drosophila melanogaster é um poderoso organismo modelo genético que tem sido usado há décadas para elucidar vias de sinalização molecular e comportamentos celulares. Muitas das vias de sinalização evolutivamente conservadas que são essenciais para o desenvolvimento multicelular foram identificadas pela primeira vez e seu mecanismo de ação definido em Drosophila. Cerca de 65-75% de todos os genes associados a doenças humanas têm ortólogos em Drosophila ^1,2. O olho adulto de Drosophila é um modelo importante que permitiu triagens genéticas imparciais que facilitaram a descoberta de importantes genes conservados implicados em doenças humanas, incluindo câncer ^3,4, neurodegeneração⁵ e distúrbios metabólicos⁶.

O olho da Drosophila é composto por ~ 800 olhos unitários, denominados omatídeos, que são precisamente dispostos em um padrão hexagonal na superfície do olho adulto⁷. Cada omatídio é composto por oito neurônios fotorreceptores que ocupam uma localização distinta dentro de um trapézio assimétrico. Estes são suportados por quatro células cone não neurais e duas células de pigmento primário que secretam lente e pseudo-cone para focalizar a luz nos rabdômeros sensíveis à luz dos neurônios fotorreceptores. Os omatídeos vizinhos são separados por uma única fileira de células de rede interommatidial, compostas por células pigmentares secundárias, células pigmentares terciárias e complexos de cerdas mecanossensoriais ^8,9,10.

Perturbações no desenvolvimento ocular são visíveis em olhos adultos como aumento ou diminuição do tamanho do olho, abundância anormal ou estrutura de lentes ou cerdas, ou como um "olho áspero" onde o padrão hexagonal normalmente invariante é interrompido de tal forma que uma fileira de omatídeos não pode mais ser seguida pela superfície do olho. Esses fenótipos podem ser pontuados no nível do tecido macroscópico usando microscópios de dissecação. A análise detalhada dos fenótipos tradicionalmente inclui microscopia eletrônica de varredura seguida de análise quantitativa de imagens¹¹. No entanto, a microscopia eletrônica de varredura requer instrumentação cara, reagentes caros, preparação de amostras que se estende por dias e, muitas vezes, equipe em tempo integral para manter.

Figura 1: Fluxo de trabalho para imagens de estruturas de Drosophila adultas. (A) Colete e fixe Drosophila adulta em etanol 70%. (B) Prepare amostras para imagem por montagem pontual e fixação em pinos. (C) Adquira imagens de alta resolução por meio de empilhamento e integração de foco. (D) Quantificar imagens usando FIJI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este artigo apresenta um fluxo de trabalho relativamente barato, tem um tempo de preparação de amostra curto, pode ser facilmente configurado em uma bancada de laboratório de 3 pés, não requer materiais perigosos e pode ser uma adição de longa duração aos laboratórios de pesquisa de Drosophila (Figura 1). A montagem pontual é uma técnica entomológica usada para secar ao ar e preservar insetos pequenos e de corpo mole, como Drosophila¹². Este método baseia-se na combinação de objetivas de microscópio com câmeras DSLR de alta resolução para ampliações efetivas de 10x a 1.000x. A profundidade de campo limitada inerente à macrofotografia é superada pelo empilhamento de foco: costurando uma série de imagens com o plano focal se movendo através da amostra de interesse¹³. Este método produz imagens de alta resolução adequadas para a quantificação de fenótipos e pode ser facilmente adaptado para outras estruturas de interesse, como asa, perna, tórax e abdômen. O fluxo de trabalho de análise de imagem usa o programa gratuito de análise de imagem FIJI (NIH ImageJ). Essa metodologia torna a preparação de amostras, imagens de alta resolução e análises acessíveis para estudantes de graduação e cientistas em instituições com poucos recursos.

Protocolo

1. Coleta e fixação de Drosophila adulta

1. Configure cruzamentos de Drosophila ou cepas selecionadas e coloque-as em frascos contendo comida para moscas. Incubar os frascos para injetáveis à temperatura desejada (geralmente 25 °C) até que as moscas se desenvolvam e os adultos se fechem (~10-14 dias a 25 °C).
2. Anestesie as moscas com CO₂ e coloque-as em uma almofada de CO₂ .
3. Separe as moscas com uma pena e selecione os indivíduos com o fenótipo desejado (por exemplo, asas retas). Faça um classificador de moscas de penas aparando uma pena de ganso para caber na extremidade cônica de uma pipeta sorológica de 1 mL.
4. Prepare um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL com 1 mL de etanol a 70%. Coloque as moscas selecionadas no tubo de microcentrífuga e coloque no gelo. Armazene os tubos da microcentrífuga a 4 °C durante a noite (Figura 2A).
   NOTA: Não conserve moscas em etanol por mais de 24 h. O armazenamento prolongado de moscas em etanol a 70% resultará em perda de pigmento dos olhos e do corpo.

2. Preparação da amostra por montagem pontual

NOTA: Drosophila são insetos de corpo mole que se tornam quebradiços e colapsam quando secos ao ar; portanto, este protocolo exige que as amostras sejam fotografadas no mesmo dia em que são montadas. Trabalhe em pequenos conjuntos de ~5 moscas de cada vez para evitar a perda de amostra. Aumente o número de amostras em um conjunto com base na eficiência. Espécimes que requerem mais tempo antes da imagem podem ser desidratados por meio de uma série de concentrações crescentes de hexametildisilazano (HMDS)¹⁴.

1. Corte pequenas pontas triangulares (7,1 mm x 2,7 mm) de cartolina de arquivo de 65 lb usando um punção de ponta especializado. Prepare os pontos dobrando a ponta (25% mais estreitos) em um ângulo de 90° com uma pinça de ponta fina Dumont #5 (Figura 2B).
2. Usando a pinça de ponta fina Dumont #5, remova as moscas dos tubos da microcentrífuga (etapa 1.4). Seque suavemente as moscas com tecido de laboratório sem fiapos para remover o excesso de etanol. Posicione cada mosca do lado esquerdo em um cartão de índice sob um microscópio de dissecação.
   NOTA: Remova as moscas do tubo segurando uma estrutura anatômica que não seja a área de interesse - ao obter imagens da cabeça, seguramos as amostras pela asa ou perna. Não segure as amostras pelo abdômen, pois essa estrutura é usada para colar a mosca na ponta do cartão.
3. Prepare a cola para pele, ajustando sua consistência à viscosidade desejada. Misture 1-2 gotas de cola de couro com 1-2 gotas de água deionizada (DI) e misture com uma pipeta de transferência em um cartão de índice. Pegue uma ponta de cartão preparada na extremidade larga com uma pinça e coloque uma pequena quantidade de cola diluída na ponta dobrada da ponta, esfregando-a na mistura de cola e água (Figura 2C).
   NOTA: A cola deve ser espalhada, mas não escorrendo.
4. Aplique a ponta dobrada da ponta na face anterior do abdômen direito ao redor dos segmentos abdominais 2-3 (Figura 2C). Antes que a cola seque, faça pequenos ajustes na mosca, de modo que o eixo ântero-posterior da mosca fique perpendicular à ponta dobrada da ponta.
5. Insira um pino de montagem nº 3 na extremidade larga da ponta do cartão (Figura 2D) e prenda-o a um bloco de fixação de insetos (Figura 2E). Rotule cada alfinete ou linha de alfinetes com o genótipo correspondente.

Figura 2: Preparação da amostra. (A) Drosophila adulta são classificadas com base em marcadores fenotípicos e coletadas em tubos de microcentrífuga rotulados contendo 70% de etanol em gelo. As moscas são armazenadas a 4 ° C durante a noite. (B) As pontas do cartão de papel são preparadas dobrando a extremidade estreita 90 ° do resto do cartão usando um par de pinças # 5. (C) As moscas são recuperadas dos tubos e deixadas secar brevemente ao ar. A cola de couro é aplicada na extremidade pequena e dobrada da ponta do cartão preparada e colada na mosca adulta nos segmentos abdominais 2-3. (D) As amostras são montadas, com uma etiqueta de identificação, em um pino de inseto de aço inoxidável # 3. (E) As amostras fixadas são armazenadas em uma placa de amostra até que estejam prontas para aquisição de imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Aquisição de imagens de empilhamento de foco de alta resolução

1. Adquira fotografias de alta resolução de olhos de mosca com um sistema de imagem de empilhamento de foco montado e personalizado, montado e personalizado.
   1. Capture fotografias com um corpo de câmera DSLR com uma lente telefoto de 70-200 mm conectada a uma objetiva de microscópio Apo 20x por meio de um adaptador de lente de 77 mm.
   2. Certifique-se de que a amostra esteja iluminada com um flash através de um difusor (Figura 3).
   3. Controle o posicionamento Z usando um controlador Stackshot e um trilho macro.
   4. Conecte a câmera, o flash e o estágio motorizado a um tripé de alumínio anodizado resistente.
2. Posicione cada amostra montada em um gimbal de platina universal com a cabeça orientada de forma que o olho fique voltado para a lente. Faça ajustes na posição da cabeça movendo suavemente a cabeça com a pinça.
   CUIDADO: Ajustes grandes e rápidos podem resultar em decapitação acidental.
3. Com a câmera conectada a um laptop, ajuste as configurações de aquisição no software. Fotografe espécimes com ampliação de 20x com estas configurações: Potência do flash 1/32, Velocidade do obturador 1/200, Abertura F2.8 e ISO 400. Certifique-se de que todos os recursos de foco automático e estabilização de imagem estejam desativados.
   NOTA: Essas configurações equilibram a iluminação ideal do flash, a velocidade do obturador e a profundidade de campo. Eles precisariam ser ajustados para outras ampliações e/ou combinações de lentes.
4. Defina o local para salvar a pilha de imagens resultante (10 a 50 imagens) na pasta de arquivos desejada. Garanta capacidade de armazenamento suficiente para as imagens (~8,5 MB por imagem).
5. Ajuste as configurações da pilha de foco na unidade de controle Stackshot no modo Distância automática .
   1. Defina o tamanho do passo para 5 μm e calcule o número de passos definindo as posições inicial e final da pilha de foco.
   2. View a amostra no modo LiveView e com a câmera no modo de disparo automático para identificar as posições de início e parada.
   3. Mova o trilho para que a parte mais próxima da amostra esteja em foco (defina a posição inicial ) e, em seguida, mova-se para onde a característica de interesse mais distante esteja em foco (defina a posição final ).
6. Retorne a câmera para o modo de disparo manual e inicie a aquisição de imagem a partir da unidade de controle Stackshot.
   NOTA: O tempo de aquisição da imagem depende do tamanho da amostra. Quanto maior a profundidade de campo necessária para espécimes grandes, mais fatias são incluídas na pilha de imagens, o que estenderá o tempo geral de aquisição.
7. Abra arquivos no software de empilhamento de foco referenciado. Gere uma imagem empilhada clicando em Pilha | Alinhar & Empilhar Tudo (PMax).
8. Salve a imagem final no disco rígido do computador como um arquivo .tif clicando em Arquivo | Salve a imagem de saída.
   NOTA: Dependendo da resolução do arquivo de imagem empilhado e do número de espécimes fotografados, discos rígidos externos grandes (1 TB) podem ser necessários para o backup da imagem. Nesse protocolo, as imagens empilhadas têm aproximadamente 100 MB cada antes de serem compactadas.

Figura 3: Aquisição de imagem. (A) Aparelho de imagem com partes rotuladas da seguinte forma: a) Corpo da câmera DSLR; b) lente teleobjetiva; c) Objetiva e Adaptador para Microscópio Apo 20x; d) Flash; e) Difusores de Lentes e Dome; f) Controlador Stackshot, Macro Rail e Estágio Rotativo; g) Gimbal de Palco Universal; h) Tripé. (B) Aparelho de imagem com difusor de luz instalado. (C) Close-up da amostra montada em posição para imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Fluxo de trabalho de análise FIJI para calcular a área dos olhos adultos

1. Para análise de imagens, obtenha o software FIJI¹⁵ no site da ImageJ.net.
2. Escolha imagens para análise em que o olho esteja centralizado e alinhado com iluminação adequada e desfoque periférico mínimo, indicando o alinhamento adequado com a câmera.
3. Calibre a escala da imagem.
   1. Baixe a imagem da barra de escala para ampliação de 20x que se correlaciona com 500 μm. Como alternativa, no momento da aquisição da imagem, fotografe uma régua usando as mesmas configurações. Abra a imagem no FIJI Software.
   2. Meça o comprimento da barra de escala (Figura 4A). Use a ferramenta Linha reta para traçar exatamente a linha. Clique em Analisar | Medir. Esta distância de pixel é equivalente a 500 μm (Figura 4B).
   3. Calcule pixels por mícron. Use isso para converter medições de pixel em medições de micrômetro.
4. Abra o arquivo de imagem empilhado em FIJI (Figura 4C).
5. Selecione Lupa na barra de ferramentas para ampliar a área de foco. Tente preencher a tela com o olho e a cutícula da cabeça imediatamente ao redor (Figura 4D).
6. Selecione Ferramenta de seleção à mão livre na barra de ferramentas. Contorne a área retiniana o mais próximo possível, seguindo os contornos da fileira mais externa de omatídeos (Figura 4E). Para remover parte da seleção, mantenha pressionado o botão de opção e selecione os pixels a serem removidos. Para adicionar à seleção, mantenha pressionados os botões option e shift e selecione os pixels a serem adicionados.
7. Para calcular a área, selecione Analisar | Meça no menu superior (Figura 4F). Uma nova janela aparecerá com os parâmetros área, média, mínimo e máximo . Copie e cole esses dados em uma planilha para documentação e conversão de pixels para medições de micrômetros.
8. Realize análises estatísticas apropriadas.

Figura 4: Análise de imagem em FIJI. (A) Dimensione a imagem original. Baixe a imagem de calibração e meça o comprimento da barra de 500 μm. (B) Ajuste a escala usando a função Set Scale . (C) Abra a imagem empilhada. (D) Amplie a imagem para que o olho fique centralizado e quase em tela cheia. (E) Use a ferramenta Seleção à mão livre para delinear o olho na borda entre a fileira mais externa de omatídeos e a cutícula circundante. (F) A medida da área dentro da região selecionada é calculada clicando em Analisar | Medida | Área. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

O olho de Drosophila é um excelente sistema modelo para estudar padrões de tecidos, controle de crescimento e morte celular. Recentemente, publicamos um estudo investigando como o pH intracelular (pHi) influencia o crescimento do tecido. Primeiro, estabelecemos um sistema genético em que a superexpressão do trocador de sódio-prótons DNhe2 (o ortólogo do NHE1 de mamíferos) no olho em desenvolvimento causa defeitos de padronização e aumento da proliferação¹⁶. O aumento da proliferação com maior pHi é observado em todas as espécies, de leveduras a mamíferos¹⁷. No entanto, também observamos que, com o aumento do pHi, o olho adulto parecia menor em tamanho em comparação com os controles.

A análise quantitativa da área do olho adulto foi feita para determinar como a expressão elevada de DNhe2 diminui o tamanho do tecido no olho de Drosophila . Primeiramente, adquirimos imagens de baixa resolução usando um microscópio de inserção ocular (Figura 5A), mas estas eram de qualidade insuficiente para realizar medidas quantitativas. Especificamente, as bordas do olho não estão em foco, impedindo assim uma medição precisa da área dos olhos.

Medimos a área de cada olho em imagens de alta resolução de olhos adultos de Drosophila (Figura 5B). As moscas que expressam GMR>DNhe2 tinham olhos significativamente menores (média de 74,28 μm²) do que as moscas de controle genético w¹¹¹⁸ (média de 125,83 μm²) ou o controle condutor GMRGAL4 moscas heterozigóticas (média de 142,49 μm²), o que representa uma redução de 41% e 48% na área, respectivamente (Figura 5C). Essa diminuição no tamanho do olho, apesar do aumento da proliferação, pode ser atribuída a níveis elevados de morte celular.

Genes de autofagia conhecidos, incluindo Atg1, que induz a formação de fagóforos, foram usados em estudos de interação genética (Figura 5). Os efeitos no tamanho do olho adulto foram quantificados usando fotografia de alta resolução e análise de área (Figura 5B). O tamanho do olho foi restaurado (129,9 μm² vs 74,28 μm²) em moscas GMR>DNhe2 heterozigotas para Atg1³ em comparação com GMR>DNhe2 sozinho e foi semelhante aos controles (Figura 5C). Combinado com a análise de marcadores moleculares, nossos resultados apóiam o aumento da morte celular autofágica em pHi mais alto.

Figura 5: Resgate da diminuição do tamanho da retina associada ao aumento do pH intracelular com diminuição da autofagia. (A) Imagens de baixa resolução de olhos de moscas adultas tiradas com um microscópio de inserção ocular. (B) Imagens de alta resolução de olhos de moscas adultas usadas para quantificação do tamanho dos olhos para os seguintes genótipos: w¹¹¹⁸; GMRGAL4; GMR>DNhe2; GMRGAL4; Atg1³; GMR>DNhe2; Atg1³. (C) Os tamanhos médios dos olhos adultos medidos foram: w¹¹¹⁸ (125,83 μm², N = 7); GMRGAL4 (142,49 μm², N = 9) e GMR>DNhe2 (74,28 μm², N = 6), GMRGAL4; Atg1³ (146,4 μm², N = 15); GMR>DNhe2; Atg1³ (129,9 μm², N = 19) e indicado por mostrar valores medianos com intervalos interquartis. A significância estatística foi determinada por testes t não pareados com correção de Welch. Os dados em B e C foram publicados anteriormente¹⁸. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nossas conclusões são reforçadas pela preparação da amostra, imagens de alta resolução e a análise descrita aqui. Esses métodos permitiram uma descrição precisa e quantitativa do tamanho dos olhos adultos de Drosophila com vários genótipos. Continuamos a usar essa abordagem para avaliar outras interações genéticas que elucidarão os mecanismos de controle de crescimento dependente do pH.

Discussão

Aqui descrevemos um método para preparação de amostras, imagens de alta resolução e análise de estruturas adultas de Drosophila . O olho de Drosophila é um sistema modelo geneticamente tratável que produziu insights críticos sobre os mecanismos moleculares subjacentes a doenças, incluindo câncer¹⁹, neurodegeneração²⁰ e doenças metabólicas²¹. Em particular, os "avatares" de pacientes com câncer são gerados onde Drosophila transgênica portadora de mutações oncogênicas são geradas e podem ser usadas para triagem de medicamentos de alto rendimento²². Embora nos concentremos no olho adulto, este protocolo pode ser adaptado para analisar outras estruturas de interesse, como asa, perna, tórax e abdômen.

Habilidades motoras finas são necessárias em várias etapas críticas deste protocolo. A preparação da amostra da Drosophila adulta por montagem em ponto requer paciência e prática. Aconselhamos os iniciantes a praticar a montagem em pontos antes de preparar amostras raras ou preciosas. Existem várias etapas críticas que exigirão a prática de habilidades motoras finas e atenção cuidadosa.

As primeiras etapas críticas do protocolo são a preparação dos pontos do cartão e a aplicação da cola para aderir o ponto do cartão ao abdômen (etapa do protocolo 2.4-2.5). É importante aplicar a quantidade certa de cola porque as estruturas anatômicas alvo (ou seja, a cabeça) podem ser cobertas por cola se for aplicada muita ou se não tiver a consistência certa. A amostra também deve ser colada em uma posição apropriada, com o eixo ântero-posterior perpendicular ao pino de montagem. A segunda etapa crítica é posicionar a cabeça para imagens de alta resolução (etapa 3.2 do protocolo). É crucial que a cabeça esteja orientada com o olho voltado para a lente da câmera. Para ajustar a cabeça, pequenos ajustes são feitos com uma pinça. Movimentos suaves e incrementais são cruciais, pois a decapitação acidental pode ocorrer com ajustes grandes ou fortes. Uma etapa adicional em que as habilidades motoras finas são necessárias é ao usar a ferramenta Seleção à mão livre na barra de ferramentas FIJI (etapa 4.6 do protocolo). Aqui, é crucial traçar o mais próximo possível da fileira externa de omatídeos do olho. Essa precisão é fundamental para medições rigorosas e reprodutíveis da área do olho (Figura 4E).

Métodos de imagem, como microscopia eletrônica de varredura (SEM), continuam sendo a principal abordagem para visualizar e analisar estruturas externas. No entanto, os protocolos de SEM exigem que o usuário manuseie produtos químicos perigosos e opere vários instrumentos, incluindo secadores de pontos críticos, aparelhos de revestimento por pulverização catódica e o próprio SEM. A preparação da amostra leva vários dias e requer treinamento e habilidade intensivos. Um desafio significativo que as instituições acadêmicas enfrentam é o investimento financeiro e o compromisso com a manutenção do instrumento e, em nossa experiência, o pessoal com experiência em manutenção e operação desse equipamento geralmente não é apoiado em nível institucional. Nosso protocolo reduz o custo e elimina a exposição a produtos químicos perigosos ao custo de imagens de baixa resolução em comparação com o SEM.

O sistema descrito neste estudo era um pacote pré-montado, mas sua natureza modular permite reduzir o custo substituindo componentes individuais por equipamentos fabricados internamente (por exemplo, estágios de amostra, difusores de flash), marcas ou modelos alternativos ou equipamentos que já podem estar presentes no laboratório. Embora a conexão de objetivas de microscópio a câmeras macro esteja aumentando em popularidade entre amadores e fotógrafos profissionais, algumas tentativas e erros podem ser necessárias para diferentes combinações de objetivas e lentes. Para replicar o sistema descrito aqui, uma objetiva de microscópio com correção infinita deve ser conectada a uma lente de tubo (lente telefoto aqui) com um adaptador de rosca apropriada. Outra consideração ao trocar componentes é garantir que a distância de trabalho da lente seja compatível com as dimensões do suporte da câmera, do suporte da amostra e do trilho de macrofoco. Finalmente, o software de empilhamento de foco selecionado aqui é comercial, mas existem muitas soluções de empilhamento de foco de pós-processamento gratuitas ou de baixo custo, incluindo plug-ins ImageJ.

Embora este protocolo exija prática para dominar as técnicas de manuseio de amostras, ele foi projetado para adquirir e analisar imagens de alta resolução para análise fenotípica detalhada. Os procedimentos aqui apresentados constituem uma alternativa rápida e de baixo custo às metodologias tradicionais de imagem. Ao usar técnicas de imagem digital baseadas em freeware para análise quantitativa, nossa metodologia é acessível e não exigirá compras ou atualizações de software caras. A configuração da imagem requer algum custo e esforço, mas, uma vez estabelecida, deve ser uma adição de longa duração aos laboratórios de Drosophila . Este método produz imagens de alta resolução adequadas para a quantificação de fenótipos e pode ser facilmente adaptado para outras estruturas de interesse, como asa, perna, tórax e abdômen. Essa metodologia torna a preparação de amostras, imagens de alta resolução e análises acessíveis para estudantes de graduação e cientistas em instituições com poucos recursos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pipeta sorológica de 1 mL	ThermoFisher Scientific	170353N
Tubos de microcentrífuga de 1,7 mL	Genesee Scientific	24-282LR
20x Objetiva de Microscópio Apo	Mitutoyo Corp.	378-804-3
Arquivo de cartão de 65 lb	Neenah, Inc.	91901
Canon EF 70-200 mm USM II lente telefoto	Canon	3044C002
Canon EOS 6D Mark II Corpo da Câmera DSLR	Canon	1897C002
Difusor Dome	Soluções Macroscópicas	Difusor PA-DIF-GIM-SM
para Mitutoyo M Plan APO Objectives	Macroscópicas	mitutoyo-difusores
Drosophila ampolas e plugues	Genesee Scientific	32-117BF
Dumont #5 pinças de ponta fina	Fisher Scientific	NC9889584
Penas de ganso	Amazon	B01CMMJI6U
Tripé de alumínio anodizado resistente	Really Right Stuff, LLC	TFA-32G
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	tecido de laboratório sem fiapos
Câmera digital Levenhuk M1000 Plus	Pino de montagem Levenhuk	70358
No. 3	Indigo Instruments	33414-3
Nutri-Fly Bloomington Drosophila media	Genesee Scientific	66-113	comida para moscas
Point-Punch	MC Mieth Manufacturing, Inc.	448Detalhe
Screwknob Clamp	Really Right Stuff, LLC	SK-Clamp	Para prender o trilho macro ao tripé
Stackshot Controller e Macro Rail	Cognisys Inc.
Adaptador de Anel Abaixador	de lente de 763461174207	de câmera RAF	para conectar a objetiva do microscópio à lente da câmera
Cola Titebond	Franklin International	5013
Yongnuo YN-24-EX Macro Twin Lite Flash	Shenzhen Yongnuo Photographic Equipment Co.	YN-24EX
strong>Software
Canon EOS Utility (v. 3.16.1).	software de aquisição	da Canon
FIJI	National Institutes of Health		Fiji é lançado como código aberto sob a GNU General Public License.  Versão 2.14.0/1.54f da FIJI;
GraphPad Prism	GraphPad Software, Boston, Massachusetts EUA		Prism Versão 10.3.1
Zerene Stacker (v.1.04)	Zerene Systems, LLC		Focus Stacking Software