Modelagem do consumo de álcool em roedores usando o consumo de álcool em gaiola doméstica de escolha de duas garrafas e análise microestrutural

Resumo

Este protocolo descreve um paradigma padrão de consumo doméstico de duas garrafas de acesso intermitente para modelar o consumo de álcool em ratos. Além disso, fornece instruções passo a passo para aumentar o protocolo padrão com um sistema de detecção de lambedura DIY que permite a análise microestrutural do comportamento de beber.

Resumo

O consumo de bebidas alcoólicas em gaiolas domésticas com duas garrafas é um dos paradigmas mais amplamente utilizados para estudar o consumo de etanol em roedores. Em sua forma mais simples, os animais têm acesso a duas garrafas de bebida, uma das quais contém água da torneira comum e a outra etanol, com ingestão diária medida pela mudança no peso da garrafa durante o período de 24 horas. Consequentemente, essa abordagem não requer equipamento de laboratório especializado. Embora essa facilidade de implementação seja provavelmente o maior contribuinte para sua ampla adoção por pesquisadores pré-clínicos de álcool, a resolução dos dados de consumo adquiridos usando essa abordagem é limitada pelo número de vezes que o pesquisador mede o peso da garrafa (por exemplo, uma vez ao dia). No entanto, o desejo de examinar os padrões de consumo no contexto da ingestão geral, intervenções farmacológicas e manipulações neuronais levou ao desenvolvimento de sistemas de detecção de lambidas em gaiolas domésticas que podem adquirir dados no nível de lambidas individuais. Embora vários desses sistemas tenham sido desenvolvidos recentemente, o sistema de código aberto, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device), atraiu atenção significativa no campo por sua acessibilidade e facilidade de uso. Embora emocionante, este sistema foi projetado para uso em camundongos. Aqui, revisamos os procedimentos apropriados para beber em gaiola doméstica de escolha de duas garrafas padrão e equipado com lickometer. Também introduzimos métodos para adaptar o sistema LIQ HD a ratos, incluindo modificações de hardware para acomodar um tamanho de gaiola maior e um suporte de garrafa impresso em 3D redesenhado compatível com garrafas padrão prontas para uso. Usando essa abordagem, os pesquisadores podem examinar os padrões diários de consumo, além dos níveis de ingestão em muitos ratos, em paralelo, aumentando assim a resolução dos dados adquiridos com investimento mínimo em recursos adicionais. Esses métodos fornecem aos pesquisadores a flexibilidade de usar garrafas padrão ou um aparelho equipado com licômetro para interrogar os mecanismos neurobiológicos subjacentes ao consumo de álcool, dependendo de suas necessidades experimentais precisas.

Introdução

Embora o uso moderado de álcool tenha sido historicamente associado a benefícios moderados para a saúde, estudos abrangentes recentes em larga escala revelaram que nenhuma quantidade de consumo de álcool é segura^1,2. Na verdade, o uso de álcool é o^7º principal fator de risco para morte e incapacidade globalmente¹ com indivíduos que bebem até mesmo pequenas quantidades de álcool tendo risco aumentado de câncer, doenças infecciosas e lesões^1,3. Nos Estados Unidos, as mortes por uso de álcool aumentaram quase 30% entre 2016 e 2021⁴. É importante ressaltar que o risco de morte e incapacidade aumenta monotonicamente com o aumento do consumo¹.

Embora estudos em humanos tenham fornecido informações valiosas sobre a neurobiologia do uso e abuso de álcool, o controle experimental proporcionado por modelos animais é crucial para uma compreensão profunda dos mecanismos subjacentes ao comportamento de beber e ao risco de beber muito. Esses modelos também são ferramentas valiosas para o desenvolvimento de tratamentos que visam reduzir o consumo descontrolado. O consumo de duas garrafas em gaiolas domésticas é um dos paradigmas pré-clínicos mais amplamente utilizados para estudar o consumo de álcool em roedores. Isso se deve, em grande parte, à sua facilidade de implementação, pois permite a medição do consumo voluntário total de álcool e preferência sem a necessidade de equipamentos de pesquisa especializados ou análises complexas. Usando essa abordagem, os pesquisadores podem coletar medições nos intervalos desejados (por exemplo, horas, dias, semanas) calculando a mudança no peso da garrafa do início ao fim de uma sessão de bebida. Variações desse método básico têm sido usadas por muitos no campo para facilitar níveis baixos a moderados a excessivos de ingestão de álcool em curtos e longos períodos de tempo. Por exemplo, procedimentos contínuos e intermitentes de escolha de duas garrafas foram usados para facilitar níveis baixos e moderados de ingestão de álcool, respectivamente, em camundongos⁵ e ratos^6,7,8. Os mesmos paradigmas podem promover altos níveis de ingestão em cepas preferenciais ao álcool^7,9. Alternativamente, uma adaptação deste método que limita o acesso ao álcool a 2-4 h por dia, começando aproximadamente 3 h após o início do ciclo escuro, demonstrou gerar consumo excessivo de álcool em camundongos (ou seja, Drinking in the Dark)^10,11. Variações adicionais desses métodos têm sido usadas em conjunto com métodos que facilitam a dependência do álcool (ou seja, exposição crônica intermitente ao vapor de etanol) para examinar a escalada do consumo voluntário de álcool durante a abstinência^{12,13,14,15,16,17,18,19}.

Embora amplamente adotada pelo campo, a abordagem padrão de medir a ingestão de álcool pela mudança no peso da garrafa é limitada em resolução ao consumo total por sessão de bebida. Consequentemente, essa abordagem é incapaz de capturar padrões de consumo, que são bem conhecidos por afetar tanto o risco quanto a gravidade do transtorno por uso de álcool (AUD)^20,21,22. De fato, a ingestão média de um indivíduo ao longo do tempo pode ser consequência de vários episódios de consumo excessivo de álcool ou muitos episódios de consumo, cada um associado a um consumo relativamente baixo, e essas nuances não são detectadas quando o consumo é medido como ingestão total por sessão de consumo. É importante ressaltar que significativamente mais episódios de consumo associados a grandes crises de consumo (ou seja, engolir) são observados em indivíduos com AUD em relação a controles saudáveis²³ e dados em primatas não humanos sugerem que indivíduos que estabelecem um padrão de consumo de álcool que inclui grandes crises de consumo de álcool no início de sua história de consumo de álcool correm um risco significativo de AUD²². Além disso, episódios de consumo de álcool que incluem grandes períodos de consumo aumentam significativamente o risco de morbidade e mortalidade, independentemente do diagnóstico de AUD²¹. Ao todo, esses dados levaram a um aumento do interesse em examinar os padrões de consumo, além dos níveis de ingestão geral em modelos pré-clínicos e levaram ao desenvolvimento de vários sistemas de complexidade variável que são capazes de capturar dados de consumo no nível de lambidas individuais.

Entre os primeiros estava o desenvolvimento de um sistema de duas garrafas equipado com detecção de lambida de feixe de fotos projetado para uso em camundongos²⁴. Este sistema foi posteriormente adaptado por um grupo separado para uso em ratos²⁵. Nos anos seguintes, variações sobre esse tema foram usadas para desenvolver sistemas semelhantes contidos em alojamentos personalizados para roedores²⁶, que permitem a detecção de lambeduras de animais individuais alojados socialmente^27,28, e que capturam o comportamento alimentar e de beber²⁹. Entre estes, o LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device)³⁰ atraiu atenção significativa por oferecer um sistema para uso em camundongos que se assemelha à facilidade de implementação e acessibilidade do sistema desenvolvido por Godnyuck et al.²⁴. Este sistema utiliza detecção capacitiva para detectar diretamente o contato entre a língua e o tubo condutor do sipper de metal, ao contrário de medidas indiretas, como abordagem ou interação do sipper, que são oferecidas usando o sistema de detecção de feixe de fotos. Os autores fornecem dados que demonstram que seu sistema de detecção capacitiva oferece precisão e sensibilidade significativamente maiores na detecção de lambidas, produzindo correlações mais fortes entre o número de lambidas e a mudança no peso da garrafa do que a detecção de feixes de fotos. Os autores demonstram ainda a capacidade de usar este sistema em conjunto com um paradigma de consumo doméstico de gaiola de escolha de duas garrafas de acesso contínuo para capturar medidas da microestrutura do consumo de álcool, além de medidas de ingestão diária geral³⁰.

Aqui, descrevemos procedimentos para o consumo de álcool em gaiola doméstica de escolha de duas garrafas usando uma abordagem padrão, bem como métodos que permitem a detecção de lambedas (Figura 1). Também introduzimos métodos para construir e implementar LIQ HDR - uma adaptação do LIQ HD³⁰ para uso em ratos que inclui modificações de hardware para acomodar tamanhos de gaiola maiores e um suporte de garrafa impresso em 3D redesenhado compatível com garrafas padrão prontas para uso. Esses métodos fornecem aos pesquisadores a flexibilidade de usar uma abordagem padrão ou equipada com licômetro, dependendo de seus recursos experimentais e necessidades de coleta de dados.

Abaixo está uma descrição dos materiais necessários e instruções passo a passo para capturar o consumo de bebidas alcoólicas em gaiolas domésticas usando o procedimento de consumo de duas garrafas de acesso intermitente adaptado de Simms et al.⁷. Neste procedimento, os ratos têm acesso 24 horas a dois bebedouros, 7 dias por semana. Às segundas, quartas e sextas-feiras (MWF), os ratos recebem uma garrafa contendo água (H₂O) e outra garrafa contendo etanol (EtOH). Essas garrafas são removidas às terças, quintas e sábados (TRS) e substituídas por duas garrafas de água. Os ratos bebem das mesmas duas garrafas de água aos sábados e domingos. Observe que esses métodos podem ser facilmente ajustados para horários alternativos de acesso ao etanol (por exemplo, contínuo, compulsão, etc.), se desejado. Instruções separadas são fornecidas para abordagens padrão e equipadas com licômetro.

Protocolo

Todos os dados representativos foram coletados usando ratos Long-Evans adultos alojados individualmente com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Illinois Chicago e de acordo com as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. É necessária uma única caixa para monitorar com precisão o consumo de fluido por cada sujeito. Ratos Long-Evans machos adultos (n = 38) e fêmeas (n = 22) foram P50-80 na chegada e aclimatados ao biotério por uma semana antes do início do experimento. Os ratos tinham acesso ad libitum à ração padrão (Teklad 7912, Envigo) e água, salvo indicação em contrário.

1. Preparação antes do experimento

1. Rotule as garrafas como H₂O ou EtOH. Em seguida, rotule com um identificador único para cada rato, uma garrafa de H₂O e uma garrafa de EtOH para MWF e duas garrafas de H₂O para TRS.
   NOTA: Opcionalmente, use fita de cores diferentes para identificar garrafas de H₂O e EtOH para ajudar a evitar possíveis erros durante a troca da garrafa.
2. Encha as garrafas H₂O com água potável 1 dia antes da data de início do experimento. Prepare a solução de EtOH combinando EtOH de 190 provas com água potável (20% v/v) 1 dia antes da data de início do experimento.
   CUIDADO: É fundamental que o EtOH usado não seja desnaturado, pois o EtOH desnaturado é venenoso.
3. Prepare uma gaiola vazia nas mesmas prateleiras que os ratos que participam do experimento. Esta gaiola será usada para calcular o derramamento.
4. Equipe as gaiolas com o sistema LIQ HDR se estiver usando (consulte a etapa 3, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6 e Figura Suplementar 1).
5. Determine a hora exata do dia para a troca do frasco antes do início do estudo. As garrafas devem ser trocadas no mesmo horário todos os dias para obter uma medição precisa da ingestão de 24 h.
   NOTA: Pesquisas anteriores mostraram que os roedores exibem o maior grau de consumo logo após o início do ciclo escuro^10,31. Portanto, para capturar a ingestão durante este período altamente ativo (consulte a etapa 2.3.1 para capturar o consumo excessivo de álcool), recomenda-se que a troca da garrafa ocorra 30-60 minutos após as luzes serem desligadas. Use lâmpadas vermelhas durante a troca da garrafa para permitir a visualização sem interrupção do ciclo claro-escuro.

2. Procedimentos diários e manutenção

1. No primeiro dia do experimento, faça o seguinte.
   1. Remova as garrafas de água padrão das gaiolas.
   2. Opcional: Os ratos costumam empurrar o topo da gaiola enquanto procuram comida, o que pode causar derramamento que não pode ser corrigido pela gaiola vazia. O uso de copos de comida dentro da gaiola pode aliviar essa preocupação. Se estiver usando, remova a comida da parte superior da gaiola agora, adicione um copo de comida dentro da gaiola e encha-o com ração. Certifique-se de que o espaço alocado para o rato ainda atenda às diretrizes institucionais com base no tamanho da gaiola e no tamanho do copo de comida.
   3. Indique ao pessoal de cuidados e criação, conforme aplicável, que o pessoal de investigação fornecerá comida e água durante a experiência.
   4. As mudanças na gaiola podem atrapalhar a coleta de dados. Realize mudanças na gaiola em conjunto com a obtenção de medições de peso corporal. Os pesquisadores que optarem por fazer isso devem informar sua equipe de cuidados e criação de acordo.
2. Nos dias subsequentes, siga os procedimentos descritos abaixo.
   NOTA: Lembre-se de que qualquer movimento de gaiolas e garrafas pode criar derramamento. Portanto, é importante ser gentil com os movimentos e usar os mesmos métodos de aplicação e remoção de garrafas na gaiola de derramamento que são usados para gaiolas de ratos.
   1. Entre na sala antes do horário de troca da garrafa, garantindo tempo suficiente para realizar as etapas abaixo, e coloque as novas garrafas nas gaiolas no horário apropriado de início da sessão.
   2. Remova as tampas dos filtros das gaiolas. Se MWF, prossiga para a etapa 2.2.3. Se TRS, prossiga para a etapa 2.2.4.
   3. Às segundas, quartas e sextas-feiras, remova as garrafas TRS dos topos das gaiolas. Pesar garrafas de MWF (uma EtOH e uma H₂O). Registre o peso inicial da garrafa para a sessão de bebida de hoje. Forneça comida adicional para o topo da gaiola ou copos de comida, se necessário. No horário designado para o início da sessão, coloque as garrafas no topo da gaiola de cada rato com a fita voltada para cima para que os ratos não mastiguem o rótulo da garrafa.
      NOTA: Normalmente, o consumo de água não é registrado ou relatado para TRS, mas os pesquisadores podem, opcionalmente, coletar esses dados obtendo pesos dentro e fora da garrafa, conforme descrito abaixo na etapa 2.2.3 e na etapa 2.2.4, se desejado. O lado da garrafa de EtOH deve ser alternado após cada sessão de consumo para evitar o desenvolvimento de possíveis preferências laterais, o que pode distorcer inadvertidamente os dados de consumo.
      1. Opcional: Trabalhos anteriores mostraram que muitos ratos exibem consumo excessivo de álcool no início da sessão de bebida^8,32,33. A maioria dos pesquisadores que capturam o consumo excessivo de álcool durante esse período relata a ingestão durante os primeiros 30-60 minutos da sessão de bebida. Para obter dados de ingestão durante este possível episódio de compulsão, siga as etapas descritas abaixo.
      2. Defina um cronômetro depois que as garrafas forem aplicadas na última gaiola. Deixe a sala sem ser perturbado durante o período cronometrado.
      3. Entre novamente na sala quando o cronômetro desligar. Remova as garrafas de EtOH e H₂O e registre os pesos das garrafas. Retorne os frascos de EtOH e H₂O para as gaiolas.
         NOTA: Esta etapa não é necessária para capturar episódios de compulsão ao usar um sistema equipado para detecção de lambidas.
   4. Às terças, quintas e sábados, remova as garrafas MWF das gaiolas no horário designado para o término da sessão, correspondente a 24 horas após o horário de início. Pese cada garrafa e registre o peso final da garrafa para a sessão de bebida MWF. Obtenha e registre o peso corporal de cada rato. Se necessário, forneça comida adicional para a parte superior da gaiola ou copos de comida. Coloque as garrafas TRS H₂O no topo da gaiola de cada rato com a fita voltada para cima para que os ratos não mastiguem o rótulo da garrafa.
   5. Retorne os topos dos filtros para as gaiolas e saia da sala dos animais.
      NOTA: Opcionalmente, cubra os bebedouros de garrafa EtOH para evitar a evaporação. Se as mudanças na gaiola estiverem sendo realizadas pelo pessoal de pesquisa, designe 1 dia semanalmente durante as tarefas do TRS para realizar esta tarefa. Coloque cada rato em uma gaiola limpa após obter o peso corporal.
3. Lave as mamadeiras e refresque os líquidos regularmente, semanalmente ou quinzenalmente, de acordo com os procedimentos de cuidados e criação de animais da instituição. Tome cuidado para desempenhar essas funções de maneira a não interromper as sessões de bebida. Por exemplo, as garrafas TRS H₂O podem ser lavadas e recarregadas após a remoção no MWF. Da mesma forma, as garrafas MWF H₂O e EtOH podem ser lavadas e recarregadas após a remoção no TRS.

3. Detecção de lambida durante experimentos de escolha de duas garrafas

NOTA: Os pesquisadores interessados em capturar dados de consumo de alta resolução podem modificar o procedimento acima adicionando recursos de detecção de lambida às garrafas. LIQ HD³⁰ é um sistema de bricolage (DIY) de baixo custo que permite esse tipo de coleta de dados em mouses. Os procedimentos descritos abaixo descrevem as modificações necessárias para adaptar o LIQ HD para uso em ratos (referido como LIQ HDR). Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista de todas as peças impressas em 3D vendidas comercialmente e personalizadas necessárias para construir um sistema de detecção de lambedura, que pode capturar dados de escolha de duas garrafas para até 18 ratos. Os arquivos .stl impressos em 3D e as instruções podem ser encontrados no site do autor (www.ejgloverlab.com/3dprints).

1. Configuração de unidades de sensor capacitivo
   NOTA: Cada sistema LIQ HDR consiste em três unidades de sensor capacitivo, que juntas capturam dados de lambida de 36 garrafas em paralelo, correspondendo a 18 ratos alojados individualmente. Cada unidade de sensor consiste em uma placa de breakout de comunicação diferencial I²C e uma placa de sensor capacitivo de 12 teclas, que se conectará aos licômetros de seis gaiolas separadas por meio de seis pares de cabos de 2 pinos codificados por cores para cada licômetro (Figura 2A).
   1. Reúna os materiais necessários para construir todas as três unidades de sensor capacitivo, conforme mostrado em Figura 2B, juntamente com as ferramentas de solda necessárias.
   2. Para começar a construir a unidade do sensor A, cubra um cabo conector fêmea de 2 pinos com um tubo termorretrátil vermelho de 7 polegadas de comprimento, insira suas extremidades de fio vermelho e preto nos pinos #0 e #1 na placa do sensor (Figura 2C-1) e solde no lugar (Figura 2C-2). Certifique-se de que o cabo esteja na frente da placa do sensor, conforme mostrado, para organizar as gaiolas em ordem numérica da esquerda para a direita no biotério, sem sobrepor os cabos e potencialmente interromper a gravação (consulte a etapa 3.6 e Figura 6).
   3. Cubra mais cinco cabos com tubos termorretráteis de cores distintas e solde no pino #2-11 conforme mostrado (Figura 2C-3). Certifique-se de que todos os fios vermelhos sejam soldados a pinos pares, que se conectarão a todas as garrafas do lado esquerdo, e todos os fios pretos sejam soldados a pinos ímpares, que se conectarão a todas as garrafas do lado direito.
   4. Cubra as juntas de solda com cola quente em todos os lados para proteção (Figura 2C-4). Rotule os conectores em ordem numérica, fornecendo um ID exclusivo para cada lickômetro (Figura 2C-4).
   5. Para montar a unidade de sensor A, conecte a placa do sensor A a um ponto final de breakout de comunicação com um cabo de 50 pinos de 4 mm e conecte o ponto final à saída de 3.3 V do câmbio de alavanca de 5 V para 3 V com um cabo de 100 pinos de 4 mm (Figura 2D-1). Embora a placa do sensor e a placa de breakout de comunicação tenham dois conectores idênticos de 4 pinos, ainda é importante certificar-se de que a fiação seja exatamente como mostrada (Figura 2D-1 e Figura 2F) para usar as caixas do sensor impressas em 3D e a configuração sugerida do viveiro (consulte a etapa 3.6 e Figura 6). Abrigar a unidade de sensor A dentro da caixa impressa em 3D (Figura 2D-2). Feche suavemente a parte superior, tomando cuidado para não esmagar o cabo do deslocador de nível (Figura 2D-3).
   6. Modifique os endereços I²C das placas de sensor B e C soldando um fio jumper do pino ADDR ao pino 3Vo ou SDA conforme indicado (Figura 2E).
   7. Solde seis cabos de conector fêmea codificados por cores nas placas de sensor B e C usando a mesma ordem usada para a placa A. Rotule cada conector com o número de identificação do lickometer correspondente. Conecte a placa B ao ponto médio de breakout de comunicação e C a um ponto final com cabos de 50 pinos de 4 mm (Figura 2F).
   8. Alojar as unidades de sensor B e C em seus respectivos estojos impressos em 3D. Encadeie todas as três unidades de sensor com cabos Ethernet para concluir a configuração do sensor (Figura 2G).
2. Configurando a interface do microcontrolador
   NOTA: A interface do microcontrolador LIQ HDR (Figura Suplementar 1A) é a mesma descrita para LIQ HD³⁰ com modificações muito pequenas. Os procedimentos descritos abaixo fornecem uma visão geral das etapas necessárias para configurar a interface com as modificações descritas nas etapas 3.2.6 e 3.2.8. Os pesquisadores são encaminhados para o protocolo original e o tutorial em vídeo fornecido na página GitHub do autor para obter instruções passo a passo mais detalhadas³⁰.
   1. Reúna os materiais e ferramentas de solda necessários para construir a interface do microcontrolador (Figura Suplementar 1B). Na parte de trás do protetor de toque (Figura Suplementar 1C-1), crie um jumper de solda nas almofadas de solda traseiras (Figura Suplementar 1C-2).
   2. Na parte de trás da blindagem de registro de dados, corte o traço do jumper pad do pino CS (Figura Suplementar 1D-1). Na parte frontal do registrador de dados, solde um fio jumper curto do pino CS ao pino #7 (Figura Suplementar 1D-2).
   3. Para instalar os cabeçalhos de empilhamento de blindagem, primeiro empilhe-os na parte de trás da blindagem da tela sensível ao toque (Figura Suplementar 1E-1). Empilhe o registrador de dados na tela sensível ao toque, use fita adesiva para estabilizar e solde todos os pinos do cabeçalho no registrador de dados (Figura Suplementar 1E-2). Em seguida, remova a tela sensível ao toque.
   4. Empilhe o cabeçalho 2 x 3 restante no microcontrolador (Figura Suplementar 1F-1) e, em seguida, empilhe o registrador de dados no microcontrolador antes de soldar os pinos do cabeçalho no lugar (Figura Suplementar 1F-2).
   5. Insira a bateria de moedas no registrador de dados (Figura Suplementar 1G-1). Empilhe a tela sensível ao toque no registrador de dados (Figura Suplementar 1G-1). Insira o cartão microSD junto com seu adaptador no registrador de dados (Figura Suplementar 1G-2).
   6. Para fazer o fio de aterramento extra, corte um conector macho de um fio jumper e descasque a extremidade para ~ 1/4 de polegada (Figura Suplementar 1H-1). Solde um fio de fio de núcleo sólido descascado ao fio jumper e cubra a junta de solda com tubo termorretrátil (Figura Suplementar 1H-2).
   7. Conecte os fios jumper de 4 pinos e o fio de aterramento extra ao microcontrolador (Preto - GND, Vermelho - 5V, Amarelo - pino #21, Azul - pino #20, Figura Suplementar 1I-1). Prenda as conexões com cola quente (Figura Suplementar 1I-2). Opcionalmente, enrole os fios do jumper com tubo termorretrátil (Figura Suplementar 1I-2).
   8. Aloje a interface do microcontrolador totalmente montada na caixa impressa em 3D, com os fios jumper de 4 pinos e o fio de aterramento rosqueados na abertura na parte superior (Figura Suplementar 1J).
   9. Siga o protocolo original para instalação do software de interface do microcontrolador³⁰.
3. Construção de licômetros LIQ HDR
   NOTA: A impressão 3D personalizada que contém as garrafas foi projetada para uso com uma garrafa de bebida padrão para roedores com um diâmetro de tubo de bebedouro de 8 mm (consulte a Tabela de Materiais, Figura 3A). Este suporte para garrafas pode ser facilmente adaptado para uso com garrafas e tubos de bebedouro semelhantes com pequenas ou nenhuma modificação.
   1. Reúna os materiais, impressões 3D e ferramentas de solda necessárias para construir um lickometer, conforme mostrado em Figura 3B. Observe que cada sistema LIQ HDR acomoda no máximo 18 licômetros para 36 garrafas.
   2. Para estender o cabo conector macho, descasque ambas as extremidades com ~ 1/4 de polegada de comprimento, bem como os fios preto e vermelho de extensão (Figura 3C-1).
   3. Solde os fios de extensão ao cabo conector (Figura 3C-2) e cubra as juntas de solda com tubulação termorretrátil (Figura 3C-3). Cubra o cabo conector macho com um tubo termorretrátil da mesma cor de um cabo conector fêmea correspondente na unidade do sensor (Figura 3C-4).
   4. Para ser consistente com a fiação da placa do sensor (Figura 2), passe o fio vermelho e preto pela passagem do cabo interno esquerdo e direito do porta-garrafas, respectivamente (Figura 3D-1).
   5. Solde cada fio até o final da fita de cobre condutora de 1 3/4 de polegada (Figura 3D-2) e dobre as fitas de cobre ao meio (Figura 3D-3).
   6. Descasque a fita de cobre e use uma pinça para manobrá-la cuidadosamente dentro do suporte do bebedouro (Figura 3E-1) antes de colá-la firmemente às paredes internas do suporte do bebedouro (Figura 3E-2). Certifique-se de que o lado de solda da fita de cobre esteja aderido à parede mais próximo da linha média do porta-garrafas, conforme indicado (Figura 3E-2). Empurre um tubo de sipper através do suporte para pressionar a fita firmemente contra a parede e preparar o suporte.
   7. Para reforçar o lado da solda da fita de cobre, que não é tão adesivo e tende a descascar, aplique um bocado de cola quente na junta de solda (Figura 3E-3). Espalhe a cola para cobrir a fita de cobre e qualquer parte exposta adjacente da impressão 3D (Figura 3E-4).
   8. Passe o cabo pela passagem interna do protetor de cabo (Figura 3F). Certifique-se de selecionar o protetor de cabo apropriado (voltado para a esquerda ou para a direita) para cada licômetro para usar a configuração de biotério sugerida (consulte a etapa 3.6 e Figura 6)."NOTA: Os licômetros 5-6, 11-12 e 17-18, que são representados em cabos de cor azul ou roxa na configuração atual, requerem um protetor de cabo voltado para a esquerda (Figura 4D-1), enquanto todos os outros lickômetros requerem um protetor de cabo voltado para a direita (Figura 4D-2).
   9. Para instalar o clipe de cabo, primeiro encaixe um fio na ranhura de uma metade do clipe de cabo (Figura 3G-1), depois encaixe a outra metade sobre o segundo fio e, em seguida, feche bem as duas metades com a porca (Figura 3G-2).
   10. Rotule o conector macho com o número de identificação do licômetro correspondente (Figura 3H). Repita essas etapas até que todos os 18 lickômetros sejam construídos.
4. Instalando licômetros LIQ HDR
   NOTA: LIQ HDR foi projetado para instalação em uma gaiola de rato de caixa de sapatos padrão com uma parte superior de fio de metal (Figura 4A-1).
   1. Identifique dois pares de hastes com uma distância de centro a centro de ~75 mm na parte superior da gaiola de arame para acomodar o porta-garrafas. Use um alicate para abrir ligeiramente as hastes de metal ao redor das aberturas do sipper. Isole essas hastes com fita isolante para evitar o contato metal-metal entre as lamelas e o topo da gaiola (Figura 4A-2).
      NOTA: Embora a fita isolante não seja acessível a ratos e, portanto, não seja suscetível à mastigação, recomendamos descartá-la no final do estudo e não reutilizá-la entre os estudos.
   2. Instale o lickômetro e o painel de acrílico a laser de 1/8 de polegada de espessura no topo da gaiola com dois conjuntos de parafusos e porcas M5 (Figura 4B). Certifique-se de que as aberturas do bebedor no licômetro e no painel de acrílico estejam alinhadas e que os bebedouros não estejam em contato com nenhuma parte do topo da gaiola.
   3. Prenda o clipe do cabo na haste mais externa (~4 mm de diâmetro) da parte superior da gaiola de arame (Figura 4C). Ajuste o clipe do cabo, se necessário, para garantir que a parte superior da gaiola esteja bem apoiada na parte inferior da gaiola e que o cabo não esteja sendo puxado ou dobrado sob muita tensão. Certifique-se de que o protetor de cabo correto esteja sendo usado para cada lickômetro (Figura 4D e consulte a etapa 3.8.8).
   4. Ajuste os tubos do bebedouro conforme necessário para que apenas ~ 2 cm do bebedor se estendam da tampa (Figura 4E-1). Para instalar garrafas, insira o tubo do bebedouro através do suporte do bebedouro do porta-garrafas até que ele pare (Figura 4E-2). Apenas a ponta do tubo do bebedor deve se estender além do painel de acrílico (Figura 4E-3). É crucial que nenhuma outra parte do tubo do sipper seja exposta para evitar lambidas falsas positivas de comportamentos não consumatórios, como o rato tocando ou brincando com o tubo do sipper. Uma parte superior do filtro deve ser capaz de descansar confortavelmente sobre a parte superior da gaiola de arame e o clipe do cabo sem perturbar o próprio cabo (Figura 4F).
      NOTA: Um painel de acrílico mais espesso ou uma pilha de vários painéis de 1/8 de polegada pode ser usado para envolver totalmente os tubos do bebedouro de comprimentos mais longos para experimentos que exigem que os tubos do bebedouro se estendam ainda mais para dentro da gaiola, como ao medir a bebida em ratos jovens que podem ter problemas para alcançar um bebedor curto.
5. Instalando e usando bloqueadores de sipper
   NOTA: O bloqueador do bebedouro (Figura 5A) foi projetado para restringir o acesso do rato ao bebedor durante as trocas de mamadeira e para garantir a calibração precisa do licômetro no início de cada sessão de bebida.
   1. Reúna as peças impressas em 3D e um parafuso, porca e arruela M5 para um bloqueador de sipper, conforme mostrado em Figura 5B.
   2. Insira o SIPPER_Gear na SIPPER_Base (Figura 5C-1). Certifique-se de que o SIPPER_Gear esteja orientado exatamente como mostrado na inserção de renderização 3D. Insira o SIPPER_Worm na abertura na parte superior da SIPPER_Base. Gire o sem-fim no sentido horário durante a inserção até que a cabeça esteja nivelada com a base (Figura 5C-2).
   3. Aparafuse o SIPPER_Nut na extremidade do sem-fim da parte inferior da base (Figura 5C-3). Use uma pinça para apertar a porca enquanto gira o botão sem-fim. Insira os pescoços redondos e estreitos do SIPPER_Blockers nas ranhuras da engrenagem (Figura 5C-4).
   4. Instale o bloqueador de sipper montado na parte superior da gaiola usando o conjunto de parafusos M5 (Figura 5D). Certifique-se de que ambos os bloqueadores do sipper estejam alinhados com as aberturas do sipper.
   5. Para bloquear o acesso aos sippers, gire o dial sem-fim no sentido horário para abaixar os bloqueadores até que cubram completamente as aberturas do sipper (Figura 5E).
   6. Para fornecer acesso aos sippers, gire o botão no sentido anti-horário até que os bloqueadores estejam em uma posição vertical perpendicular ao topo da gaiola (Figura 5F-1). Puxe manualmente cada braço bloqueador até que as cabeças estejam logo abaixo do topo da gaiola de arame. Gire os bloqueadores 90° para que as cabeças fiquem paralelas às hastes de metal no topo da gaiola e os braços fiquem travados no lugar (Figura 5F-2). Continue girando o botão no sentido anti-horário até que ambos os bloqueadores estejam elevados acima do topo da gaiola (Figura 5F-3) e os bebedouros estejam totalmente acessíveis (Figura 5F-4).
6. Utilização do sistema LIQ HDR no biotério
   NOTA: A configuração do biotério a seguir é otimizada para capturar a escolha de duas garrafas usando uma única interface de microcontrolador conectada a 18 gaiolas de rato de caixa de sapatos padrão. Todos os componentes eletrônicos, incluindo a interface do microcontrolador, unidades de sensor e vários cabos, são fixados a prateleiras de arame de metal montadas na parede que seguram as gaiolas (Figura 6A). Algumas modificações podem ser necessárias para se adaptar às instalações dos animais e às necessidades do usuário.
   1. Monte cada unidade de sensor nas prateleiras do viveiro usando o parafuso de montagem impresso em 3D personalizado (Figura 6B). Certifique-se de que cada unidade de sensor esteja montada diretamente abaixo da gaiola com o lickômetro de cor amarela para evitar tensão desnecessária do cabo (Figura 6A).
   2. Organize e prenda cada cabo conector fêmea certificando-se de que eles não se sobreponham ou dobrem excessivamente nas extremidades da solda, o que pode resultar em má detecção de lambida (Figura 6B). Se forem usadas prateleiras de haste de metal, isso pode ser facilmente alcançado amarrando os cabos conectores a hastes separadas na prateleira, conforme ilustrado.
   3. Monte a interface do microcontrolador ao lado da unidade do sensor A usando o mesmo parafuso de montagem impresso em 3D e conecte seu conector de 4 pinos na porta de entrada de 5 V do deslocador de nível de 5 V para 3 V conectado à unidade do sensor A (Figura 6C).
   4. Use fita isolante para prender o fio terra extra a uma fonte de aterramento, como a prateleira de metal (Figura 6D).
   5. Organize cada gaiola com base na cor e ID do lickômetro instalado de acordo com a representação Figura 6A para minimizar a sobreposição e a tensão do cabo.
   6. Conecte com segurança todos os cabos conectores do licômetro macho aos cabos conectores do sensor fêmea correspondente (Figura 6E). Conecte a fonte de alimentação para ligar a interface do microcontrolador (Figura 6F).
   7. Na página principal da GUI (interface gráfica do usuário) (Figura 6G), toque no símbolo de configuração para abrir a página Configurações. Os usuários podem alterar o tempo de ligar e desligar das luzes com base na programação do biotério para garantir que a exibição da interface escureça automaticamente quando o ciclo escuro começar (Figura 6H-1).
   8. Toque em Editar configurações do sensor (Figura 6H-1) para ajustar o Touch Threshold para 8 e o Release Threshold para 2, o que descobrimos permitir a detecção de lambida mais consistente para ratos usando a configuração atual (Figura 6H-2). Observe, no entanto, que os usuários podem precisar experimentar configurações diferentes se alguma modificação no sistema atual for introduzida.
   9. Desmarque Calibração automática se os dados forem coletados apenas durante um período de 24 horas ou menos (Figura 6H-2).

4. Procedimentos diários para beber em gaiola doméstica com duas garrafas usando detecção de lambida

1. Siga as etapas descritas na etapa 2 para procedimentos padrão de escolha de dois frascos com as seguintes modificações.
2. Às segundas, quartas e sextas-feiras, antes de colocar as garrafas de MWF, use os bloqueadores de sipper para cobrir as aberturas do sipper em todas as gaiolas (consulte a etapa 3.5.5 e Figura 5E).
3. Antes de gravar, selecione o lado experimental correto na página principal da GUI, que será o lado da garrafa de EtOH para aquele dia (Figura 6G).
4. Depois de instalar todas as garrafas MWF, toque em INICIAR! na página principal (Figura 6G) para começar a calibrar os sensores, durante os quais os usuários são recomendados a se afastar do sistema e certificar-se de que os ratos não estão lambendo os goles (Figura 6I-1). A calibração leva alguns segundos para ser concluída, após o que o sistema entra na página principal de gravação mostrando os números cumulativos de lambida em cada garrafa para cada lickômetro (Figura 6I-2).
5. Levante todos os bloqueadores de sipper acima do topo da gaiola para permitir o acesso aos sippers (consulte a etapa 3.5.6 e Figura 5F) e retorne suavemente todos os topos de filtro conforme descrito (consulte a etapa 3.4.4 e Figura 4F).
6. Toque em Atualizar para atualizar os números de lick na tela, que não serão atualizados em tempo real por si só (Figura 6I-2).
7. Às terças, quintas e sábados, toque em Salvar e sair para interromper a gravação e retornar à página principal (Figura 6I-2) antes de remover as garrafas MWF.
8. Para remover o cartão SD para transferência de dados, toque em Ejetar SD antes de desconectar o cartão SD (Figura 6G). Insira o cartão SD em qualquer computador e copie/cole os dados .csv file com o nome da data ON da garrafa para esse computador (Figura 6K). Para remontar o cartão SD para a próxima gravação, insira o cartão na interface e pressione Montar SD (Figura 6J).
   NOTA: Recomendamos fazer backup dos arquivos de dados diariamente.
9. É aconselhável limitar as medições do peso corporal a uma vez por semana, quando compatível com o modelo animal e o protocolo de uso animal, e realizar esta tarefa no dia designado para a troca da gaiola, a fim de minimizar distúrbios desnecessários nos licômetros e sensores. Desconecte todos os cabos do licômetro macho dos cabos do sensor fêmea correspondente antes de mover as gaiolas. Depois de pesar cada rato, devolva-o a uma gaiola limpa. Transfira o lickômetro para um novo topo de gaiola e reconecte cada lickômetro ao sensor correspondente quando necessário.
10. Para experimentos que testam o efeito de uma intervenção (por exemplo, injeção de drogas) na ingestão de EtOH e na microestrutura de beber, programe essas intervenções antes do início da sessão de bebida, sempre que possível. Nas ocasiões em que isso não for possível, os pesquisadores podem interromper a detecção de lambedura tocando em Pausar (Figura 6I-2) e retomar a captura de dados tocando em Retomar após a conclusão da intervenção. Sugerimos coletar pesos de garrafa durante cada pausa na sessão de bebida, a fim de capturar mudanças na ingestão de EtOH antes e depois da intervenção, bem como para levar em conta o derramamento que pode ocorrer ao remover a parte superior da gaiola para obter acesso ao animal.
11. No final do estudo, todos os componentes da gaiola devem ser completamente desinfetados antes de serem usados com novos animais para limitar a transmissão de contaminantes entre os animais. Recomendamos pulverizar e limpar suavemente o lickômetro com solução de EtOH a 70%, certificando-se de não interromper os componentes elétricos internos. O bloqueador de sorvete e o painel de acrílico podem ser lavados com água morna e sabão.

5. Análise dos dados

1. Antes de avaliar as medidas dependentes, corrija os dados de ingestão para derramamento que inevitavelmente ocorre como resultado da troca de garrafas todos os dias. Para fazer isso, calcule a média da mudança no peso da garrafa para garrafas de EtOH e H₂O na gaiola de derramamento ao longo de todo o período do estudo.
2. Exclua quaisquer valores maiores que dois desvios padrão da média de cada garrafa. Depois de excluir esses valores discrepantes, subtrair as médias calculadas das mudanças no peso da garrafa de EtOH e H₂O obtida de garrafas em gaiolas contendo animais. Ao subtrair essa quantidade, os pesquisadores podem ter certeza de que a perda média resultante do derramamento de uma determinada solução não é considerada nas medidas de consumo. A subtração da quantidade média de derramamento pode resultar em um valor negativo para alguns animais em algumas ocasiões. Converta-os em zero e interprete-os como a ausência de qualquer ingestão para essa solução.
3. As principais medidas dependentes para experimentos de consumo de escolha de duas garrafas são a ingestão de EtOH (g / kg) e a preferência (%). Calcule a ingestão a partir da mudança no peso da garrafa de EtOH (g) e normalize para o peso corporal (kg) usando as etapas a seguir.
   1. Converta a mudança no peso da garrafa (g) em mudança no volume (mL) usando a seguinte equação:
      
      A densidade do etanol puro é de 0,789 g/mL. Portanto, a densidade de contribuição de 20% de EtOH é de 0,1578 g/mL. H₂O pesa 1 g/mL. Portanto, a densidade contribuinte de 80% H₂O = 0,80 g/mL. Consequentemente, cada mL de uma solução de EtOH a 20% (v/v) é composto por 0,1578 (EtOH) + 0,80 (H₂O) = 0,9578 g/mL. Portanto, a equação final ao usar a concentração de EtOH de 20% (v/v) é:
      
   2. Calcule a dose de etanol consumida usando a equação abaixo. Utilizar os pesos corporais obtidos na mesma semana que os dados de consumo para calcular o etanol consumido em termos de peso corporal animal.
      
   3. Calcule a preferência usando a seguinte equação:
      
4. Como sua contraparte de mouse³⁰, o LIQ HDR captura uma variedade de variáveis de microestrutura de bebida, incluindo duração da lambida, número da luta, duração da sessão, número da lambida e duração da lambida (Figura 6K). Uma bebedeira é definida como uma série de lambidas que começa com pelo menos 3 lambidas realizadas em menos de 1 segundo e termina após 3 segundos sem lambidas adicionais. Essas medidas podem então ser usadas para calcular a duração média individual da lambida, a duração média da sessão individual, o número médio de lambidas por luta, a frequência média da lambida, o intervalo estimado entre as lambidas e o intervalo estimado entre as lutas.
   NOTA: A interface do microcontrolador fornece esses dados de microestrutura com resolução de 1 minuto em um arquivo .csv (Figura 6K). Os pesquisadores podem usar o aplicativo de análise fornecido com o protocolo LIQ HD original³⁰ ou sua plataforma de pós-processamento preferida para agrupar e resumir dados de acordo com as necessidades de pesquisa. Os dados de microestrutura são normalmente somados ao longo de todo o período de 24 horas para comparar as diferenças médias em um nível macro, ou em 30 minutos a 1 h para examinar as variações do padrão de consumo em um ciclo claro-escuro.

Resultados

Dados de consumo de EtOH de gaiola doméstica intermitente padrão de duas garrafas
Usando o procedimento padrão (Figura 7A), os pesquisadores podem capturar a ingestão de 24 h (Figuras 7B-D), bem como o consumo excessivo de álcool, se os pesos das garrafas forem coletados logo após o início da sessão de consumo (Figuras 7E-F). Ao calcular a ingestão de etanol em relação à ingestão de água, os pesquisadores também podem obter dados de preferência em todos os pontos de tempo medidos (Figuras 7D,F). Conforme mostrado em Figura 7C, os ratos freqüentemente exibem um período de escalada na ingestão de etanol ao longo dos primeiros dias de acesso à escolha de duas garrafas. Isso é seguido por um platô durante o qual a ingestão permanece relativamente estável. Embora consistentemente observado em ratos machos^{7,32,33,34,35,36}, esse padrão nem sempre é observado em fêmeas. Em vez disso, alguns estudos relatam níveis estáveis de ingestão de etanol durante todo o período do estudo em ratos fêmeas^37,38. Além disso, alguns estudos sugerem que a ingestão de etanol pode aumentar ainda mais com períodos mais prolongados de acesso^36,39. A ingestão diária pode variar significativamente entre os indivíduos. No entanto, a ingestão média diária foi bem caracterizada para as cepas mais comumente usadas na pesquisa de álcool e pode ser usada como referência para o sucesso ao analisar dados agrupados^{7,8,33,34,35,39}.

Como mostrado em Figura 7E, muitos ratos consomem uma porção significativa de sua ingestão diária de etanol logo após o início da sessão de bebida^8,33. Esse padrão de ingestão de etanol semelhante a uma compulsão é frequentemente associado a uma preferência significativa por etanol em vez de água (Figura 7F). Os pesquisadores não devem se surpreender, no entanto, se a preferência de 24 horas não exceder 50%. Isso é particularmente verdadeiro para linhagens de roedores não consanguíneos ou que não preferem álcool e estudos limitados a períodos relativamente curtos de acesso à escolha de duas garrafas^{7,32,33,35,37}.

Validação de LIQ HDR para análise da microestrutura de bebida de escolha de duas garrafas
A adição do sistema LIQ HDR ao paradigma padrão de escolha de duas garrafas de rato permite que os pesquisadores prevejam com precisão a ingestão usando dados de consumo capturados. Isso é confirmado pela presença de uma correlação forte e significativa entre o número cumulativo de lambidas detectadas e a mudança nos pesos das garrafas para a garrafa de EtOH (R² = 0,7789, F _(1,113) = 398,1, p < 0,0001) e H₂O garrafa (R² = 0,7910, F _(1,117) = 442,9, p < 0,0001) durante um período de 24 h (Figura 8A). Isso também é verdade para os dias em que os ratos receberam duas garrafas contendo H₂O (R² = 0,8875, F _(1,188) = 1484, p < 0,0001; Figura 8B).

LIQ HDR também permite uma análise precisa dos padrões de consumo em uma alta resolução temporal que não é oferecida pelo paradigma padrão de escolha de duas garrafas. Usando essa abordagem, os pesquisadores têm a oportunidade de examinar as diferenças nos padrões de consumo entre diferentes soluções, ao longo do ciclo de luz, entre sexos, grupos de drogas e muito mais. Para ilustrar, agrupar licks médios em intervalos de 30 minutos permite uma análise fácil dos padrões médios de consumo de 24 horas. Como esperado, esta análise revela ingestões significativamente mais altas de EtOH e H₂O durante o ciclo escuro, quando os ratos estão acordados, do que no ciclo de luz, quando os ratos estão tipicamente dormindo (Figura 8C). Usando uma abordagem semelhante, os pesquisadores podem explorar as diferenças de grupo nos padrões de consumo. Por exemplo, a microestrutura de beber pode ser comparada entre ratos machos e fêmeas examinando o número médio de lambidas para EtOH (Figura 8D) ou água (Figura 8E) em um período de 24 horas. Para investigar o carregamento antecipado e / ou consumo excessivo de álcool, os pesquisadores podem aumentar a resolução de sua análise para se concentrar no consumo que ocorre logo após o início da sessão, usando uma janela menor para resumir os dados. Isso permite que os pesquisadores investiguem períodos de consumo excessivo de álcool sem exigir a coleta de vários pesos de garrafa em um período de 24 horas. Conforme mostrado em Figura 8C (inserção), esta análise revela que a maior parte do consumo capturado por um peso de garrafa obtido 30 min após o início da sessão ocorre nos primeiros 5 min, e não ao longo do período de 30 min. Dados como esses podem auxiliar na identificação de momentos ideais para a coleta de amostras de sangue para medir a concentração de etanol no sangue (BEC). De fato, um padrão semelhante de carregamento frontal foi observado em um dia separado de consumo durante o qual os padrões de consumo de alta resolução foram capturados em um período tão curto quanto 15 min (Figura 8F). A média de lambidas registradas durante esta sessão previu de forma confiável a mudança no peso da garrafa (EtOH: R² = 0,6316, F _(1,10) = 17,15, p = 0,0020; H₂O: R² = 0,8601, F_(1,10) = 61,47, p < 0,0001; Figura 8G). Além disso, os BECs retirados de amostras de sangue obtidas 15 min após o início da sessão correlacionaram-se bem com o número de lambidas detectadas (R² = 0,4327, F_(1,10) = 7,627, p = 0,0201; Figura 8H) mesmo para níveis relativamente baixos de ingestão de EtOH.

LIQ HDR captura várias medidas da microestrutura de consumo que são detectadas e calculadas em tempo real durante as sessões de consumo e salvas em caixas de 1 minuto semelhantes à detecção de lamber (Figura 6K). Essas medidas são brevemente descritas na etapa 5.4 e definidas anteriormente³⁰. Os pesquisadores podem realizar análises detalhadas das mudanças na microestrutura individual de consumo e examinar como e em que grau os padrões de consumo contribuem para as diferenças na ingestão geral. Para ilustrar, descobrimos que, embora ratos machos e fêmeas exibissem um número semelhante de lambidas, bebedeiras e duração da sessão (Figura 9A-C) ao beber água, isso foi associado a uma maior ingestão geral (g/kg) em fêmeas do que em machos (teste t; t=2,882, df=10, p=0,0163; Figura 9D). Isso é esperado dado o dimorfismo sexual no peso corporal, o que facilita maiores níveis de ingestão por peso corporal para as fêmeas do que para os machos para um número equivalente de lambidas. Surpreendentemente, isso contrasta com a comparação das diferenças sexuais nos padrões de microestrutura para EtOH, que revelou microestrutura de consumo semelhante associada a níveis semelhantes de ingestão de EtOH (Figuras 9E-H). Esses dados sugerem que, embora o volume de lambida para água seja semelhante entre os sexos, em comparação com os machos, as ratas têm menor volume de lambida para EtOH. Juntos, esses dados microestruturais apóiam a ideia de que ratos machos e fêmeas provavelmente diferem em estratégias de consumo voluntário com base no tipo de líquido consumido no ambiente doméstico. Trabalhos anteriores também relataram diferenças entre os sexos nas estratégias de consumo que dependem do tipo de fluido^40,41, embora as diferenças observadas nesses estudos não tenham se limitado apenas ao consumo de água. A duração da história de consumo pode desempenhar um papel nas diferenças observadas entre os estudos, pois o consumo de duas garrafas foi limitado a 5 semanas no conjunto de dados atual, enquanto excedeu 12 semanas no trabalho anterior^40,41.

Figura 1: Bebida em gaiola doméstica com duas garrafas. (A) Os pesquisadores podem medir a ingestão voluntária de etanol em gaiolas domésticas e a preferência (em relação à água) usando uma abordagem padrão que calcula a ingestão com base na mudança no peso da garrafa. (B) Ao usar o LIQ HDR, um sistema de detecção de lambedores de gaiola doméstica de baixo custo projetado para ratos, os pesquisadores podem adquirir as mesmas medidas do procedimento padrão de escolha de duas garrafas, ao mesmo tempo em que capturam a microestrutura de bebida de alta resolução durante todo o período de gravação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Construção de unidades de sensores capacitivos. (A) Peças eletrônicas e diagrama de fiação. (B) Materiais para a construção de três unidades de sensores capacitivos necessários para construir um sistema LIQ HDR. (C) Solde os cabos conectores fêmea de 2 pinos para as gaiolas #1-6 para a placa Um pino #0-11 e prenda as juntas de solda com cola quente. Codifique os cabos por cores com tubos termorretráteis coloridos e etiquete, cada um com um número de identificação de licômetro exclusivo. (D) Conecte a placa A e o deslocador de nível de 5 V para 3 V a um ponto final de breakout de comunicação diferencial I²C com cabos de 4 pinos (1) e placa interna A e o breakout de comunicação no invólucro impresso em 3D (2-3). (E) Altere os endereços I²C das placas B e C soldando um fio jumper do pino ADDR aos pinos 3Vo e SDA, respectivamente. (F) Solde os cabos do conector fêmea de 2 pinos nas placas do sensor B e C, etiquete com os IDs de licômetro correspondentes e conecte a placa B a um ponto médio de breakout de comunicação e a placa C a um ponto final com cabos de 4 pinos. (G) Alojar as unidades de sensor B e C em seus respectivos estojos impressos em 3D e encadear todas as três unidades com cabos Ethernet. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Construa o lickômetro LIQ HDR. (A) Renderização 3D dos componentes da gaiola. (B) Materiais para a instalação de um lickômetro de duas garrafas. Observe que um sistema LIQ HDR acomoda 18 lickômetros de duas garrafas. (C) Estenda o comprimento do cabo conector macho de 2 pinos com um par de fios preto e vermelho e código de cores com tubo termorretrátil. (D) Passe os fios preto e vermelho pelas aberturas esquerda (L) e direita (R) no porta-garrafas (1) e solde as extremidades nas fitas de cobre (2-3). (E) Cole as fitas de cobre nas paredes internas dos suportes do bebedouro (1-2) e reforce-as com cola quente (3-4). (F) Passe o cabo pelo protetor de cabo. (G) Instale o clipe de cabo. (H) Rotule o conector com o número de identificação do licômetro correspondente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Instalação do lickometer. (A) Use fita isolante para isolar as hastes de metal ao redor das aberturas do bebedor na parte superior da gaiola de metal. (B) Instale o lickômetro e o painel de acrílico no topo da gaiola com dois conjuntos de parafusos e porcas M5. (C) Prenda o clipe de cabo na haste mais externa da parte superior da gaiola de arame. (D) Certifique-se de usar o protetor de cabo apropriado (L esquerdo ou R direito) para cada gaiola. (E) Certifique-se de que apenas ~ 2 cm dos bebedouros de mamadeira estejam expostos (1), de modo que, quando os biberões forem colocados na gaiola (2), apenas as pontas dos bebedouros se estendam além do painel de acrílico e sejam acessíveis aos ratos. (F) A parte superior do filtro deve caber sobre o clipe do cabo sem perturbar o próprio cabo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Instalação e uso do bloqueador de sipper. (A) Renderização 3D do bloqueador de gole. (B) Peças impressas em 3D personalizadas para um bloqueador de sipper. (C) Monte as peças impressas em 3D. (D) Instale o bloqueador de sipper montado no topo da gaiola com um parafuso M5 + porca + arruela. (E) Gire o botão no sentido horário para bloquear o acesso aos goles. (F) Gire o botão no sentido anti-horário para remover os bloqueadores dos sippers (1), levante os bloqueadores e gire 90° (2) e continue girando o botão no sentido anti-horário até que os bloqueadores estejam acima do topo da gaiola (3-4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Configuração do biotério e operação da GUI. (A) Configuração recomendada do biotério e diagrama de fiação. (B) Monte cada unidade de sensor nas prateleiras e organize e estabilize os cabos do sensor nas prateleiras. (C) Monte a interface do microcontrolador na prateleira e conecte seu jumper de 4 pinos ao deslocador de nível de 5V para 3V conectado à unidade do sensor A. (D) Prenda o fio terra extra com fita isolante. (E) Conecte os cabos do sensor aos cabos lickometer correspondentes. (F) Conecte a fonte de alimentação para ligar a interface do microcontrolador. (G) Página principal da interface GUI. (H) Toque em Configurações para ajustar o tempo de ligar/desligar as luzes para a programação de luzes do viveiro (1) e toque em Configurações do sensor para ajustar os limites de toque e liberação para ratos (2). (I) Para registrar dados, selecione o lado da garrafa EtOH na página principal, toque em INICIAR! para calibrar os sensores (1) e iniciar a gravação (2). Toque em Atualizar para atualizar o número de lick mostrado na tela e toque em Salvar e Sair para interromper a gravação. (J) Toque em Ejetar SD na página principal para remover o cartão SD e transferir dados. Toque em Montar SD após inserir o cartão SD. (K) Captura de tela de um arquivo de dados brutos representativo ilustrando como os dados da microestrutura são salvos em 1 min bin pela interface do microcontrolador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Dados representativos de consumo de duas garrafas capturados usando o procedimento padrão. No paradigma de beber EtOH de gaiola doméstica de acesso intermitente de duas garrafas, (A) os ratos recebem 20% (v / v) de solução de EtOH (laranja) e H₂O (azul) às segundas, quartas e sextas-feiras (MWF) e duas garrafas contendo H₂O às terças, quintas e fins de semana. (B) As medidas de ingestão diária de líquidos revelam que, embora os ratos mantenham um nível relativamente consistente de ingestão total de líquidos (mL) durante todo o período do estudo, (C) os ratos geralmente exibem aumento na ingestão de EtOH ao longo das primeiras sessões de bebida, após o que os níveis de ingestão se estabilizam. (D) Este padrão de escalonamento e manutenção é refletido de forma semelhante na preferência por EtOH. Os pesquisadores também podem capturar a ingestão de EtOH (E) se os pesos das garrafas forem coletados após os primeiros 30-60 minutos do início da sessão. (F) Isso é frequentemente associado a uma alta preferência por EtOH em vez de H₂O. As barras de erro sombreadas representam ± SEM (n = 32 para homens e n = 16 para mulheres). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: LIQ HDR captura com precisão o consumo em alta resolução temporal. A precisão e exatidão do sistema LIQ HDR são confirmadas, em parte, pela presença de uma correlação positiva significativa entre o número de lambidas e a mudança no peso da garrafa nos dias em que os ratos recebem (A) H₂O e EtOH, bem como (B) dias em que ambas as garrafas contêm H₂O. (C) Diferenças nos padrões de consumo entre H₂O (azul) e EtOH (laranja) durante o período de consumo de 24 horas podem ser facilmente avaliados agrupando as lambidas médias em intervalos de 30 minutos. A inserção corresponde à média de lambidas em caixas de 5 minutos durante os primeiros 30 minutos de acesso à garrafa (destacados em cinza), durante os quais os ratos geralmente exibem um comportamento significativo de carregamento frontal. As diferenças entre os grupos nos padrões de consumo também podem ser examinadas usando uma abordagem semelhante, exemplificada pela microestrutura de lambida para (D) EtOH e (E) H₂O representados para ratos machos e fêmeas em um período de 24 horas. (F) Os padrões de consumo também podem ser avaliados em alta resolução temporal em um período de teste mais curto, (G) durante o qual o LIQ HDR continua a rastrear com precisão a ingestão e (H) prever a concentração de etanol no sangue (BEC) mesmo para níveis relativamente baixos de ingestão de EtOH. As barras de erro sombreadas representam ± SEM (n = 6 para cada sexo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Dados representativos da microestrutura de beber. O LIQ HDR permite a captura de medidas da microestrutura de beber, incluindo (A) o número de lambidas, (B) o número de bebedeiras e (C) a duração da sessão, além de (D) medir a ingestão total de água por uma mudança no peso da garrafa. (E-H) Medidas semelhantes podem ser obtidas para o etanol. As comparações entre os grupos dessas medidas podem identificar padrões distintos de consumo, como é o caso do exemplo atual, que revela diferenças entre os sexos nas estratégias de consumo com base na solução consumida. A linha sólida indica mediana e as linhas pontilhadas indicam quartis (n = 6 para cada sexo); teste t não pareado; *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Suplementar Figura 1: Configuração da interface do microcontrolador. (A) Peças eletrônicas e diagrama de fiação. (B) Materiais para construir a interface do microcontrolador necessária para um sistema LIQ HDR. (C) Na parte de trás do protetor de toque capacitivo, adicione um jumper de solda nas almofadas de solda traseiras. (D) Na parte de trás da blindagem de registro de dados, corte o traço do jumper pad do pino CS (1). Solde um fio jumper do pino CS ao pino #7 (2). (E) Solde os pinos do cabeçalho no registrador de dados usando o protetor de toque como base. (F) Empilhe o cabeçalho 2x4 restante no microcontrolador (1), empilhe o registrador de dados no microcontrolador e solde o cabeçalho no lugar (2). (G) Insira a bateria tipo moeda no registrador de dados (1), empilhe a tela sensível ao toque no registrador de dados e insira o cartão SD no registrador de dados (2). (H) Para fazer o fio terra extra, corte um conector macho do fio jumper e solde a extremidade a um fio de núcleo sólido desencapado. (I) Conecte os fios jumper de 4 pinos e o fio terra extra ao microcontrolador (1) e prenda com cola quente (2). (J) Alojar a interface do microcontrolador no invólucro personalizado impresso em 3D. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O protocolo atual fornece instruções passo a passo para capturar dados de consumo de etanol usando um procedimento de gaiola doméstica de acesso intermitente de duas garrafas. Este método pode ser implementado com relativa facilidade e com pouco ou nenhum custo ou necessidade de equipamentos de pesquisa especializados. Usando os procedimentos fornecidos aqui para construir e implementar o LIQ HDR - um sistema de detecção de lambedura para uso em ratos - os pesquisadores podem capturar dados de microestrutura de consumo de alta resolução, além de medidas padrão de ingestão e preferência.

O esquema de acesso intermitente descrito no protocolo atual é um procedimento amplamente utilizado em grande parte porque é bem conhecido por gerar níveis mais altos de ingestão de etanol do que muitos esquemas alternativos de acesso ao etanol. De fato, pesquisas anteriores mostraram que ratos com acesso em um horário intermitente têm maior ingestão média diária de etanol do que ratos com acesso contínuo de 24 horas ^6,7. No entanto, diferentes esquemas de acesso ao etanol podem ser desejáveis, dependendo da questão de pesquisa ou de outros parâmetros de projeto experimental. Os pesquisadores podem modificar facilmente o protocolo atual para acomodar diferentes horários (por exemplo, acesso contínuo, beber no escuro, etc.) simplesmente alterando o horário e os dias de ligar/desligar a garrafa.

Embora o consumo de duas garrafas seja um paradigma relativamente simples de implementar, podem surgir problemas que têm o potencial de comprometer a coleta de dados. É, portanto, crucial que os experimentadores inspecionem os dados diariamente para identificar rapidamente possíveis problemas. Em particular, os pesquisadores devem prestar muita atenção a mudanças muito grandes ou muito pequenas no peso das garrafas que podem ser indicativas de um gole com vazamento ou entupido, respectivamente. Detectar sinais desses problemas precocemente pode impedir a exclusão de todos os dados de um determinado assunto da análise. De fato, se os pesquisadores notarem mudanças drásticas (ou ausência de mudança) no peso da garrafa em um período de 24 horas, uma simples mudança para uma nova garrafa pode ajudar a confirmar se uma determinada garrafa deve ser retirada de circulação. Por esses motivos, é aconselhável ter garrafas e goles extras à mão. No entanto, deve-se notar que alguns ratos exibem naturalmente níveis muito baixos de consumo de etanol, por ^exemplo,35. Isso é particularmente verdadeiro para ratos de certas cepas, consulte⁸ para revisão. Assim, os pesquisadores não devem se alarmar se uma pequena população de animais em um determinado experimento tiver baixo ou nenhum consumo de etanol. Da mesma forma, alguns animais são propensos a brincar com o bebedor/garrafa de maneiras que podem promover derramamento. Embora raros, casos repetidos de altas mudanças no peso da garrafa que não estão associados ao consumo podem exigir que um determinado animal seja removido do experimento.

Nosso protocolo passo a passo detalhado demonstra a facilidade de implementação e uso do sistema LIQ HDR para ratos. Pesquisadores sem conhecimento prévio ou habilidades em eletrônica e programação de microcontroladores podem adaptar prontamente este sistema às suas necessidades experimentais com pouca ou nenhuma modificação. Nossos dados representativos demonstram ainda mais sua aplicação bem-sucedida para estudos de consumo de álcool em gaiolas domésticas de ratos e sua poderosa capacidade de capturar inúmeras medidas de microestrutura de consumo em alta resolução temporal. O LIQ HDR inclui várias modificações de design em relação ao seu antecessor de mouse³⁰. Isso foi feito não apenas como uma necessidade para uma adaptação bem-sucedida para uso em ratos, mas também para melhorar a funcionalidade e a experiência do usuário. Os componentes da gaiola, incluindo o porta-garrafas impresso em 3D, o bloqueador de sipper e os componentes eletrônicos, são realocados para a parte superior da gaiola para proteger contra a mastigação, o que pode resultar em perda frequente e significativa de dados e rotatividade de hardware. A adição de um painel de acrílico cortado a laser ajuda ainda mais a evitar a destruição desses componentes vulneráveis. Além do painel de acrílico, que é o mesmo material de uma gaiola de rato de caixa de sapatos padrão, todos os outros componentes LIQ HDR são inacessíveis ao animal de dentro da gaiola ou acessíveis apenas por um breve momento durante a troca da garrafa. Este projeto limita o potencial de destruição dos componentes do dispositivo e o risco para o animal por meio da ingestão de itens não alimentares. Em contraste com as garrafas personalizadas relativamente trabalhosas usadas no design LIQ HD, o porta-garrafas impresso em 3D da LIQ HDR foi projetado para ser compatível com garrafas comerciais de roedores prontas para uso. As mamadeiras são instaladas no topo da gaiola e acessíveis aos ratos da mesma forma que as mamadeiras são aplicadas durante o tratamento padrão e a criação. A adição de bloqueadores sipper é uma solução simples, mas eficaz, que melhora a confiabilidade do sistema e evita a perda de dados valiosos que, na ausência do bloqueador, pode resultar do consumo que ocorre antes de iniciar a captura de dados na interface do Arduino ou medidas errôneas de lambida que ocorrem quando os ratos interagem com os sipers durante a calibração diária. Embora as gaiolas de rato consideravelmente maiores exijam a ampliação do tamanho do design de hardware original, o uso de cabos significativamente mais longos pode afetar negativamente a sensibilidade e a precisão da detecção capacitiva devido à interferência, bem como a integridade da comunicação I²C entre as placas de sensor encadeadas e a interface Arduino. Contornamos esse problema com a adoção do sistema de comunicação diferencial I²C para obter transmissão de sinal de alcance ultralongo e quase sem perdas por meio de cabos Ethernet. Os materiais usados para os componentes da gaiola permitem fácil limpeza e desinfecção entre os usos. O lickômetro pode ser esterilizado e limpo com solução de EtOH a 70%, enquanto deve-se tomar cuidado para garantir que os componentes elétricos, como a fita de cobre condutora, permaneçam intactos. Equipamentos não elétricos que estão em contato direto com o animal, como o bloqueador de sorvete e o painel de acrílico, podem ser bem lavados com água morna e sabão.

A confiabilidade e a eficácia de qualquer sistema de detecção de lambedura requerem construção e instalação adequadas, bem como testes extensivos, monitoramento diligente de erros e solução de problemas eficaz. Todos os componentes DIY precisam ser feitos e montados com habilidade e cuidado. Isso é especialmente importante para etapas que envolvem soldagem, que podem exigir prática para iniciantes. Independentemente disso, testes extensivos de todos os licômetros são necessários antes do uso em experimentos reais. Se o sistema precisar ser modificado para se adaptar às necessidades experimentais individuais, as configurações do sensor (por exemplo, limites de toque e liberação) podem precisar ser ajustadas para uma detecção precisa de lambidas. Para usuários iniciantes, sugerimos testar o sistema em um estudo piloto breve e de pequena amostra usando uma solução altamente palatável que gerará altos níveis de consumo de álcool. A detecção de lambida pode ser verificada em tempo real inspecionando visualmente a placa do sensor, pois o LED pisca sempre que uma lambida é registrada. Correlações fortes, significativas e consistentes entre o número de lambeduras e a mudança no peso da garrafa devem ser usadas como referência para a configuração adequada de hardware e software. Mesmo após a finalização da configuração, recomendamos iniciar a gravação de um determinado experimento em um dia em que os ratos recebem duas garrafas contendo água para solucionar problemas de equipamento que podem ser evidentes no início de um experimento. Também pode ser vantajoso testar a função do lickômetro no dia da água associada à troca da gaiola, pois isso requer que os lickômetros sejam desconectados e reconectados ao sensor. A falha aleatória do lickômetro ou sensor individual, que resultaria em dados discrepantes muito óbvios (por exemplo, nenhuma ou poucas lambidas detectadas apesar de uma mudança substancial no peso da garrafa) consistentemente para o mesmo licômetro, é indicativa de componente(s) defeituoso(s). Recomendamos preparar componentes extras para cada elemento do sistema de licômetro com antecedência para permitir uma fácil substituição conforme necessário. Finalmente, a importância de garantir que os cabos do sensor não se sobreponham ou dobrem excessivamente não pode ser subestimada. Isso pode resultar em casos aleatórios de detecção de lambida ruim, evidente por um número de lambida excessivamente baixo para uma determinada mudança no peso da garrafa ou durações de lambida extremamente grandes (perto de 60.000 ms para uma caixa de 1 minuto) abrangendo minutos ou horas. No entanto, pequenas perdas de dados são inevitáveis em estudos que coletam dados em 24 horas para muitos animais ao longo de muitos dias usando a abordagem padrão ou equipada com licômetro. Os pesquisadores podem excluir dados errôneos para as raras sessões de consumo quando os pesos das garrafas e / ou lambidas claramente não refletem a ingestão (por exemplo, entupimento do bebedor, erro de calibração, etc.). Em ocasiões como essas, o valor médio de uma determinada medida (por exemplo, ingestão (g/kg), lambidas, etc.) durante o período de estudo para esse assunto específico pode ser substituído pelo valor ausente durante a análise dos dados. A ANOVA de efeitos mistos também pode ser usada como uma alternativa para acomodar pontos de dados ausentes.

Uma das vantagens do paradigma de beber com duas garrafas é o aspecto voluntário da ingestão de etanol. Isso proporciona excelente validade de face, particularmente à luz dos achados que mostram que o álcool administrado pelo experimentador pode produzir efeitos significativamente diferentes na função cerebral e no comportamento em comparação com o álcool autoadministrado voluntariamente⁴². Além disso, a natureza voluntária do paradigma permite que os pesquisadores capturem diferenças individuais na ingestão semelhantes à variabilidade na preferência pelo álcool e nos padrões de consumo observados em humanos. Essas diferenças individuais podem fornecer uma oportunidade poderosa para os pesquisadores correlacionarem o consumo (ingestão e / ou padrões) com a magnitude dos efeitos patológicos observados.

No entanto, algumas limitações do paradigma de beber em gaiola doméstica de duas garrafas devem ser consideradas. Por exemplo, embora a variabilidade individual na ingestão de etanol possa ser vantajosa para alguns experimentos, pode ser uma desvantagem em outros experimentos onde um nível consistente de intoxicação ou exposição ao etanol pode ser desejável. Isso é particularmente verdadeiro para experimentos que examinam as consequências da dependência e abstinência da exposição crônica ao etanol. É importante ressaltar que o consumo de duas garrafas não é caracterizado como um modelo de dependência - mesmo em ratos com acesso ao etanol por períodos prolongados de tempo. Assim, na ausência de sintomas de abstinência associados, os pesquisadores devem ter cautela ao interpretar as consequências do consumo prolongado de etanol como efeitos da dependência e/ou abstinência. De fato, é possível, se não plausível, que ratos que bebem quantidades relativamente grandes de etanol durante o procedimento de escolha de duas garrafas exibam sintomas de abstinência, mas que ratos que bebem volumes totais mais baixos em um determinado período de 24 horas não mostrem sinais semelhantes de dependência. Os padrões de consumo também podem desempenhar um papel importante nessa consideração, pois dois animais que bebem a mesma quantidade durante um período de 24 horas podem experimentar níveis muito diferentes de intoxicação (ou seja, BEC), dependendo do padrão de ingestão de etanol²². Isso destaca a utilidade do LIQ HDR no procedimento de escolha de duas garrafas, pois pode identificar prontamente ratos que consomem uma determinada dose de etanol em um ritmo rápido (ou seja, engolir) versus aqueles que consomem a mesma dose em um ritmo muito mais lento (ou seja, gole). Embora potencialmente indesejável para estudos que investigam os efeitos de uma dose controlada de etanol, a detecção de mudanças nos padrões de consumo (por exemplo, episódios de compulsão alimentar reduzidos) após uma intervenção experimental específica tem valor translacional significativo, dada a abordagem de redução de danos que é cada vez mais adotada na clínica. Finalmente, não é necessário esforço para que os animais tenham acesso ao etanol em paradigmas de consumo doméstico em gaiolas, incluindo o descrito aqui. Portanto, a utilidade desse paradigma é limitada à análise apenas do consumo de álcool, enquanto os métodos operante são favorecidos nos casos em que os pesquisadores estão interessados em examinar a busca de álcool - uma característica importante do AUD.

Em resumo, o protocolo descrito aqui fornece aos pesquisadores todas as informações e recursos necessários para medir a ingestão de etanol em ratos em gaiolas domésticas. Apresentamos opções para abordagens de resolução relativamente baixa e alta, proporcionando aos pesquisadores a flexibilidade de escolher o método mais adequado às suas necessidades de pesquisa.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Componentes disponíveis comercialmente			Quantidade
Quebra do sensor de toque capacitivo de 12 teclas (MPR121)	Adafruit	1982	3
Par correspondente de cabo de 2 pinos (passo JST XH 2,5 mm)	Adafruit	4872	18
Jumper de placa de ensaio de 4 pinos (Qwiic)	SparkFun	PRT-17912	1
Cabo de 4 pinos (Qwiic de 100 mm)	SparkFun	PRT-17259	1
cabo de 4 pinos (Qwiic de 50 mm)	SparkFun	PRT-17260	3
breakout de deslocador de nível de 5V para 3V Adafruit		5637	1
Protetor de toque capacitivo (2,8 polegadas)	Adafruit	1947	1
Fita condutora de cobre (1/4 de polegada)	DigiKey	4393-CFT-1/4-ND	1
Dados escudo de registro	Adafruit	1141	1
Kit de breakout de comunicação diferencial I2C (QwiicBus)	SparkFun	KIT-17250	1
Fita isolante	DigiKey	3M156004-ND	1
Tubo termorretrátil (3/16 polegadas várias cores)	Abraçadeiras e mais	HS357-S10	6
Kit de tubo termorretrátil (4 polegadas preto)	Jameco	2095963	1
Bateria de lítio para moedas (3V 12.5mm)	DigiKey	1908-CR1220JAUCHSB-ND	1
arruela plana M5	Grainger	54FN66	1
porca hexagonal M5	Grainger	6CA72	1
parafuso de máquina M5 (12mm)	Grainger	6GU88	1
M5 parafuso de máquina (25mm)	Grainger	6GU91	2
Fio jumper macho/macho	Adafruit	1957	1
Placa microcontroladora (Arduino Mega 2560 Rev3)	DigiKey	1050-1018-ND	1
filamento PETG (prata 2,85mm)	MatterHackers	M-DDH-UZR2	2
filamento PLA (2,85mm preto)	Filamento PLA	MatterHackers M-SEW-RUAW	2
(prata 2,85mm)	MatterHackers	M-66P-6CLE	1
Fonte de alimentação (DC 9V 1A)	Newegg	9SIBPPKJYR5991	1
cartão de memória SD/microSD (8GB)	Adafruit	1294	1
Conectores de empilhamento de blindagem	Adafruit	85	1
Fio de núcleo sólido (vermelho 22AWG)	Adafruit	288	1
Fio de núcleo trançado (22AWG preto)	Adafruit	2976	1
Fio de núcleo trançado (vermelho 22AWG)	Adafruit	3068	1
Tubo de sipper com tampa de torção com bola	Design alternativo	TCCN8.5-ST2.5SB	38
Garrafa de água (8oz)	Design alternativo	WB8FS	38
Custom Componentes impressos em 3D			Quantity
3D-printed Arduino case bottom	N/A	ARDUINO_Bottom.stl	1
Tampo de caixa Arduino impresso em 3D	N/A	ARDUINO_Top.stl	1
Clipe de cabo impresso em 3D L	N/A	CLIP_L.stl	18
Porca de clipe de cabo impresso em 3D	N/A	CLIP_Nut.stl	18
Clipe de cabo impresso em 3D R	N/A	CLIP_R.stl	18
Suporte para garrafa de lickometer impresso em 3D	N/A	LICKOMETER_Bottle Holder.stl	19
Protetor de cabo de licômetro impresso em 3D L	N/A	LICKOMETER_Cable Protector_L.stl	6
Protetor de cabo de licômetro impresso em 3D R	N/A	LICKOMETER_Cable Protector_R.stl	12
letras de licômetro impresso em 3D	N/A	LICKOMETER_Letters.stl	19
Parafuso de montagem impresso em 3D	N/A	Parafuso de montagem.stl	4
Estojo do sensor impresso em 3D A inferior	N/A	SENSOR_A_Bottom.stl	1
Estojo do sensor impresso em 3D A superior	N/A	SENSOR_A_Top.stl	1
Estojo do sensor impresso em 3D B inferior	N/A	SENSOR_B_Bottom.stl	1
Estojo do sensor impresso em 3D B superior	N/A	SENSOR_B_Top.stl	1
Estojo do sensor impresso em 3D C inferior	N/A	SENSOR_C_Bottom.stl	1
Estojo do sensor impresso em 3D C top	N/A	SENSOR_B_Top.stl	1
Letras do estojo do sensor impresso em 3D	N/A	SENSOR_Letters.stl	1
Bloqueador de sipper impresso em 3D	N/A	SIPPER_Blocker.stl	36
Base do bloqueador de sipper impresso em 3D	N/A	SIPPER_Base.stl	18
Engrenagem do bloqueador de sipper impresso em 3D	N/A	SIPPER_Gear.stl	18
Porca bloqueadora de sipper impressa em 3D	N/A	SIPPER_Nut.stl	18
Worm bloqueador de sipper impresso em 3D	/A	SIPPER_Worm.stl	18
Painel acrílico de lickometer cortado a laser	N/A	LICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf	19