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Artigo de método

Modelagem do consumo de álcool em roedores usando o consumo de álcool em gaiola doméstica de escolha de duas garrafas e análise microestrutural

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DOI:

10.3791/67486

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8 de novembro de 2024

 ,  , 
1Center for Alcohol Research in Epigenetics, Department of Psychiatry, University of Illinois Chicago

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um paradigma padrão de consumo doméstico de duas garrafas de acesso intermitente para modelar o consumo de álcool em ratos. Além disso, fornece instruções passo a passo para aumentar o protocolo padrão com um sistema de detecção de lambedura DIY que permite a análise microestrutural do comportamento de beber.

Resumo

O consumo de bebidas alcoólicas em gaiolas domésticas com duas garrafas é um dos paradigmas mais amplamente utilizados para estudar o consumo de etanol em roedores. Em sua forma mais simples, os animais têm acesso a duas garrafas de bebida, uma das quais contém água da torneira comum e a outra etanol, com ingestão diária medida pela mudança no peso da garrafa durante o período de 24 horas. Consequentemente, essa abordagem não requer equipamento de laboratório especializado. Embora essa facilidade de implementação seja provavelmente o maior contribuinte para sua ampla adoção por pesquisadores pré-clínicos de álcool, a resolução dos dados de consumo adquiridos usando essa abordagem é limitada pelo número de vezes que o pesquisador mede o peso da garrafa (por exemplo, uma vez ao dia). No entanto, o desejo de examinar os padrões de consumo no contexto da ingestão geral, intervenções farmacológicas e manipulações neuronais levou ao desenvolvimento de sistemas de detecção de lambidas em gaiolas domésticas que podem adquirir dados no nível de lambidas individuais. Embora vários desses sistemas tenham sido desenvolvidos recentemente, o sistema de código aberto, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device), atraiu atenção significativa no campo por sua acessibilidade e facilidade de uso. Embora emocionante, este sistema foi projetado para uso em camundongos. Aqui, revisamos os procedimentos apropriados para beber em gaiola doméstica de escolha de duas garrafas padrão e equipado com lickometer. Também introduzimos métodos para adaptar o sistema LIQ HD a ratos, incluindo modificações de hardware para acomodar um tamanho de gaiola maior e um suporte de garrafa impresso em 3D redesenhado compatível com garrafas padrão prontas para uso. Usando essa abordagem, os pesquisadores podem examinar os padrões diários de consumo, além dos níveis de ingestão em muitos ratos, em paralelo, aumentando assim a resolução dos dados adquiridos com investimento mínimo em recursos adicionais. Esses métodos fornecem aos pesquisadores a flexibilidade de usar garrafas padrão ou um aparelho equipado com licômetro para interrogar os mecanismos neurobiológicos subjacentes ao consumo de álcool, dependendo de suas necessidades experimentais precisas.

Introdução

Embora o uso moderado de álcool tenha sido historicamente associado a benefícios moderados para a saúde, estudos abrangentes recentes em larga escala revelaram que nenhuma quantidade de consumo de álcool é segura1,2. Na verdade, o uso de álcool é o7º principal fator de risco para morte e incapacidade globalmente1 com indivíduos que bebem até mesmo pequenas quantidades de álcool tendo risco aumentado de câncer, doenças infecciosas e lesões1,3. Nos Estados Unidos, as mortes por uso de álcool aumentaram quase 30% entre 2016 e 20214. É importante ressaltar que o risco de morte e incapacidade aumenta monotonicamente com o aumento do consumo1.

Embora estudos em humanos tenham fornecido informações valiosas sobre a neurobiologia do uso e abuso de álcool, o controle experimental proporcionado por modelos animais é crucial para uma compreensão profunda dos mecanismos subjacentes ao comportamento de beber e ao risco de beber muito. Esses modelos também são ferramentas valiosas para o desenvolvimento de tratamentos que visam reduzir o consumo descontrolado. O consumo de duas garrafas em gaiolas domésticas é um dos paradigmas pré-clínicos mais amplamente utilizados para estudar o consumo de álcool em roedores. Isso se deve, em grande parte, à sua facilidade de implementação, pois permite a medição do consumo voluntário total de álcool e preferência sem a necessidade de equipamentos de pesquisa especializados ou análises complexas. Usando essa abordagem, os pesquisadores podem coletar medições nos intervalos desejados (por exemplo, horas, dias, semanas) calculando a mudança no peso da garrafa do início ao fim de uma sessão de bebida. Variações desse método básico têm sido usadas por muitos no campo para facilitar níveis baixos a moderados a excessivos de ingestão de álcool em curtos e longos períodos de tempo. Por exemplo, procedimentos contínuos e intermitentes de escolha de duas garrafas foram usados para facilitar níveis baixos e moderados de ingestão de álcool, respectivamente, em camundongos5 e ratos6,7,8. Os mesmos paradigmas podem promover altos níveis de ingestão em cepas preferenciais ao álcool7,9. Alternativamente, uma adaptação deste método que limita o acesso ao álcool a 2-4 h por dia, começando aproximadamente 3 h após o início do ciclo escuro, demonstrou gerar consumo excessivo de álcool em camundongos (ou seja, Drinking in the Dark)10,11. Variações adicionais desses métodos têm sido usadas em conjunto com métodos que facilitam a dependência do álcool (ou seja, exposição crônica intermitente ao vapor de etanol) para examinar a escalada do consumo voluntário de álcool durante a abstinência12,13,14,15,16,17,18,19.

Embora amplamente adotada pelo campo, a abordagem padrão de medir a ingestão de álcool pela mudança no peso da garrafa é limitada em resolução ao consumo total por sessão de bebida. Consequentemente, essa abordagem é incapaz de capturar padrões de consumo, que são bem conhecidos por afetar tanto o risco quanto a gravidade do transtorno por uso de álcool (AUD)20,21,22. De fato, a ingestão média de um indivíduo ao longo do tempo pode ser consequência de vários episódios de consumo excessivo de álcool ou muitos episódios de consumo, cada um associado a um consumo relativamente baixo, e essas nuances não são detectadas quando o consumo é medido como ingestão total por sessão de consumo. É importante ressaltar que significativamente mais episódios de consumo associados a grandes crises de consumo (ou seja, engolir) são observados em indivíduos com AUD em relação a controles saudáveis23 e dados em primatas não humanos sugerem que indivíduos que estabelecem um padrão de consumo de álcool que inclui grandes crises de consumo de álcool no início de sua história de consumo de álcool correm um risco significativo de AUD22. Além disso, episódios de consumo de álcool que incluem grandes períodos de consumo aumentam significativamente o risco de morbidade e mortalidade, independentemente do diagnóstico de AUD21. Ao todo, esses dados levaram a um aumento do interesse em examinar os padrões de consumo, além dos níveis de ingestão geral em modelos pré-clínicos e levaram ao desenvolvimento de vários sistemas de complexidade variável que são capazes de capturar dados de consumo no nível de lambidas individuais.

Entre os primeiros estava o desenvolvimento de um sistema de duas garrafas equipado com detecção de lambida de feixe de fotos projetado para uso em camundongos24. Este sistema foi posteriormente adaptado por um grupo separado para uso em ratos25. Nos anos seguintes, variações sobre esse tema foram usadas para desenvolver sistemas semelhantes contidos em alojamentos personalizados para roedores26, que permitem a detecção de lambeduras de animais individuais alojados socialmente27,28, e que capturam o comportamento alimentar e de beber29. Entre estes, o LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device)30 atraiu atenção significativa por oferecer um sistema para uso em camundongos que se assemelha à facilidade de implementação e acessibilidade do sistema desenvolvido por Godnyuck et al.24. Este sistema utiliza detecção capacitiva para detectar diretamente o contato entre a língua e o tubo condutor do sipper de metal, ao contrário de medidas indiretas, como abordagem ou interação do sipper, que são oferecidas usando o sistema de detecção de feixe de fotos. Os autores fornecem dados que demonstram que seu sistema de detecção capacitiva oferece precisão e sensibilidade significativamente maiores na detecção de lambidas, produzindo correlações mais fortes entre o número de lambidas e a mudança no peso da garrafa do que a detecção de feixes de fotos. Os autores demonstram ainda a capacidade de usar este sistema em conjunto com um paradigma de consumo doméstico de gaiola de escolha de duas garrafas de acesso contínuo para capturar medidas da microestrutura do consumo de álcool, além de medidas de ingestão diária geral30.

Aqui, descrevemos procedimentos para o consumo de álcool em gaiola doméstica de escolha de duas garrafas usando uma abordagem padrão, bem como métodos que permitem a detecção de lambedas (Figura 1). Também introduzimos métodos para construir e implementar LIQ HDR - uma adaptação do LIQ HD30 para uso em ratos que inclui modificações de hardware para acomodar tamanhos de gaiola maiores e um suporte de garrafa impresso em 3D redesenhado compatível com garrafas padrão prontas para uso. Esses métodos fornecem aos pesquisadores a flexibilidade de usar uma abordagem padrão ou equipada com licômetro, dependendo de seus recursos experimentais e necessidades de coleta de dados.

Abaixo está uma descrição dos materiais necessários e instruções passo a passo para capturar o consumo de bebidas alcoólicas em gaiolas domésticas usando o procedimento de consumo de duas garrafas de acesso intermitente adaptado de Simms et al.7. Neste procedimento, os ratos têm acesso 24 horas a dois bebedouros, 7 dias por semana. Às segundas, quartas e sextas-feiras (MWF), os ratos recebem uma garrafa contendo água (H2O) e outra garrafa contendo etanol (EtOH). Essas garrafas são removidas às terças, quintas e sábados (TRS) e substituídas por duas garrafas de água. Os ratos bebem das mesmas duas garrafas de água aos sábados e domingos. Observe que esses métodos podem ser facilmente ajustados para horários alternativos de acesso ao etanol (por exemplo, contínuo, compulsão, etc.), se desejado. Instruções separadas são fornecidas para abordagens padrão e equipadas com licômetro.

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Protocolo

Todos os dados representativos foram coletados usando ratos adultos Long-Evans mantidos individualmente, com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Illinois em Chicago e de acordo com as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A criação individual é necessária para monitorar com precisão o consumo de fluidos por cada sujeito. Ratos adultos machos (n = 38) e fêmeas (n = 22) da linhagem Long-Evans tinham entre P50-80 ao chegarem e foram mantidos em aclimatação ao biotério por uma semana antes do início do experimento. Os ratos tinham acesso ad libitum à ração padrão (Teklad 7912, Envigo) e água, salvo indicação em contrário.

1. Preparação antes do experimento

  1. Rotule as garrafas de bebida como H2O ou EtOH. Em seguida, identifique com um código exclusivo para cada rato uma garrafa de H2O e uma de EtOH para as segundas, quartas e sextas-feiras (MWF) e duas garrafas de H2O para terças e quintas-feiras (TRS).
    NOTA: Opcionalmente, utilize fitas de cores diferentes para identificar as garrafas de H2O e EtOH, ajudando a evitar erros durante a troca das garrafas.
  2. Encha as garrafas de H2O com água potável um dia antes da data de início do experimento. Prepare a solução de EtOH misturando EtOH de 190 graus com água potável (20% v/v) um dia antes da data de início do experimento.
    CAUÇÃO: É fundamental que o EtOH utilizado seja não desnaturado, pois o EtOH desnaturado é tóxico.
  3. Prepare uma gaiola vazia na mesma prateleira dos ratos que participam do experimento. Essa gaiola será usada para calcular o derramamento.
  4. Equipe as gaiolas com o sistema LIQ HDR, se for utilizá-lo (ver passo 3, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6 e Figura Suplementar 1).
  5. Determine o horário exato do dia para a troca das garrafas antes do início do estudo. As garrafas devem ser substituídas no mesmo horário todos os dias para obter uma medida precisa do consumo em 24 h.
    NOTA: Pesquisas anteriores mostraram que os roedores apresentam o maior grau de consumo logo após o início do ciclo escuro10,31. Portanto, para capturar o consumo durante esse período de alta atividade (ver passo 2.3.1 para capturar o consumo semelhante a compulsão), recomenda-se que a troca das garrafas ocorra entre 30 e 60 minutos após o desligamento das luzes. Utilize lâmpadas vermelhas durante a troca para permitir a visualização sem interromper o ciclo claro-escuro.

2. Procedimentos diários e manutenção

  1. No primeiro dia do experimento, realize o seguinte.
    1. Remova as garrafas-padrão de água das gaiolas.
    2. Opcional: os ratos frequentemente movimentam a tampa da gaiola enquanto procuram alimento, o que pode causar derramamento que não pode ser corrigido pela gaiola de controle de derramamento. O uso de copos de alimento dentro da gaiola pode atenuar esse problema. Se for utilizá-los, remova o alimento da parte superior da gaiola agora, adicione um copo de alimento dentro da gaiola e encha-o com ração. Certifique-se de que o espaço no piso destinado ao rato ainda atenda às diretrizes institucionais com base no tamanho da gaiola e do copo de alimento.
    3. Informe ao pessoal de cuidados e manejo, conforme aplicável, que a equipe de pesquisa fornecerá alimento e água durante toda a duração do experimento.
    4. As trocas de gaiolas podem interferir na coleta de dados. Realize as trocas de gaiolas simultaneamente à obtenção das medidas de peso corporal. Os pesquisadores que optarem por fazer isso devem informar adequadamente seu pessoal de cuidados e manejo.
  2. Nos dias subsequentes, siga os procedimentos descritos abaixo.
    NOTA: Lembre-se de que qualquer movimentação das gaiolas e garrafas pode causar derramamento. Portanto, é importante ser cuidadoso com os movimentos e utilizar os mesmos métodos de colocação e remoção das garrafas na gaiola de controle de derramamento que são usados nas gaiolas de ratos.
    1. Entre na sala antes do horário de troca das garrafas, garantindo tempo suficiente para executar os passos abaixo, e coloque as garrafas novas nas gaiolas no horário de início apropriado da sessão.
    2. Remova as tampas com filtro das gaiolas. Se for segunda, quarta ou sexta-feira, prossiga para o passo 2.2.3. Se for terça, quinta ou sábado, prossiga para o passo 2.2.4.
    3. Nas segundas, quartas e sextas-feiras, remova as garrafas TRS das tampas das gaiolas. Pese as garrafas MWF (uma de EtOH e uma de H2O). Registre o peso inicial da garrafa para a sessão de consumo de hoje. Forneça alimento adicional na parte superior da gaiola ou nos copos de alimento, se necessário. No horário designado para início da sessão, coloque as garrafas na tampa da gaiola de cada rato com a fita voltada para cima, para que os ratos não mastiguem o rótulo da garrafa.
      NOTA: Normalmente, o consumo de água não é registrado nem relatado para TRS, mas os pesquisadores podem opcionalmente coletar esses dados obtendo os pesos de entrada e saída das garrafas conforme descrito abaixo nos passos 2.2.3 e 2.2.4, se desejado. O lado da garrafa de EtOH deve ser alternado após cada sessão de consumo para evitar o desenvolvimento de preferência por um lado, o que poderia inadvertidamente distorcer os dados de consumo.
      1. Opcional: trabalhos anteriores mostraram que muitos ratos exibem consumo semelhante a compulsão no início da sessão de consumo8,32,33. A maioria dos pesquisadores que registram o consumo compulsivo durante esse período relata a ingestão nos primeiros 30-60 minutos da sessão. Para obter dados de ingestão durante esse possível episódio de compulsão, siga os passos descritos abaixo.
      2. Acione um cronômetro após colocar as garrafas na última gaiola. Deixe a sala sem perturbações durante o período cronometrado.
      3. Reentre na sala quando o cronômetro soar. Remova as garrafas de EtOH e H2O e registre os pesos das garrafas. Devolva as garrafas de EtOH e H2O às gaiolas.
        NOTA: Este passo não é necessário para registrar episódios de compulsão quando se utiliza um sistema equipado para detecção de lambidas.
    4. Nas terças, quintas e sábados, remova as garrafas MWF das gaiolas no horário designado de término da sessão, correspondente a 24 h após o horário de início. Pese cada garrafa e registre o peso final da garrafa para a sessão de consumo MWF. Obtenha e registre o peso corporal de cada rato. Se necessário, forneça alimento adicional na parte superior da gaiola ou nos copos de alimento. Coloque as garrafas de H2O TRS na parte superior da gaiola de cada rato com a fita voltada para cima, para que os ratos não mastiguem o rótulo da garrafa.
    5. Devolver as tampas com filtro às gaiolas e sair da sala dos animais.
      NOTA: Opcionalmente, cubra os bicos das garrafas de EtOH para evitar evaporação. Se as trocas de gaiolas estiverem sendo realizadas pela equipe de pesquisa, designe um dia por semana durante as tarefas TRS para realizar essa atividade. Coloque cada rato em uma gaiola limpa após obter o peso corporal.
  3. Lave as garrafas e reabasteça os fluidos regularmente, semanal ou quinzenalmente, conforme os procedimentos institucionais de cuidados e manejo com animais. Tenha cuidado para realizar essas tarefas de maneira que não interrompa as sessões de consumo. Por exemplo, as garrafas de H2O TRS podem ser lavadas e reabastecidas após a remoção nas segundas, quartas e sextas-feiras. Da mesma forma, as garrafas de H2O e EtOH MWF podem ser lavadas e reabastecidas após a remoção nas terças, quintas e sábados.

3. Detecção de lambeduras durante experimentos de escolha em duas garrafas

OBSERVAÇÃO: Pesquisadores interessados em obter dados de consumo com alta resolução podem modificar o procedimento acima adicionando capacidades de detecção de lambidas às garrafas. O LIQ HD30 é um sistema de baixo custo e de montagem caseira (DIY) que permite esse tipo de coleta de dados em camundongos. Os procedimentos descritos abaixo detalham as modificações necessárias para adaptar o LIQ HD para uso em ratos (denominado LIQ HDR). Consulte a Tabela de Materiais para obter a lista de todos os componentes comercialmente disponíveis e peças personalizadas impressas em 3D necessárias para construir um sistema de detecção de lambidas, capaz de registrar dados de escolha entre duas garrafas para até 18 ratos. Os arquivos .stl para impressão 3D e as instruções podem ser encontrados no site do autor (www.ejgloverlab.com/3dprints).

  1. Configuração de unidades de sensores capacitivos
    OBSERVAÇÃO: Cada sistema LIQ HDR é composto por três unidades de sensores capacitivos, que juntas capturam dados de lambidas de 36 garrafas em paralelo, correspondendo a 18 ratos mantidos individualmente. Cada unidade de sensor consiste em um diferencial I2placa de expansão C communication e uma placa de sensor capacitivo de 12 teclas, que se conectará aos lickômetros de seis gaiolas separadas por meio de seis pares de cabos de 2 pinos codificados por cores para cada lickômetro (Figura 2A).
    1. Reúna os materiais necessários para a construção das três unidades de sensores capacitivos, conforme mostrado em Figura 2B, juntamente com as ferramentas necessárias de soldagem.
    2. Para começar a montar a unidade sensora A, cubra um cabo conector fêmea de 2 pinos com uma mangueira retrátil térmica vermelha com 7 polegadas de comprimento, insira as extremidades dos fios vermelho e preto nos pinos #0 e #1 da placa do sensorFigura 2C-1) e soldar no lugar (Figura 2C-2). Certifique-se de que o cabo esteja na parte frontal da placa do sensor, conforme mostrado, para dispor as gaiolas em ordem numérica da esquerda para a direita no vivário, sem sobreposição dos cabos e sem comprometer potencialmente o registro (ver etapa 3.6 e Figura 6).
    3. Cubra mais cinco cabos com tubos termorretráteis de cores distintas e solde-os aos pinos de #2 a #11 conforme mostrado (Figura 2C-3). Certifique-se de que todos os fios vermelhos estejam soldados aos pinos de número par, que serão conectados a todas as garrafas do lado esquerdo, e de que todos os fios pretos estejam soldados aos pinos de número ímpar, que serão conectados a todas as garrafas do lado direito.
    4. Cubra as juntas de solda com cola quente em todos os lados para proteção (Figura 2C-4). Rotule os conectores em ordem numérica, fornecendo um ID exclusivo para cada lickômetro (Figura 2C-4).
    5. Para montar a unidade sensora A, conecte a placa sensora A a um EndPoint de comunicação com um cabo de 4 pinos de 50 mm e conecte o EndPoint à saída de 3,3 V do conversor de níveis de 5 V para 3 V com um cabo de 4 pinos de 100 mm (Figura 2D-1). Embora a placa sensora e a placa de expansão de comunicação possuam dois conectores idênticos de 4 pinos, é ainda importante certificar-se de que a fiação esteja exatamente como mostrado (Figura 2D-1 e Figura 2F) para utilizar as carcaças de sensores impressas em 3D e a configuração sugerida do vivário (ver passo 3.6 e Figura 6). Coloque a unidade sensora A dentro do invólucro impresso em 3D (Figura 2D-2). Feche suavemente a tampa, tomando cuidado para não esmagar o cabo do conversor de nível (Figura 2D-3).
    6. Modificar o I2C endereços das placas de sensor B e C soldando um fio jumper do pino ADDR ao pino 3Vo ou SDA conforme indicado (Figura 2E).
    7. Solde seis cabos conectores fêmea codificados por cores nas placas de sensor B e C, utilizando a mesma ordem usada para a placa A. Identifique cada conector com o número de identificação (ID) correspondente do lickômetro. Conecte a placa B ao ponto de interrupção de comunicação MidPoint e a placa C a um EndPoint, utilizando cabos de 4 pinos de 50 mm (Figura 2F).
    8. Coloque as unidades sensoras B e C em suas respectivas caixas impressas em 3D. Conecte em série as três unidades sensoras com cabos Ethernet para concluir a configuração dos sensores (Figura 2G).
  2. Configuração da interface do microcontrolador
    OBSERVAÇÃO: A interface do microcontrolador LIQ HDR (Figura Suplementar 1A) é o mesmo descrito para LIQ HD30 com modificações muito pequenas. Os procedimentos descritos abaixo fornecem uma visão geral dos passos necessários para configurar a interface, com as modificações descritas nas etapas 3.2.6 e 3.2.8. Os pesquisadores devem consultar o protocolo original e o tutorial em vídeo disponibilizado na página do autor no GitHub para obter instruções passo a passo mais detalhadas30.
    1. Reúna os materiais e as ferramentas de soldagem necessários para montar a interface do microcontrolador (Figura Suplementar 1B). No lado traseiro do escudo tátil (Figura Suplementar 1C-1), crie uma ponte de solda nos terminais de solda traseiros do painel luminoso (Figura Suplementar 1C-2).
    2. No lado traseiro do escudo de registro de dados, corte o traço da pad de jumper do pino CS (Figura Suplementar 1D-1). No lado frontal do registrador de dados, soldar um fio jumper curto do pino CS ao pino nº 7 (Figura Suplementar 1D-2).
    3. Para instalar os conectores de empilhamento do shield, primeiro empilhe-os na parte traseira do shield da tela sensível ao toque (Figura Suplementar 1E-1). Empilhe o registrador de dados na tela sensível ao toque, use fita para estabilizar e solde todos os pinos de conexão no registrador de dados (Figura Suplementar 1E-2). Em seguida, remova a tela sensível ao toque.
    4. Empilhe o cabeçalho 2 x 3 restante no microcontrolador (Figura Suplementar 1F-1), depois empilhe o registrador de dados sobre o microcontrolador antes de soldar os pinos de cabeçalho no lugar (Figura Suplementar 1F-2).
    5. Insira a bateria de moeda no registrador de dados (Figura Suplementar 1G-1). Empilhe a tela sensível ao toque sobre o registrador de dados (Figura Suplementar 1G-1). Insira o cartão microSD juntamente com seu adaptador no datalogger (Figura Suplementar 1G-2).
    6. Para fazer o fio de aterramento extra, corte um conector macho de um fio jumper e descasque a extremidade até cerca de 1/4 de polegada (Figura Suplementar 1H-1). Solde um fio de núcleo sólido descascado ao fio jumper e cubra a junção soldada com uma bainha termorretrátil (Figura Suplementar 1H-2).
    7. Conecte os fios jumper de 4 pinos e o fio de aterramento extra ao microcontrolador (Preto - GND, Vermelho - 5V, Amarelo - pino #21, Azul - pino #20) Figura Suplementar 1I-1). Fixe as conexões com cola quente (Figura Suplementar 1I-2). Opcionalmente, envolva os fios jumper com tubo termorretrátil (Figura Suplementar 1I-2).
    8. Acomode a interface do microcontrolador totalmente montada na caixa impressa em 3D, com os fios jumper de 4 pinos e o fio de aterramento passados pela abertura na parte superior (Figura Suplementar 1J).
    9. Siga o protocolo original para a instalação do software de interface do microcontrolador30.
  3. Construção de lickômetros LIQ HDR
    OBSERVAÇÃO: A impressão 3D personalizada que sustenta os frascos foi projetada para uso com um frasco padrão para roedores com diâmetro do tubo bebedor de 8 mm (consulte Tabela de Materiais Figura 3A). Este suporte para frascos pode ser facilmente adaptado para uso com frascos e tubos de bebedouro semelhantes, com pequenas modificações ou nenhuma modificação.
    1. Reúna os materiais, impressões 3D e ferramentas de soldagem necessários para a construção de um lickômetro conforme mostrado em Figura 3B. Observe que cada sistema LIQ HDR comporta no máximo 18 lickômetros para 36 garrafas.
    2. Para prolongar o cabo do conector macho, descasque ambas as extremidades por cerca de 1/4 de polegada de comprimento, bem como os fios preto e vermelho da extensãoFigura 3C-1).
    3. Solde os fios de extensão ao cabo do conector (Figura 3C-2) e cubra as soldas com tubo termorretrátil (Figura 3C-3). Cubra o cabo do conector macho com uma mangueira retrátil térmica cuja cor corresponda à do conector fêmea correspondente na unidade do sensor (Figura 3C-4).
    4. Para ser consistente com a fiação da placa do sensor (Figura 2), passe o fio vermelho e o fio preto, respectivamente, pelas passagens internas esquerda e direita do suporte da garrafaFigura 3D-1).
    5. Soldar cada fio na extremidade do 1 ¾ fita de cobre condutora de 1 polegada (Figura 3D-2) e dobre as fitas de cobre ao meio (Figura 3D-3).
    6. Descole a fita de cobre e use um par de pinças para manobrá-la cuidadosamente para dentro do suporte do bebedouro (Figura 3E-1) antes de fixá-lo firmemente às paredes internas do suporte do bebedouro (Figura 3E-2). Certifique-se de que o lado com solda da fita de cobre esteja aderido à parede mais próxima da linha média do suporte para frascos, conforme indicado (Figura 3E-2). Insira um tubo bebedouro através do suporte para pressionar firmemente a fita contra a parede e preparar o suporte.
    7. Para reforçar o lado da solda da fita de cobre, que é menos adesivo e tende a se soltar, aplique uma gota de cola quente na junção soldadaFigura 3E-3). Espalhe a cola para cobrir tanto a fita de cobre quanto qualquer parte exposta adjacente da impressão 3D (Figura 3E-4).
    8. Passe o cabo através da passagem interna do protetor de caboFigura 3F). Certifique-se de selecionar o protetor de cabo apropriado (voltado para a esquerda ou para a direita) para cada lickômetro, a fim de utilizar a configuração sugerida do biotério (consulte o passo 3.6 e Figura 6)."OBSERVAÇÃO: Os lickômetros 5-6, 11-12 e 17-18, que são representados por cabos de cor azul ou roxa na configuração atual, requerem um protetor de cabo voltado para a esquerdaFigura 4D-1), enquanto todos os outros lickômetros exigem um protetor de cabo voltado para a direita (Figura 4D-2).
    9. Para instalar o clipe de cabo, encaixe primeiro um fio no sulco de uma metade do clipe de cabo (Figura 3G-1), depois encaixe a outra metade sobre o segundo fio e, em seguida, feche firmemente ambas as metades com a porca (Figura 3G-2).
    10. Rotule o conector macho com o número de identificação (ID) do lickômetro correspondente (Figura 3H). Repita esses passos até que todos os 18 lickômetros sejam construídos.
  4. Instalação dos lickômetros LIQ HDR
    OBSERVAÇÃO: O LIQ HDR foi projetado para instalação em uma gaiola padrão para ratos do tipo caixa de sapatos com tampa de arame metálico (Figura 4A-1).
    1. Identifique dois pares de hastes com uma distância centro a centro de aproximadamente 75 mm na parte superior da gaiola de arame para acomodar o suporte de garrafa. Utilize um alicate para abrir ligeiramente as hastes metálicas ao redor das aberturas dos bebedouros. Isole essas hastes com fita isolante para evitar o contato metal com metal entre os bebedouros e a parte superior da gaiolaFigura 4A-2).
      OBSERVAÇÃO: Embora a fita isolante não esteja acessível às ratas e, portanto, não seja suscetível a mordeduras, recomendamos descartá-la ao final do estudo e não reutilizá-la entre diferentes estudos.
    2. Instale o lickômetro e o painel de acrílico a laser de 1/8 de polegada de espessura na parte superior da gaiola com dois conjuntos de parafusos e porcas M5 (Figura 4B). Certifique-se de que as aberturas dos bebedouros no lickômetro e no painel de acrílico estejam alinhadas e de que os bebedouros não estejam em contato com qualquer parte da tampa da gaiola.
    3. Fixe o clipe de cabo à haste mais externa (~4 mm de diâmetro) do topo da gaiola de arameFigura 4C). Ajuste o clipe do cabo, se necessário, para garantir que a tampa da gaiola assente firmemente na base da gaiola e que o cabo não esteja sendo puxado ou dobrado com tensão excessiva. Certifique-se de que o protetor de cabo adequado está sendo utilizado para cada lickômetro (Figura 4D e veja o passo 3.8.8).
    4. Ajuste os tubos dos bebedouros conforme necessário para que apenas cerca de 2 cm do bebedouro se projete a partir da tampa (Figura 4E-1). Para instalar as garrafas, insira o tubo do bebedouro através do suporte do bebedouro do porta-garrafa até que pareFigura 4E-2). Apenas a ponta do tubo do bebedouro deve se estender além do painel de acrílico (Figura 4E-3). É crucial que nenhuma outra parte do tubo de sucção fique exposta, a fim de evitar lambidas falsas positivas decorrentes de comportamentos não consumatórios, como o rato tocar ou brincar com o tubo de sucção. Um filtro superior deve poder assentar-se firmemente sobre a tampa de arame da gaiola e o prendedor de cabo sem perturbar o próprio cabo (Figura 4F).
      OBSERVAÇÃO: Um painel acrílico mais espesso ou uma pilha de vários painéis de 1/8 de polegada pode ser usado para envolver completamente tubos bebedores de comprimentos maiores em experimentos que exigem que os tubos bebedores se estendam mais para dentro da gaiola, como ao medir a ingestão de líquidos em ratos jovens que podem ter dificuldade em alcançar um tubo bebedor curto.
  5. Instalação e uso de bloqueadores de sifão
    ​OBSERVAÇÃO: O bloqueador de aspiração (Figura 5Afoi projetado para restringir o acesso da rata à mamadeira durante a troca das garrafas e garantir a calibração precisa do lickometer no início de cada sessão de ingestão.
    1. Reúna as peças impressas em 3D e um parafuso, porca e arruela M5 para um bloqueador de bebedouro, conforme mostrado em Figura 5B.
    2. Insira o SIPPER_Gear na SIPPER_Base (Figura 5C-1). Certifique-se de que o SIPPER_Gear está orientado exatamente conforme mostrado no detalhe da renderização 3D. Insira o SIPPER_Worm na abertura na parte superior do SIPPER_Base. Gire o worm no sentido horário durante a inserção até que sua cabeça fique alinhada com a base (Figura 5C-2).
    3. Parafuse a Porca_SIPPER na extremidade do Parafuso sem Fim a partir da parte inferior da Base (Figura 5C-3). Use uma pinça para apertar a porca enquanto gira o mostrador helicoidal. Insira os pescoços estreitos e redondos dos SIPPER_Blockers nas ranhuras da Engrenagem (Figura 5C-4).
    4. Instale o bloqueador de bebedouro montado na parte superior da gaiola utilizando o conjunto de parafusos M5 (Figura 5D). Certifique-se de que ambos os bloqueadores de bebedouro estejam alinhados com as aberturas do bebedouro.
    5. Para bloquear o acesso aos bebedouros, gire o dial do parafuso sem-fim no sentido horário para abaixar os bloqueadores até que cubram completamente as aberturas dos bebedouros (Figura 5E).
    6. Para permitir o acesso aos bebedouros, gire o disco no sentido anti-horário até que os bloqueadores estejam em posição vertical, perpendicular à tampa da gaiola (Figura 5F-1). Puxe manualmente cada braço do bloqueador até que as cabeças fiquem logo abaixo da parte superior da gaiola de arame. Gire os bloqueadores 90° para que as cabeças fiquem paralelas às hastes metálicas na parte superior da gaiola e os braços permaneçam fixos no lugar (Figura 5F-2). Continue girando o botão no sentido anti-horário até que ambos os travões estejam elevados acima da parte superior da gaiola (Figura 5F-3) e os bebedouros estão totalmente acessíveis (Figura 5F-4).
  6. Utilizando o sistema LIQ HDR no vivário
    OBSERVAÇÃO: A configuração de biotério a seguir é otimizada para registrar o consumo em escolha de duas garrafas utilizando uma única interface de microcontrolador conectada a 18 gaiolas padrão tipo caixa de sapato para ratos. Todos os componentes eletrônicos, incluindo a interface de microcontrolador, unidades de sensores e diversos cabos, são fixados em prateleiras de arame metálico montadas na parede, que sustentam as gaiolas (Figura 6A). Algumas modificações podem ser necessárias para adaptação às instalações animais e às necessidades do usuário.
    1. Monte cada unidade sensora nas prateleiras do vivário utilizando o parafuso de fixação personalizado impresso em 3D (Figura 6B). Certifique-se de que cada unidade sensora esteja montada diretamente sob a gaiola, com o lickômetro de cor amarela, a fim de evitar tensão desnecessária nos cabos (Figura 6A).
    2. Organize e fixe cada cabo conector feminino, certificando-se de que eles não se sobreponham entre si nem se dobrem excessivamente nas extremidades soldadas, o que poderia resultar em detecção inadequada dos lambedoresFigura 6B). Se for utilizada prateleira com estrutura de hastes metálicas, isso pode ser facilmente realizado prendendo os cabos conectores a hastes separadas da prateleira, conforme ilustrado.
    3. Monte a interface do microcontrolador ao lado da unidade do sensor A utilizando o mesmo parafuso de fixação impresso em 3D e conecte seu conector de 4 pinos à porta de entrada de 5 V do conversor de nível de 5V para 3V conectado à unidade do sensor A (Figura 6C).
    4. Use fita isolante para fixar o fio terra adicional a uma fonte de aterramento, como uma prateleira metálica (Figura 6D).
    5. Organize cada gaiola com base na cor e no ID do lickômetro instalado conforme Figura 6A representação para minimizar a sobreposição e a tensão dos cabos.
    6. Conecte com segurança todos os cabos conectores macho dos lickômetros aos cabos conectores fêmea correspondentes dos sensores (Figura 6E). Ligue a fonte de alimentação para ligar a interface do microcontrolador (Figura 6F).
    7. Na página principal da GUI (interface gráfica do usuário)Figura 6G), toque o Definir Símbolo para abrir a página Configurações. Os usuários podem alterar os horários de ligar e desligar as luzes com base na programação do vivário para garantir que a tela da interface atenue automaticamente quando o ciclo escuro começar (Figura 6H-1).
    8. Toque Editar Configurações do Sensor (Figura 6H-1) para ajustar o Limiar de Toque a 8 e o Limiar de Liberação a 2, o que temos verificado permitir a detecção de lambidas mais consistente para ratos utilizando a configuração atual (Figura 6H-2). Observe, no entanto, que os usuários podem precisar experimentar diferentes configurações caso sejam introduzidas modificações no sistema atual.
    9. Desmarcar Auto Calibrar se os dados forem coletados apenas em um período de 24 h ou menosFigura 6H-2).

4. Procedimentos diários para o consumo em gaiola doméstica com escolha de duas garrafas utilizando detecção de lambidas

  1. Siga as etapas descritas na etapa 2 para procedimentos padrão de escolha em duas garrafas com as seguintes modificações.
  2. Nas segundas, quartas e sextas-feiras, antes de colocar as garrafas MWF, use os bloqueadores de bebedouro para cobrir as aberturas dos bicos em todas as gaias (veja a etapa 3.5.5 e Figura 5E).
  3. Antes de iniciar o registro, selecione o Lado Experimental correto na página principal da interface gráfica, que será o lado da garrafa de EtOH naquele dia (Figura 6G).
  4. Após instalar todas as garrafas MWF, toque em INICIAR! na página principal (Figura 6G) para iniciar a calibração dos sensores, durante a qual recomenda-se que o usuário se afaste um pouco do sistema e verifique se os ratos não estão lambendo os bicos (Figura 6I-1). A calibração leva alguns segundos para concluir, após o que o sistema entra na página principal de registro, mostrando os números acumulados de lambidas em cada garrafa para cada lickômetro (Figura 6I-2).
  5. Levante todos os bloqueadores de bebedouro acima do topo da gaiola para permitir o acesso aos bicos (veja a etapa 3.5.6 e Figura 5F) e recoloque suavemente todas as tampas filtrantes conforme descrito (veja a etapa 3.4.4 e Figura 4F).
  6. Toque em Atualizar para atualizar os números de lambidas na tela, pois eles não são atualizados em tempo real automaticamente (Figura 6I-2).
  7. Nas terças, quintas e sábados, toque em Salvar & Sair para interromper o registro e retornar à página principal (Figura 6I-2) antes de remover as garrafas MWF.
  8. Para remover o cartão SD para transferência de dados, toque em Ejetar SD antes de desconectar o cartão SD (Figura 6G). Insira o cartão SD em qualquer computador e copie/cole o arquivo de dados .csv nomeado com base na data de ligação da garrafa para esse computador (Figura 6K). Para remontar o cartão SD para o próximo registro, insira o cartão na interface e toque em Montar SD (Figura 6J).
    NOTA: Recomendamos fazer backup dos arquivos de dados diariamente.
  9. Recomenda-se limitar as medições de peso corporal a uma vez por semana, sempre que compatível com o modelo animal e com o protocolo de uso animal, realizando essa tarefa no dia designado para a troca de gaias, a fim de minimizar perturbações desnecessárias aos lickômetros e sensores. Desconecte todos os cabos masculinos dos lickômetros dos cabos femininos correspondentes dos sensores antes de mover as gaias. Após pesar cada rato, devolva-o a uma gaiola limpa. Transfira o lickômetro para um novo topo de gaias e reconecte cada lickômetro ao sensor correspondente quando necessário.
  10. Para experimentos que testam o efeito de uma intervenção (por exemplo, injeção de fármaco) na ingestão de EtOH e na microestrutura da bebida, programe essas intervenções antes do início da sessão de bebida sempre que possível. Em ocasiões em que isso não for possível, os pesquisadores podem interromper a detecção de lambidas tocando em Pausar (Figura 6I-2) e retomar a captura de dados tocando em Retomar após a conclusão da intervenção. Sugerimos coletar os pesos das garrafas durante cada pausa na sessão de bebida para registrar alterações na ingestão de EtOH antes e depois da intervenção, bem como para contabilizar derramamentos que possam ocorrer ao remover a tampa da gaiola para acessar o animal.
  11. No final do estudo, todos os componentes dentro das gaias devem ser desinfetados completamente antes de serem usados com novos animais, a fim de limitar a transmissão de contaminantes entre eles. Recomendamos pulverizar e limpar suavemente o lickômetro com solução de EtOH 70%, tomando cuidado para não perturbar os componentes elétricos internos. O bloqueador de bebedouro e o painel acrílico podem ser lavados com água morna e sabão.

5. Análise de dados

  1. Antes de avaliar as medidas dependentes, corrija os dados de ingestão para levar em conta o derramamento que ocorre inevitavelmente ao trocar as garrafas diariamente. Para isso, calcule a média da variação do peso das garrafas de EtOH e de H2O na gaiola de derramamento ao longo de todo o período do estudo.
  2. Exclua quaisquer valores superiores a dois desvios-padrão da média para cada garrafa. Após excluir esses valores atípicos, subtraia as médias calculadas das variações de peso das garrafas de EtOH e de H2O obtidas nas gaiolas que contêm animais. Ao subtrair essa quantidade, os pesquisadores podem ter certeza de que a perda média resultante do derramamento de uma determinada solução não será considerada nas medidas de consumo. A subtração da quantidade média de derramamento pode resultar em um valor negativo para alguns animais em certas ocasiões. Converta esses valores para zero e interprete-os como ausência de ingestão para aquela solução.
  3. As principais medidas dependentes em experimentos de consumo com escolha de duas garrafas são a ingestão de EtOH (g/kg) e a preferência (%). Calcule a ingestão a partir da variação do peso da garrafa de EtOH (g) e normalize em relação ao peso corporal (kg) utilizando os seguintes passos.
    1. Converta a variação do peso da garrafa (g) na variação do volume (mL) utilizando a seguinte equação:
      figure-protocol-1
      A densidade do etanol puro é 0,789 g/mL. Portanto, a densidade contributiva de EtOH a 20% é 0,1578 g/mL. A H2O pesa 1 g/mL. Assim, a densidade contributiva de 80% de H2O = 0,80 g/mL. Consequentemente, cada mL de uma solução de EtOH a 20% (v/v) é composto por 0,1578 (EtOH) + 0,80 (H2O) = 0,9578 g/mL. Portanto, a equação final ao utilizar concentração de EtOH a 20% (v/v) é:
      figure-protocol-2
    2. Calcule a dose de etanol consumida utilizando a equação abaixo. Utilize os pesos corporais obtidos na mesma semana dos dados de ingestão para calcular o etanol consumido em termos do peso corporal do animal.
      figure-protocol-3
    3. Calcule a preferência utilizando a seguinte equação:
      figure-protocol-4
  4. Assim como seu equivalente em camundongos30, o LIQ HDR capta uma variedade de variáveis de microestrutura de beber, incluindo duração da lambida, número de episódios, duração do episódio, número de lambidas por episódio e duração das lambidas por episódio (Figura 6K). Um episódio de beber é definido como uma série de lambidas que começa com pelo menos 3 lambidas realizadas em menos de 1 segundo e termina após 3 segundos sem lambidas adicionais. Essas medidas podem então ser usadas para calcular a duração média individual da lambida, a duração média individual do episódio, o número médio de lambidas por episódio, a frequência média de lambidas, o intervalo interlambida estimado e o intervalo interepisódio estimado.
    NOTA: A interface do microcontrolador fornece esses dados de microestrutura com resolução de 1 min em um arquivo .csv (Figura 6K). Os pesquisadores podem usar o aplicativo de análise fornecido com o protocolo original do LIQ HD30 ou sua plataforma de pós-processamento preferida para reunir e resumir os dados conforme as necessidades da pesquisa. Os dados de microestrutura são tipicamente somados ao longo de todo o período de 24 h para comparar diferenças médias em nível macroscópico, ou em intervalos de 30 min a 1 h para examinar variações nos padrões de consumo durante um ciclo claro-escuro.

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Resultados

Dados padrão de consumo de EtOH em gaiola domiciliar com escolha intermitente de duas garrafas
Utilizando o procedimento padrão (Figura 7A), os pesquisadores podem registrar a ingestão em 24 h (Figuras 7B-D) bem como o consumo semelhante a episódios de bebedeira, caso os pesos das garrafas sejam coletados logo após o início da sessão de consumo (Figuras 7E-F). Ao calcular a in...

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Discussão

O protocolo atual fornece instruções passo a passo para capturar dados de consumo de etanol usando um procedimento de gaiola doméstica de acesso intermitente de duas garrafas. Este método pode ser implementado com relativa facilidade e com pouco ou nenhum custo ou necessidade de equipamentos de pesquisa especializados. Usando os procedimentos fornecidos aqui para construir e implementar o LIQ HDR - um sistema de detecção de lambedura para uso em ratos - os pesquisadores podem capturar dados de microestrutura de consumo d...

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Divulgações

Todos os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Joseph Pitock e Katie Przybysz, PhD, pela assistência técnica durante o desenvolvimento do LIQ HDR. Também agradecemos a Nicholas Petersen e Marie Doyle, PhD, por muitas conversas úteis durante o desenvolvimento do LIQ HDR. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Abuso de Álcool e Alcoolismo dos Institutos Nacionais de Saúde (P50 AA022538 e R01 AA029130 ao EJG).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Componentes disponíveis comercialmenteQuantidade
Quebra do sensor de toque capacitivo de 12 teclas (MPR121)Adafruit19823
Par correspondente de cabo de 2 pinos (passo JST XH 2,5 mm)Adafruit487218
Jumper de placa de ensaio de 4 pinos (Qwiic)SparkFunPRT-179121
Cabo de 4 pinos (Qwiic de 100 mm)SparkFunPRT-172591
cabo de 4 pinos (Qwiic de 50 mm)SparkFunPRT-172603
breakout de deslocador de nível de 5V para 3V Adafruit56371
Protetor de toque capacitivo (2,8 polegadas)Adafruit19471
Fita condutora de cobre (1/4 de polegada)DigiKey4393-CFT-1/4-ND1
Dados escudo de registroAdafruit11411
Kit de breakout de comunicação diferencial I2C (QwiicBus)SparkFunKIT-172501
Fita isolanteDigiKey3M156004-ND1
Tubo termorretrátil (3/16 polegadas várias cores)Abraçadeiras e maisHS357-S106
Kit de tubo termorretrátil (4 polegadas preto)Jameco20959631
Bateria de lítio para moedas (3V 12.5mm)DigiKey1908-CR1220JAUCHSB-ND1
arruela plana M5Grainger54FN661
porca hexagonal M5Grainger6CA721
parafuso de máquina M5 (12mm)Grainger6GU881
M5 parafuso de máquina (25mm)Grainger  6GU912
Fio jumper macho/machoAdafruit19571
Placa microcontroladora (Arduino Mega 2560 Rev3)DigiKey1050-1018-ND1
filamento PETG (prata 2,85mm)MatterHackersM-DDH-UZR22
filamento PLA (2,85mm preto)Filamento PLAMatterHackers M-SEW-RUAW2
(prata 2,85mm)MatterHackersM-66P-6CLE1
Fonte de alimentação (DC 9V 1A)Newegg9SIBPPKJYR59911
cartão de memória SD/microSD (8GB)Adafruit12941
Conectores de empilhamento de blindagemAdafruit851
Fio de núcleo sólido (vermelho 22AWG)Adafruit2881
Fio de núcleo trançado (22AWG preto)Adafruit29761
Fio de núcleo trançado (vermelho 22AWG)Adafruit30681
Tubo de sipper com tampa de torção com bolaDesign alternativoTCCN8.5-ST2.5SB38
Garrafa de água (8oz)Design alternativoWB8FS38
Custom Componentes impressos em 3DQuantity
3D-printed Arduino case bottomN/AARDUINO_Bottom.stl1
Tampo de caixa Arduino impresso em 3DN/AARDUINO_Top.stl1
Clipe de cabo impresso em 3D LN/ACLIP_L.stl18
Porca de clipe de cabo impresso em 3DN/ACLIP_Nut.stl18
Clipe de cabo impresso em 3D RN/ACLIP_R.stl18
Suporte para garrafa de lickometer impresso em 3DN/ALICKOMETER_Bottle Holder.stl19
Protetor de cabo de licômetro impresso em 3D LN/ALICKOMETER_Cable Protector_L.stl6
Protetor de cabo de licômetro impresso em 3D RN/ALICKOMETER_Cable Protector_R.stl12
letras de licômetro impresso em 3DN/ALICKOMETER_Letters.stl19
Parafuso de montagem impresso em 3DN/AParafuso de montagem.stl4
Estojo do sensor impresso em 3D A inferiorN/ASENSOR_A_Bottom.stl1
Estojo do sensor impresso em 3D A superiorN/ASENSOR_A_Top.stl1
Estojo do sensor impresso em 3D B inferiorN/ASENSOR_B_Bottom.stl1
Estojo do sensor impresso em 3D B superiorN/ASENSOR_B_Top.stl1
Estojo do sensor impresso em 3D C inferiorN/ASENSOR_C_Bottom.stl1
Estojo do sensor impresso em 3D C topN/ASENSOR_B_Top.stl1
Letras do estojo do sensor impresso em 3DN/ASENSOR_Letters.stl1
Bloqueador de sipper impresso em 3DN/ASIPPER_Blocker.stl36
Base do bloqueador de sipper impresso em 3DN/ASIPPER_Base.stl18
Engrenagem do bloqueador de sipper impresso em 3DN/ASIPPER_Gear.stl18
Porca bloqueadora de sipper impressa em 3DN/ASIPPER_Nut.stl18
Worm bloqueador de sipper impresso em 3D/ASIPPER_Worm.stl18
Painel acrílico de lickometer cortado a laserN/ALICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf19
N

Referências

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