Modelagem do consumo de álcool em roedores usando o consumo de álcool em gaiola doméstica de escolha de duas garrafas e análise microestrutural

Resumo

Este protocolo descreve um paradigma padrão de consumo doméstico de duas garrafas de acesso intermitente para modelar o consumo de álcool em ratos. Além disso, fornece instruções passo a passo para aumentar o protocolo padrão com um sistema de detecção de lambedura DIY que permite a análise microestrutural do comportamento de beber.

Resumo

O consumo de bebidas alcoólicas em gaiolas domésticas com duas garrafas é um dos paradigmas mais amplamente utilizados para estudar o consumo de etanol em roedores. Em sua forma mais simples, os animais têm acesso a duas garrafas de bebida, uma das quais contém água da torneira comum e a outra etanol, com ingestão diária medida pela mudança no peso da garrafa durante o período de 24 horas. Consequentemente, essa abordagem não requer equipamento de laboratório especializado. Embora essa facilidade de implementação seja provavelmente o maior contribuinte para sua ampla adoção por pesquisadores pré-clínicos de álcool, a resolução dos dados de consumo adquiridos usando essa abordagem é limitada pelo número de vezes que o pesquisador mede o peso da garrafa (por exemplo, uma vez ao dia). No entanto, o desejo de examinar os padrões de consumo no contexto da ingestão geral, intervenções farmacológicas e manipulações neuronais levou ao desenvolvimento de sistemas de detecção de lambidas em gaiolas domésticas que podem adquirir dados no nível de lambidas individuais. Embora vários desses sistemas tenham sido desenvolvidos recentemente, o sistema de código aberto, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device), atraiu atenção significativa no campo por sua acessibilidade e facilidade de uso. Embora emocionante, este sistema foi projetado para uso em camundongos. Aqui, revisamos os procedimentos apropriados para beber em gaiola doméstica de escolha de duas garrafas padrão e equipado com lickometer. Também introduzimos métodos para adaptar o sistema LIQ HD a ratos, incluindo modificações de hardware para acomodar um tamanho de gaiola maior e um suporte de garrafa impresso em 3D redesenhado compatível com garrafas padrão prontas para uso. Usando essa abordagem, os pesquisadores podem examinar os padrões diários de consumo, além dos níveis de ingestão em muitos ratos, em paralelo, aumentando assim a resolução dos dados adquiridos com investimento mínimo em recursos adicionais. Esses métodos fornecem aos pesquisadores a flexibilidade de usar garrafas padrão ou um aparelho equipado com licômetro para interrogar os mecanismos neurobiológicos subjacentes ao consumo de álcool, dependendo de suas necessidades experimentais precisas.

Introdução

Embora o uso moderado de álcool tenha sido historicamente associado a benefícios moderados para a saúde, estudos abrangentes recentes em larga escala revelaram que nenhuma quantidade de consumo de álcool é segura^1,2. Na verdade, o uso de álcool é o^7º principal fator de risco para morte e incapacidade globalmente¹ com indivíduos que bebem até mesmo pequenas quantidades de álcool tendo risco aumentado de câncer, doenças infecciosas e lesões^1,3. Nos Estados Unidos, as mortes por uso de álcool aumentaram quase 30% entre 2016 e 2021⁴. É importante ressaltar que o risco de morte e incapacidade aumenta monotonicamente com o aumento do consumo¹.

Embora estudos em humanos tenham fornecido informações valiosas sobre a neurobiologia do uso e abuso de álcool, o controle experimental proporcionado por modelos animais é crucial para uma compreensão profunda dos mecanismos subjacentes ao comportamento de beber e ao risco de beber muito. Esses modelos também são ferramentas valiosas para o desenvolvimento de tratamentos que visam reduzir o consumo descontrolado. O consumo de duas garrafas em gaiolas domésticas é um dos paradigmas pré-clínicos mais amplamente utilizados para estudar o consumo de álcool em roedores. Isso se deve, em grande parte, à sua facilidade de implementação, pois permite a medição do consumo voluntário total de álcool e preferência sem a necessidade de equipamentos de pesquisa especializados ou análises complexas. Usando essa abordagem, os pesquisadores podem coletar medições nos intervalos desejados (por exemplo, horas, dias, semanas) calculando a mudança no peso da garrafa do início ao fim de uma sessão de bebida. Variações desse método básico têm sido usadas por muitos no campo para facilitar níveis baixos a moderados a excessivos de ingestão de álcool em curtos e longos períodos de tempo. Por exemplo, procedimentos contínuos e intermitentes de escolha de duas garrafas foram usados para facilitar níveis baixos e moderados de ingestão de álcool, respectivamente, em camundongos⁵ e ratos^6,7,8. Os mesmos paradigmas podem promover altos níveis de ingestão em cepas preferenciais ao álcool^7,9. Alternativamente, uma adaptação deste método que limita o acesso ao álcool a 2-4 h por dia, começando aproximadamente 3 h após o início do ciclo escuro, demonstrou gerar consumo excessivo de álcool em camundongos (ou seja, Drinking in the Dark)^10,11. Variações adicionais desses métodos têm sido usadas em conjunto com métodos que facilitam a dependência do álcool (ou seja, exposição crônica intermitente ao vapor de etanol) para examinar a escalada do consumo voluntário de álcool durante a abstinência^{12,13,14,15,16,17,18,19}.

Embora amplamente adotada pelo campo, a abordagem padrão de medir a ingestão de álcool pela mudança no peso da garrafa é limitada em resolução ao consumo total por sessão de bebida. Consequentemente, essa abordagem é incapaz de capturar padrões de consumo, que são bem conhecidos por afetar tanto o risco quanto a gravidade do transtorno por uso de álcool (AUD)^20,21,22. De fato, a ingestão média de um indivíduo ao longo do tempo pode ser consequência de vários episódios de consumo excessivo de álcool ou muitos episódios de consumo, cada um associado a um consumo relativamente baixo, e essas nuances não são detectadas quando o consumo é medido como ingestão total por sessão de consumo. É importante ressaltar que significativamente mais episódios de consumo associados a grandes crises de consumo (ou seja, engolir) são observados em indivíduos com AUD em relação a controles saudáveis²³ e dados em primatas não humanos sugerem que indivíduos que estabelecem um padrão de consumo de álcool que inclui grandes crises de consumo de álcool no início de sua história de consumo de álcool correm um risco significativo de AUD²². Além disso, episódios de consumo de álcool que incluem grandes períodos de consumo aumentam significativamente o risco de morbidade e mortalidade, independentemente do diagnóstico de AUD²¹. Ao todo, esses dados levaram a um aumento do interesse em examinar os padrões de consumo, além dos níveis de ingestão geral em modelos pré-clínicos e levaram ao desenvolvimento de vários sistemas de complexidade variável que são capazes de capturar dados de consumo no nível de lambidas individuais.

Entre os primeiros estava o desenvolvimento de um sistema de duas garrafas equipado com detecção de lambida de feixe de fotos projetado para uso em camundongos²⁴. Este sistema foi posteriormente adaptado por um grupo separado para uso em ratos²⁵. Nos anos seguintes, variações sobre esse tema foram usadas para desenvolver sistemas semelhantes contidos em alojamentos personalizados para roedores²⁶, que permitem a detecção de lambeduras de animais individuais alojados socialmente^27,28, e que capturam o comportamento alimentar e de beber²⁹. Entre estes, o LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device)³⁰ atraiu atenção significativa por oferecer um sistema para uso em camundongos que se assemelha à facilidade de implementação e acessibilidade do sistema desenvolvido por Godnyuck et al.²⁴. Este sistema utiliza detecção capacitiva para detectar diretamente o contato entre a língua e o tubo condutor do sipper de metal, ao contrário de medidas indiretas, como abordagem ou interação do sipper, que são oferecidas usando o sistema de detecção de feixe de fotos. Os autores fornecem dados que demonstram que seu sistema de detecção capacitiva oferece precisão e sensibilidade significativamente maiores na detecção de lambidas, produzindo correlações mais fortes entre o número de lambidas e a mudança no peso da garrafa do que a detecção de feixes de fotos. Os autores demonstram ainda a capacidade de usar este sistema em conjunto com um paradigma de consumo doméstico de gaiola de escolha de duas garrafas de acesso contínuo para capturar medidas da microestrutura do consumo de álcool, além de medidas de ingestão diária geral³⁰.

Aqui, descrevemos procedimentos para o consumo de álcool em gaiola doméstica de escolha de duas garrafas usando uma abordagem padrão, bem como métodos que permitem a detecção de lambedas (Figura 1). Também introduzimos métodos para construir e implementar LIQ HDR - uma adaptação do LIQ HD³⁰ para uso em ratos que inclui modificações de hardware para acomodar tamanhos de gaiola maiores e um suporte de garrafa impresso em 3D redesenhado compatível com garrafas padrão prontas para uso. Esses métodos fornecem aos pesquisadores a flexibilidade de usar uma abordagem padrão ou equipada com licômetro, dependendo de seus recursos experimentais e necessidades de coleta de dados.

Abaixo está uma descrição dos materiais necessários e instruções passo a passo para capturar o consumo de bebidas alcoólicas em gaiolas domésticas usando o procedimento de consumo de duas garrafas de acesso intermitente adaptado de Simms et al.⁷. Neste procedimento, os ratos têm acesso 24 horas a dois bebedouros, 7 dias por semana. Às segundas, quartas e sextas-feiras (MWF), os ratos recebem uma garrafa contendo água (H₂O) e outra garrafa contendo etanol (EtOH). Essas garrafas são removidas às terças, quintas e sábados (TRS) e substituídas por duas garrafas de água. Os ratos bebem das mesmas duas garrafas de água aos sábados e domingos. Observe que esses métodos podem ser facilmente ajustados para horários alternativos de acesso ao etanol (por exemplo, contínuo, compulsão, etc.), se desejado. Instruções separadas são fornecidas para abordagens padrão e equipadas com licômetro.

Protocolo

Todos os dados representativos foram coletados usando ratos adultos Long-Evans mantidos individualmente, com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Illinois em Chicago e de acordo com as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A criação individual é necessária para monitorar com precisão o consumo de fluidos por cada sujeito. Ratos adultos machos (n = 38) e fêmeas (n = 22) da linhagem Long-Evans tinham entre P50-80 ao chegarem e foram mantidos em aclimatação ao biotério por uma semana antes do início do experimento. Os ratos tinham acesso ad libitum à ração padrão (Teklad 7912, Envigo) e água, salvo indicação em contrário.

1. Preparação antes do experimento

1. Rotule as garrafas de bebida como H₂O ou EtOH. Em seguida, identifique com um código exclusivo para cada rato uma garrafa de H₂O e uma de EtOH para as segundas, quartas e sextas-feiras (MWF) e duas garrafas de H₂O para terças e quintas-feiras (TRS).
   NOTA: Opcionalmente, utilize fitas de cores diferentes para identificar as garrafas de H₂O e EtOH, ajudando a evitar erros durante a troca das garrafas.
2. Encha as garrafas de H₂O com água potável um dia antes da data de início do experimento. Prepare a solução de EtOH misturando EtOH de 190 graus com água potável (20% v/v) um dia antes da data de início do experimento.
   CAUÇÃO: É fundamental que o EtOH utilizado seja não desnaturado, pois o EtOH desnaturado é tóxico.
3. Prepare uma gaiola vazia na mesma prateleira dos ratos que participam do experimento. Essa gaiola será usada para calcular o derramamento.
4. Equipe as gaiolas com o sistema LIQ HDR, se for utilizá-lo (ver passo 3, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6 e Figura Suplementar 1).
5. Determine o horário exato do dia para a troca das garrafas antes do início do estudo. As garrafas devem ser substituídas no mesmo horário todos os dias para obter uma medida precisa do consumo em 24 h.
   NOTA: Pesquisas anteriores mostraram que os roedores apresentam o maior grau de consumo logo após o início do ciclo escuro^10,31. Portanto, para capturar o consumo durante esse período de alta atividade (ver passo 2.3.1 para capturar o consumo semelhante a compulsão), recomenda-se que a troca das garrafas ocorra entre 30 e 60 minutos após o desligamento das luzes. Utilize lâmpadas vermelhas durante a troca para permitir a visualização sem interromper o ciclo claro-escuro.

2. Procedimentos diários e manutenção

1. No primeiro dia do experimento, realize o seguinte.
   1. Remova as garrafas-padrão de água das gaiolas.
   2. Opcional: os ratos frequentemente movimentam a tampa da gaiola enquanto procuram alimento, o que pode causar derramamento que não pode ser corrigido pela gaiola de controle de derramamento. O uso de copos de alimento dentro da gaiola pode atenuar esse problema. Se for utilizá-los, remova o alimento da parte superior da gaiola agora, adicione um copo de alimento dentro da gaiola e encha-o com ração. Certifique-se de que o espaço no piso destinado ao rato ainda atenda às diretrizes institucionais com base no tamanho da gaiola e do copo de alimento.
   3. Informe ao pessoal de cuidados e manejo, conforme aplicável, que a equipe de pesquisa fornecerá alimento e água durante toda a duração do experimento.
   4. As trocas de gaiolas podem interferir na coleta de dados. Realize as trocas de gaiolas simultaneamente à obtenção das medidas de peso corporal. Os pesquisadores que optarem por fazer isso devem informar adequadamente seu pessoal de cuidados e manejo.
2. Nos dias subsequentes, siga os procedimentos descritos abaixo.
   NOTA: Lembre-se de que qualquer movimentação das gaiolas e garrafas pode causar derramamento. Portanto, é importante ser cuidadoso com os movimentos e utilizar os mesmos métodos de colocação e remoção das garrafas na gaiola de controle de derramamento que são usados nas gaiolas de ratos.
   1. Entre na sala antes do horário de troca das garrafas, garantindo tempo suficiente para executar os passos abaixo, e coloque as garrafas novas nas gaiolas no horário de início apropriado da sessão.
   2. Remova as tampas com filtro das gaiolas. Se for segunda, quarta ou sexta-feira, prossiga para o passo 2.2.3. Se for terça, quinta ou sábado, prossiga para o passo 2.2.4.
   3. Nas segundas, quartas e sextas-feiras, remova as garrafas TRS das tampas das gaiolas. Pese as garrafas MWF (uma de EtOH e uma de H₂O). Registre o peso inicial da garrafa para a sessão de consumo de hoje. Forneça alimento adicional na parte superior da gaiola ou nos copos de alimento, se necessário. No horário designado para início da sessão, coloque as garrafas na tampa da gaiola de cada rato com a fita voltada para cima, para que os ratos não mastiguem o rótulo da garrafa.
      NOTA: Normalmente, o consumo de água não é registrado nem relatado para TRS, mas os pesquisadores podem opcionalmente coletar esses dados obtendo os pesos de entrada e saída das garrafas conforme descrito abaixo nos passos 2.2.3 e 2.2.4, se desejado. O lado da garrafa de EtOH deve ser alternado após cada sessão de consumo para evitar o desenvolvimento de preferência por um lado, o que poderia inadvertidamente distorcer os dados de consumo.
      1. Opcional: trabalhos anteriores mostraram que muitos ratos exibem consumo semelhante a compulsão no início da sessão de consumo^8,32,33. A maioria dos pesquisadores que registram o consumo compulsivo durante esse período relata a ingestão nos primeiros 30-60 minutos da sessão. Para obter dados de ingestão durante esse possível episódio de compulsão, siga os passos descritos abaixo.
      2. Acione um cronômetro após colocar as garrafas na última gaiola. Deixe a sala sem perturbações durante o período cronometrado.
      3. Reentre na sala quando o cronômetro soar. Remova as garrafas de EtOH e H₂O e registre os pesos das garrafas. Devolva as garrafas de EtOH e H₂O às gaiolas.
         NOTA: Este passo não é necessário para registrar episódios de compulsão quando se utiliza um sistema equipado para detecção de lambidas.
   4. Nas terças, quintas e sábados, remova as garrafas MWF das gaiolas no horário designado de término da sessão, correspondente a 24 h após o horário de início. Pese cada garrafa e registre o peso final da garrafa para a sessão de consumo MWF. Obtenha e registre o peso corporal de cada rato. Se necessário, forneça alimento adicional na parte superior da gaiola ou nos copos de alimento. Coloque as garrafas de H₂O TRS na parte superior da gaiola de cada rato com a fita voltada para cima, para que os ratos não mastiguem o rótulo da garrafa.
   5. Devolver as tampas com filtro às gaiolas e sair da sala dos animais.
      NOTA: Opcionalmente, cubra os bicos das garrafas de EtOH para evitar evaporação. Se as trocas de gaiolas estiverem sendo realizadas pela equipe de pesquisa, designe um dia por semana durante as tarefas TRS para realizar essa atividade. Coloque cada rato em uma gaiola limpa após obter o peso corporal.
3. Lave as garrafas e reabasteça os fluidos regularmente, semanal ou quinzenalmente, conforme os procedimentos institucionais de cuidados e manejo com animais. Tenha cuidado para realizar essas tarefas de maneira que não interrompa as sessões de consumo. Por exemplo, as garrafas de H₂O TRS podem ser lavadas e reabastecidas após a remoção nas segundas, quartas e sextas-feiras. Da mesma forma, as garrafas de H₂O e EtOH MWF podem ser lavadas e reabastecidas após a remoção nas terças, quintas e sábados.

3. Detecção de lambeduras durante experimentos de escolha em duas garrafas

OBSERVAÇÃO: Pesquisadores interessados em obter dados de consumo com alta resolução podem modificar o procedimento acima adicionando capacidades de detecção de lambidas às garrafas. O LIQ HD³⁰ é um sistema de baixo custo e de montagem caseira (DIY) que permite esse tipo de coleta de dados em camundongos. Os procedimentos descritos abaixo detalham as modificações necessárias para adaptar o LIQ HD para uso em ratos (denominado LIQ HDR). Consulte a Tabela de Materiais para obter a lista de todos os componentes comercialmente disponíveis e peças personalizadas impressas em 3D necessárias para construir um sistema de detecção de lambidas, capaz de registrar dados de escolha entre duas garrafas para até 18 ratos. Os arquivos .stl para impressão 3D e as instruções podem ser encontrados no site do autor (www.ejgloverlab.com/3dprints).

1. Configuração de unidades de sensores capacitivos
   OBSERVAÇÃO: Cada sistema LIQ HDR é composto por três unidades de sensores capacitivos, que juntas capturam dados de lambidas de 36 garrafas em paralelo, correspondendo a 18 ratos mantidos individualmente. Cada unidade de sensor consiste em um diferencial I²placa de expansão C communication e uma placa de sensor capacitivo de 12 teclas, que se conectará aos lickômetros de seis gaiolas separadas por meio de seis pares de cabos de 2 pinos codificados por cores para cada lickômetro (Figura 2A).
   1. Reúna os materiais necessários para a construção das três unidades de sensores capacitivos, conforme mostrado em Figura 2B, juntamente com as ferramentas necessárias de soldagem.
   2. Para começar a montar a unidade sensora A, cubra um cabo conector fêmea de 2 pinos com uma mangueira retrátil térmica vermelha com 7 polegadas de comprimento, insira as extremidades dos fios vermelho e preto nos pinos #0 e #1 da placa do sensorFigura 2C-1) e soldar no lugar (Figura 2C-2). Certifique-se de que o cabo esteja na parte frontal da placa do sensor, conforme mostrado, para dispor as gaiolas em ordem numérica da esquerda para a direita no vivário, sem sobreposição dos cabos e sem comprometer potencialmente o registro (ver etapa 3.6 e Figura 6).
   3. Cubra mais cinco cabos com tubos termorretráteis de cores distintas e solde-os aos pinos de #2 a #11 conforme mostrado (Figura 2C-3). Certifique-se de que todos os fios vermelhos estejam soldados aos pinos de número par, que serão conectados a todas as garrafas do lado esquerdo, e de que todos os fios pretos estejam soldados aos pinos de número ímpar, que serão conectados a todas as garrafas do lado direito.
   4. Cubra as juntas de solda com cola quente em todos os lados para proteção (Figura 2C-4). Rotule os conectores em ordem numérica, fornecendo um ID exclusivo para cada lickômetro (Figura 2C-4).
   5. Para montar a unidade sensora A, conecte a placa sensora A a um EndPoint de comunicação com um cabo de 4 pinos de 50 mm e conecte o EndPoint à saída de 3,3 V do conversor de níveis de 5 V para 3 V com um cabo de 4 pinos de 100 mm (Figura 2D-1). Embora a placa sensora e a placa de expansão de comunicação possuam dois conectores idênticos de 4 pinos, é ainda importante certificar-se de que a fiação esteja exatamente como mostrado (Figura 2D-1 e Figura 2F) para utilizar as carcaças de sensores impressas em 3D e a configuração sugerida do vivário (ver passo 3.6 e Figura 6). Coloque a unidade sensora A dentro do invólucro impresso em 3D (Figura 2D-2). Feche suavemente a tampa, tomando cuidado para não esmagar o cabo do conversor de nível (Figura 2D-3).
   6. Modificar o I²C endereços das placas de sensor B e C soldando um fio jumper do pino ADDR ao pino 3Vo ou SDA conforme indicado (Figura 2E).
   7. Solde seis cabos conectores fêmea codificados por cores nas placas de sensor B e C, utilizando a mesma ordem usada para a placa A. Identifique cada conector com o número de identificação (ID) correspondente do lickômetro. Conecte a placa B ao ponto de interrupção de comunicação MidPoint e a placa C a um EndPoint, utilizando cabos de 4 pinos de 50 mm (Figura 2F).
   8. Coloque as unidades sensoras B e C em suas respectivas caixas impressas em 3D. Conecte em série as três unidades sensoras com cabos Ethernet para concluir a configuração dos sensores (Figura 2G).
2. Configuração da interface do microcontrolador
   OBSERVAÇÃO: A interface do microcontrolador LIQ HDR (Figura Suplementar 1A) é o mesmo descrito para LIQ HD³⁰ com modificações muito pequenas. Os procedimentos descritos abaixo fornecem uma visão geral dos passos necessários para configurar a interface, com as modificações descritas nas etapas 3.2.6 e 3.2.8. Os pesquisadores devem consultar o protocolo original e o tutorial em vídeo disponibilizado na página do autor no GitHub para obter instruções passo a passo mais detalhadas³⁰.
   1. Reúna os materiais e as ferramentas de soldagem necessários para montar a interface do microcontrolador (Figura Suplementar 1B). No lado traseiro do escudo tátil (Figura Suplementar 1C-1), crie uma ponte de solda nos terminais de solda traseiros do painel luminoso (Figura Suplementar 1C-2).
   2. No lado traseiro do escudo de registro de dados, corte o traço da pad de jumper do pino CS (Figura Suplementar 1D-1). No lado frontal do registrador de dados, soldar um fio jumper curto do pino CS ao pino nº 7 (Figura Suplementar 1D-2).
   3. Para instalar os conectores de empilhamento do shield, primeiro empilhe-os na parte traseira do shield da tela sensível ao toque (Figura Suplementar 1E-1). Empilhe o registrador de dados na tela sensível ao toque, use fita para estabilizar e solde todos os pinos de conexão no registrador de dados (Figura Suplementar 1E-2). Em seguida, remova a tela sensível ao toque.
   4. Empilhe o cabeçalho 2 x 3 restante no microcontrolador (Figura Suplementar 1F-1), depois empilhe o registrador de dados sobre o microcontrolador antes de soldar os pinos de cabeçalho no lugar (Figura Suplementar 1F-2).
   5. Insira a bateria de moeda no registrador de dados (Figura Suplementar 1G-1). Empilhe a tela sensível ao toque sobre o registrador de dados (Figura Suplementar 1G-1). Insira o cartão microSD juntamente com seu adaptador no datalogger (Figura Suplementar 1G-2).
   6. Para fazer o fio de aterramento extra, corte um conector macho de um fio jumper e descasque a extremidade até cerca de 1/4 de polegada (Figura Suplementar 1H-1). Solde um fio de núcleo sólido descascado ao fio jumper e cubra a junção soldada com uma bainha termorretrátil (Figura Suplementar 1H-2).
   7. Conecte os fios jumper de 4 pinos e o fio de aterramento extra ao microcontrolador (Preto - GND, Vermelho - 5V, Amarelo - pino #21, Azul - pino #20) Figura Suplementar 1I-1). Fixe as conexões com cola quente (Figura Suplementar 1I-2). Opcionalmente, envolva os fios jumper com tubo termorretrátil (Figura Suplementar 1I-2).
   8. Acomode a interface do microcontrolador totalmente montada na caixa impressa em 3D, com os fios jumper de 4 pinos e o fio de aterramento passados pela abertura na parte superior (Figura Suplementar 1J).
   9. Siga o protocolo original para a instalação do software de interface do microcontrolador³⁰.
3. Construção de lickômetros LIQ HDR
   OBSERVAÇÃO: A impressão 3D personalizada que sustenta os frascos foi projetada para uso com um frasco padrão para roedores com diâmetro do tubo bebedor de 8 mm (consulte Tabela de Materiais Figura 3A). Este suporte para frascos pode ser facilmente adaptado para uso com frascos e tubos de bebedouro semelhantes, com pequenas modificações ou nenhuma modificação.
   1. Reúna os materiais, impressões 3D e ferramentas de soldagem necessários para a construção de um lickômetro conforme mostrado em Figura 3B. Observe que cada sistema LIQ HDR comporta no máximo 18 lickômetros para 36 garrafas.
   2. Para prolongar o cabo do conector macho, descasque ambas as extremidades por cerca de 1/4 de polegada de comprimento, bem como os fios preto e vermelho da extensãoFigura 3C-1).
   3. Solde os fios de extensão ao cabo do conector (Figura 3C-2) e cubra as soldas com tubo termorretrátil (Figura 3C-3). Cubra o cabo do conector macho com uma mangueira retrátil térmica cuja cor corresponda à do conector fêmea correspondente na unidade do sensor (Figura 3C-4).
   4. Para ser consistente com a fiação da placa do sensor (Figura 2), passe o fio vermelho e o fio preto, respectivamente, pelas passagens internas esquerda e direita do suporte da garrafaFigura 3D-1).
   5. Soldar cada fio na extremidade do 1 ¾ fita de cobre condutora de 1 polegada (Figura 3D-2) e dobre as fitas de cobre ao meio (Figura 3D-3).
   6. Descole a fita de cobre e use um par de pinças para manobrá-la cuidadosamente para dentro do suporte do bebedouro (Figura 3E-1) antes de fixá-lo firmemente às paredes internas do suporte do bebedouro (Figura 3E-2). Certifique-se de que o lado com solda da fita de cobre esteja aderido à parede mais próxima da linha média do suporte para frascos, conforme indicado (Figura 3E-2). Insira um tubo bebedouro através do suporte para pressionar firmemente a fita contra a parede e preparar o suporte.
   7. Para reforçar o lado da solda da fita de cobre, que é menos adesivo e tende a se soltar, aplique uma gota de cola quente na junção soldadaFigura 3E-3). Espalhe a cola para cobrir tanto a fita de cobre quanto qualquer parte exposta adjacente da impressão 3D (Figura 3E-4).
   8. Passe o cabo através da passagem interna do protetor de caboFigura 3F). Certifique-se de selecionar o protetor de cabo apropriado (voltado para a esquerda ou para a direita) para cada lickômetro, a fim de utilizar a configuração sugerida do biotério (consulte o passo 3.6 e Figura 6)."OBSERVAÇÃO: Os lickômetros 5-6, 11-12 e 17-18, que são representados por cabos de cor azul ou roxa na configuração atual, requerem um protetor de cabo voltado para a esquerdaFigura 4D-1), enquanto todos os outros lickômetros exigem um protetor de cabo voltado para a direita (Figura 4D-2).
   9. Para instalar o clipe de cabo, encaixe primeiro um fio no sulco de uma metade do clipe de cabo (Figura 3G-1), depois encaixe a outra metade sobre o segundo fio e, em seguida, feche firmemente ambas as metades com a porca (Figura 3G-2).
   10. Rotule o conector macho com o número de identificação (ID) do lickômetro correspondente (Figura 3H). Repita esses passos até que todos os 18 lickômetros sejam construídos.
4. Instalação dos lickômetros LIQ HDR
   OBSERVAÇÃO: O LIQ HDR foi projetado para instalação em uma gaiola padrão para ratos do tipo caixa de sapatos com tampa de arame metálico (Figura 4A-1).
   1. Identifique dois pares de hastes com uma distância centro a centro de aproximadamente 75 mm na parte superior da gaiola de arame para acomodar o suporte de garrafa. Utilize um alicate para abrir ligeiramente as hastes metálicas ao redor das aberturas dos bebedouros. Isole essas hastes com fita isolante para evitar o contato metal com metal entre os bebedouros e a parte superior da gaiolaFigura 4A-2).
      OBSERVAÇÃO: Embora a fita isolante não esteja acessível às ratas e, portanto, não seja suscetível a mordeduras, recomendamos descartá-la ao final do estudo e não reutilizá-la entre diferentes estudos.
   2. Instale o lickômetro e o painel de acrílico a laser de 1/8 de polegada de espessura na parte superior da gaiola com dois conjuntos de parafusos e porcas M5 (Figura 4B). Certifique-se de que as aberturas dos bebedouros no lickômetro e no painel de acrílico estejam alinhadas e de que os bebedouros não estejam em contato com qualquer parte da tampa da gaiola.
   3. Fixe o clipe de cabo à haste mais externa (~4 mm de diâmetro) do topo da gaiola de arameFigura 4C). Ajuste o clipe do cabo, se necessário, para garantir que a tampa da gaiola assente firmemente na base da gaiola e que o cabo não esteja sendo puxado ou dobrado com tensão excessiva. Certifique-se de que o protetor de cabo adequado está sendo utilizado para cada lickômetro (Figura 4D e veja o passo 3.8.8).
   4. Ajuste os tubos dos bebedouros conforme necessário para que apenas cerca de 2 cm do bebedouro se projete a partir da tampa (Figura 4E-1). Para instalar as garrafas, insira o tubo do bebedouro através do suporte do bebedouro do porta-garrafa até que pareFigura 4E-2). Apenas a ponta do tubo do bebedouro deve se estender além do painel de acrílico (Figura 4E-3). É crucial que nenhuma outra parte do tubo de sucção fique exposta, a fim de evitar lambidas falsas positivas decorrentes de comportamentos não consumatórios, como o rato tocar ou brincar com o tubo de sucção. Um filtro superior deve poder assentar-se firmemente sobre a tampa de arame da gaiola e o prendedor de cabo sem perturbar o próprio cabo (Figura 4F).
      OBSERVAÇÃO: Um painel acrílico mais espesso ou uma pilha de vários painéis de 1/8 de polegada pode ser usado para envolver completamente tubos bebedores de comprimentos maiores em experimentos que exigem que os tubos bebedores se estendam mais para dentro da gaiola, como ao medir a ingestão de líquidos em ratos jovens que podem ter dificuldade em alcançar um tubo bebedor curto.
5. Instalação e uso de bloqueadores de sifão
   ​OBSERVAÇÃO: O bloqueador de aspiração (Figura 5Afoi projetado para restringir o acesso da rata à mamadeira durante a troca das garrafas e garantir a calibração precisa do lickometer no início de cada sessão de ingestão.
   1. Reúna as peças impressas em 3D e um parafuso, porca e arruela M5 para um bloqueador de bebedouro, conforme mostrado em Figura 5B.
   2. Insira o SIPPER_Gear na SIPPER_Base (Figura 5C-1). Certifique-se de que o SIPPER_Gear está orientado exatamente conforme mostrado no detalhe da renderização 3D. Insira o SIPPER_Worm na abertura na parte superior do SIPPER_Base. Gire o worm no sentido horário durante a inserção até que sua cabeça fique alinhada com a base (Figura 5C-2).
   3. Parafuse a Porca_SIPPER na extremidade do Parafuso sem Fim a partir da parte inferior da Base (Figura 5C-3). Use uma pinça para apertar a porca enquanto gira o mostrador helicoidal. Insira os pescoços estreitos e redondos dos SIPPER_Blockers nas ranhuras da Engrenagem (Figura 5C-4).
   4. Instale o bloqueador de bebedouro montado na parte superior da gaiola utilizando o conjunto de parafusos M5 (Figura 5D). Certifique-se de que ambos os bloqueadores de bebedouro estejam alinhados com as aberturas do bebedouro.
   5. Para bloquear o acesso aos bebedouros, gire o dial do parafuso sem-fim no sentido horário para abaixar os bloqueadores até que cubram completamente as aberturas dos bebedouros (Figura 5E).
   6. Para permitir o acesso aos bebedouros, gire o disco no sentido anti-horário até que os bloqueadores estejam em posição vertical, perpendicular à tampa da gaiola (Figura 5F-1). Puxe manualmente cada braço do bloqueador até que as cabeças fiquem logo abaixo da parte superior da gaiola de arame. Gire os bloqueadores 90° para que as cabeças fiquem paralelas às hastes metálicas na parte superior da gaiola e os braços permaneçam fixos no lugar (Figura 5F-2). Continue girando o botão no sentido anti-horário até que ambos os travões estejam elevados acima da parte superior da gaiola (Figura 5F-3) e os bebedouros estão totalmente acessíveis (Figura 5F-4).
6. Utilizando o sistema LIQ HDR no vivário
   OBSERVAÇÃO: A configuração de biotério a seguir é otimizada para registrar o consumo em escolha de duas garrafas utilizando uma única interface de microcontrolador conectada a 18 gaiolas padrão tipo caixa de sapato para ratos. Todos os componentes eletrônicos, incluindo a interface de microcontrolador, unidades de sensores e diversos cabos, são fixados em prateleiras de arame metálico montadas na parede, que sustentam as gaiolas (Figura 6A). Algumas modificações podem ser necessárias para adaptação às instalações animais e às necessidades do usuário.
   1. Monte cada unidade sensora nas prateleiras do vivário utilizando o parafuso de fixação personalizado impresso em 3D (Figura 6B). Certifique-se de que cada unidade sensora esteja montada diretamente sob a gaiola, com o lickômetro de cor amarela, a fim de evitar tensão desnecessária nos cabos (Figura 6A).
   2. Organize e fixe cada cabo conector feminino, certificando-se de que eles não se sobreponham entre si nem se dobrem excessivamente nas extremidades soldadas, o que poderia resultar em detecção inadequada dos lambedoresFigura 6B). Se for utilizada prateleira com estrutura de hastes metálicas, isso pode ser facilmente realizado prendendo os cabos conectores a hastes separadas da prateleira, conforme ilustrado.
   3. Monte a interface do microcontrolador ao lado da unidade do sensor A utilizando o mesmo parafuso de fixação impresso em 3D e conecte seu conector de 4 pinos à porta de entrada de 5 V do conversor de nível de 5V para 3V conectado à unidade do sensor A (Figura 6C).
   4. Use fita isolante para fixar o fio terra adicional a uma fonte de aterramento, como uma prateleira metálica (Figura 6D).
   5. Organize cada gaiola com base na cor e no ID do lickômetro instalado conforme Figura 6A representação para minimizar a sobreposição e a tensão dos cabos.
   6. Conecte com segurança todos os cabos conectores macho dos lickômetros aos cabos conectores fêmea correspondentes dos sensores (Figura 6E). Ligue a fonte de alimentação para ligar a interface do microcontrolador (Figura 6F).
   7. Na página principal da GUI (interface gráfica do usuário)Figura 6G), toque o Definir Símbolo para abrir a página Configurações. Os usuários podem alterar os horários de ligar e desligar as luzes com base na programação do vivário para garantir que a tela da interface atenue automaticamente quando o ciclo escuro começar (Figura 6H-1).
   8. Toque Editar Configurações do Sensor (Figura 6H-1) para ajustar o Limiar de Toque a 8 e o Limiar de Liberação a 2, o que temos verificado permitir a detecção de lambidas mais consistente para ratos utilizando a configuração atual (Figura 6H-2). Observe, no entanto, que os usuários podem precisar experimentar diferentes configurações caso sejam introduzidas modificações no sistema atual.
   9. Desmarcar Auto Calibrar se os dados forem coletados apenas em um período de 24 h ou menosFigura 6H-2).

4. Procedimentos diários para o consumo em gaiola doméstica com escolha de duas garrafas utilizando detecção de lambidas

1. Siga as etapas descritas na etapa 2 para procedimentos padrão de escolha em duas garrafas com as seguintes modificações.
2. Nas segundas, quartas e sextas-feiras, antes de colocar as garrafas MWF, use os bloqueadores de bebedouro para cobrir as aberturas dos bicos em todas as gaias (veja a etapa 3.5.5 e Figura 5E).
3. Antes de iniciar o registro, selecione o Lado Experimental correto na página principal da interface gráfica, que será o lado da garrafa de EtOH naquele dia (Figura 6G).
4. Após instalar todas as garrafas MWF, toque em INICIAR! na página principal (Figura 6G) para iniciar a calibração dos sensores, durante a qual recomenda-se que o usuário se afaste um pouco do sistema e verifique se os ratos não estão lambendo os bicos (Figura 6I-1). A calibração leva alguns segundos para concluir, após o que o sistema entra na página principal de registro, mostrando os números acumulados de lambidas em cada garrafa para cada lickômetro (Figura 6I-2).
5. Levante todos os bloqueadores de bebedouro acima do topo da gaiola para permitir o acesso aos bicos (veja a etapa 3.5.6 e Figura 5F) e recoloque suavemente todas as tampas filtrantes conforme descrito (veja a etapa 3.4.4 e Figura 4F).
6. Toque em Atualizar para atualizar os números de lambidas na tela, pois eles não são atualizados em tempo real automaticamente (Figura 6I-2).
7. Nas terças, quintas e sábados, toque em Salvar & Sair para interromper o registro e retornar à página principal (Figura 6I-2) antes de remover as garrafas MWF.
8. Para remover o cartão SD para transferência de dados, toque em Ejetar SD antes de desconectar o cartão SD (Figura 6G). Insira o cartão SD em qualquer computador e copie/cole o arquivo de dados .csv nomeado com base na data de ligação da garrafa para esse computador (Figura 6K). Para remontar o cartão SD para o próximo registro, insira o cartão na interface e toque em Montar SD (Figura 6J).
   NOTA: Recomendamos fazer backup dos arquivos de dados diariamente.
9. Recomenda-se limitar as medições de peso corporal a uma vez por semana, sempre que compatível com o modelo animal e com o protocolo de uso animal, realizando essa tarefa no dia designado para a troca de gaias, a fim de minimizar perturbações desnecessárias aos lickômetros e sensores. Desconecte todos os cabos masculinos dos lickômetros dos cabos femininos correspondentes dos sensores antes de mover as gaias. Após pesar cada rato, devolva-o a uma gaiola limpa. Transfira o lickômetro para um novo topo de gaias e reconecte cada lickômetro ao sensor correspondente quando necessário.
10. Para experimentos que testam o efeito de uma intervenção (por exemplo, injeção de fármaco) na ingestão de EtOH e na microestrutura da bebida, programe essas intervenções antes do início da sessão de bebida sempre que possível. Em ocasiões em que isso não for possível, os pesquisadores podem interromper a detecção de lambidas tocando em Pausar (Figura 6I-2) e retomar a captura de dados tocando em Retomar após a conclusão da intervenção. Sugerimos coletar os pesos das garrafas durante cada pausa na sessão de bebida para registrar alterações na ingestão de EtOH antes e depois da intervenção, bem como para contabilizar derramamentos que possam ocorrer ao remover a tampa da gaiola para acessar o animal.
11. No final do estudo, todos os componentes dentro das gaias devem ser desinfetados completamente antes de serem usados com novos animais, a fim de limitar a transmissão de contaminantes entre eles. Recomendamos pulverizar e limpar suavemente o lickômetro com solução de EtOH 70%, tomando cuidado para não perturbar os componentes elétricos internos. O bloqueador de bebedouro e o painel acrílico podem ser lavados com água morna e sabão.

5. Análise de dados

1. Antes de avaliar as medidas dependentes, corrija os dados de ingestão para levar em conta o derramamento que ocorre inevitavelmente ao trocar as garrafas diariamente. Para isso, calcule a média da variação do peso das garrafas de EtOH e de H₂O na gaiola de derramamento ao longo de todo o período do estudo.
2. Exclua quaisquer valores superiores a dois desvios-padrão da média para cada garrafa. Após excluir esses valores atípicos, subtraia as médias calculadas das variações de peso das garrafas de EtOH e de H₂O obtidas nas gaiolas que contêm animais. Ao subtrair essa quantidade, os pesquisadores podem ter certeza de que a perda média resultante do derramamento de uma determinada solução não será considerada nas medidas de consumo. A subtração da quantidade média de derramamento pode resultar em um valor negativo para alguns animais em certas ocasiões. Converta esses valores para zero e interprete-os como ausência de ingestão para aquela solução.
3. As principais medidas dependentes em experimentos de consumo com escolha de duas garrafas são a ingestão de EtOH (g/kg) e a preferência (%). Calcule a ingestão a partir da variação do peso da garrafa de EtOH (g) e normalize em relação ao peso corporal (kg) utilizando os seguintes passos.
   1. Converta a variação do peso da garrafa (g) na variação do volume (mL) utilizando a seguinte equação:
      
      A densidade do etanol puro é 0,789 g/mL. Portanto, a densidade contributiva de EtOH a 20% é 0,1578 g/mL. A H₂O pesa 1 g/mL. Assim, a densidade contributiva de 80% de H₂O = 0,80 g/mL. Consequentemente, cada mL de uma solução de EtOH a 20% (v/v) é composto por 0,1578 (EtOH) + 0,80 (H₂O) = 0,9578 g/mL. Portanto, a equação final ao utilizar concentração de EtOH a 20% (v/v) é:
      
   2. Calcule a dose de etanol consumida utilizando a equação abaixo. Utilize os pesos corporais obtidos na mesma semana dos dados de ingestão para calcular o etanol consumido em termos do peso corporal do animal.
      
   3. Calcule a preferência utilizando a seguinte equação:
      
4. Assim como seu equivalente em camundongos³⁰, o LIQ HDR capta uma variedade de variáveis de microestrutura de beber, incluindo duração da lambida, número de episódios, duração do episódio, número de lambidas por episódio e duração das lambidas por episódio (Figura 6K). Um episódio de beber é definido como uma série de lambidas que começa com pelo menos 3 lambidas realizadas em menos de 1 segundo e termina após 3 segundos sem lambidas adicionais. Essas medidas podem então ser usadas para calcular a duração média individual da lambida, a duração média individual do episódio, o número médio de lambidas por episódio, a frequência média de lambidas, o intervalo interlambida estimado e o intervalo interepisódio estimado.
   NOTA: A interface do microcontrolador fornece esses dados de microestrutura com resolução de 1 min em um arquivo .csv (Figura 6K). Os pesquisadores podem usar o aplicativo de análise fornecido com o protocolo original do LIQ HD³⁰ ou sua plataforma de pós-processamento preferida para reunir e resumir os dados conforme as necessidades da pesquisa. Os dados de microestrutura são tipicamente somados ao longo de todo o período de 24 h para comparar diferenças médias em nível macroscópico, ou em intervalos de 30 min a 1 h para examinar variações nos padrões de consumo durante um ciclo claro-escuro.

Resultados

Dados padrão de consumo de EtOH em gaiola domiciliar com escolha intermitente de duas garrafas
Utilizando o procedimento padrão (Figura 7A), os pesquisadores podem registrar a ingestão em 24 h (Figuras 7B-D) bem como o consumo semelhante a episódios de bebedeira, caso os pesos das garrafas sejam coletados logo após o início da sessão de consumo (Figuras 7E-F). Ao calcular a ingestão de etanol em relação à ingestão de água, os pesquisadores também podem obter dados de preferência em todos os pontos temporais medidos (Figuras 7D,F). Conforme mostrado na Figura 7C, ratos frequentemente exibem um período de aumento na ingestão de etanol ao longo dos primeiros dias de acesso com escolha de duas garrafas. Isso é seguido por uma fase de platô, na qual a ingestão permanece relativamente estável. Embora esse padrão seja consistentemente observado em ratos machos^{7,32,33,34,35,36}, ele nem sempre é observado em fêmeas. Em vez disso, alguns estudos relatam níveis estáveis de ingestão de etanol durante todo o período do estudo em ratas^37,38. Além disso, alguns estudos sugerem que a ingestão de etanol pode aumentar ainda mais com períodos mais prolongados de acesso^36,39. A ingestão diária pode variar significativamente entre indivíduos. No entanto, a ingestão diária média já foi bem caracterizada para as linhagens mais comumente utilizadas na pesquisa com álcool e pode ser usada como referência para avaliar o sucesso ao analisar dados agrupados^{7,8,33,34,35,39}.

Como mostrado na Figura 7E, muitas ratas consomem uma parte significativa de sua ingestão diária de etanol logo após o início da sessão de consumo^8,33. Esse padrão de ingestão semelhante a uma compulsão é frequentemente associado a uma preferência significativa por etanol em relação à água (Figura 7F). No entanto, os pesquisadores não devem se surpreender se a preferência em 24 h não ultrapassar 50%. Isso é particularmente verdadeiro para linhagens de roedores outbred ou não preferidores de álcool e para estudos limitados a períodos relativamente curtos de acesso à escolha de duas garrafas^{7,32,33,35,37}.

Validação do LIQ HDR para análise da microestrutura da ingestão no teste de escolha de duas garrafas
A inclusão do sistema LIQ HDR ao paradigma padrão de escolha de duas garrafas em ratos permite aos pesquisadores prever com precisão e exatidão a ingestão a partir dos dados de bebera registrados. Isso é confirmado pela presença de uma correlação forte e significativa entre o número cumulativo de lambidas detectadas e a alteração nos pesos das garrafas, tanto para a garrafa de EtOH (R² = 0.7789, F_(1,113) = 398.1, p < 0.0001) quanto para a garrafa de H₂O (R² = 0.7910, F_(1,117) = 442.9, p < 0.0001), ao longo de um período de 24 h (Figura 8A). O mesmo ocorre em dias nos quais os ratos receberam duas garrafas contendo H₂O (R² = 0.8875, F_(1,188) = 1484, p < 0.0001; Figura 8B).

O LIQ HDR também permite uma análise precisa dos padrões de ingestão com alta resolução temporal, o que não é possível com o paradigma padrão de escolha entre duas garrafas. Usando essa abordagem, os pesquisadores têm a oportunidade de examinar diferenças nos padrões de ingestão entre diferentes soluções, ao longo do ciclo claro-escuro, entre os sexos, grupos farmacológicos e muito mais. Por exemplo, agrupar as lambidas médias em intervalos de 30 minutos permite uma análise fácil dos padrões médios de ingestão ao longo de 24 h. Como esperado, essa análise revela ingestões significativamente maiores tanto de EtOH quanto de H₂O durante o ciclo escuro, quando os ratos estão acordados, em comparação com o ciclo claro, quando os ratos normalmente estão dormindo (Figura 8C). Usando uma abordagem semelhante, os pesquisadores podem explorar diferenças entre grupos nos padrões de ingestão. Por exemplo, a microestrutura da ingestão pode ser comparada entre ratos machos e fêmeas ao examinar o número médio de lambidas de EtOH (Figura 8D) ou água (Figura 8E) ao longo de um período de 24 h. Para investigar a ingestão precoce e/ou padrões semelhantes a bebedeiras, os pesquisadores podem aumentar a resolução da análise, focando na ingestão logo após o início da sessão, utilizando janelas menores de agrupamento para resumir os dados. Isso permite investigar períodos de ingestão semelhante a bebedeiras sem exigir a coleta de múltiplos pesos de garrafa dentro de um período de 24 h. Como mostrado na Figura 8C (inseto), essa análise revela que a maior parte da ingestão capturada por um peso de garrafa obtido 30 minutos após o início da sessão ocorre nos primeiros 5 minutos, e não ao longo dos 30 minutos. Dados como esses podem auxiliar na identificação dos pontos temporais ideais para coleta de amostras sanguíneas destinadas à medição da concentração sanguínea de etanol (BEC). De fato, um padrão semelhante de ingestão precoce foi observado em um dia distinto de ingestão, no qual os padrões de ingestão de alta resolução foram registrados em um período tão curto quanto 15 minutos (Figura 8F). O número médio de lambidas registrado durante essa sessão previu com confiabilidade a variação no peso da garrafa (EtOH: R² = 0.6316, F_(1,10) = 17.15, p = 0.0020; H₂O: R² = 0.8601, F_(1,10) = 61.47, p < 0.0001; Figura 8G). Além disso, as BECs obtidas a partir de amostras sanguíneas coletadas 15 minutos após o início da sessão correlacionaram-se bem com o número de lambidas detectadas (R² = 0.4327, F_(1,10) = 7.627, p = 0.0201; Figura 8H), mesmo com níveis relativamente baixos de ingestão de EtOH.

O LIQ HDR capta diversas medidas da microestrutura da ingestão de líquidos, que são detectadas e calculadas em tempo real durante as sessões de ingestão e armazenadas em intervalos de 1 minuto, de forma semelhante à detecção de lambidas (Figura 6K). Essas medidas são brevemente descritas no passo 5.4 e foram previamente definidas³⁰. Os pesquisadores podem realizar análises detalhadas das alterações na microestrutura individual da ingestão e examinar como e em que grau os padrões de ingestão contribuem para as diferenças na ingestão total. Para ilustrar, observamos que, embora ratos machos e fêmeas exibissem um número semelhante de lambidas, episódios de ingestão e duração dos episódios (Figura 9A-C) ao ingerirem água, isso esteve associado a uma ingestão total maior (g/kg) nas fêmeas em comparação aos machos (teste t; t=2,882, gl=10, p=0,0163; Figura 9D). Isso era esperado devido ao dimorfismo sexual no peso corporal, o qual facilita níveis mais elevados de ingestão por peso corporal nas fêmeas em comparação aos machos para um número equivalente de lambidas. Destaca-se que isso contrasta com a comparação das diferenças sexuais nos padrões de microestrutura para EtOH, que revelou microestrutura de ingestão semelhante associada a níveis semelhantes de ingestão de EtOH (Figuras 9E-H). Esses dados sugerem que, embora o volume por lambida para água seja semelhante entre os sexos, em comparação aos machos, ratos fêmeas apresentam menor volume por lambida para EtOH. Em conjunto, esses dados microestruturais apoiam a ideia de que ratos machos e fêmeas provavelmente diferem nas estratégias de ingestão voluntária, dependendo do tipo de fluido consumido no ambiente da gaiola. Estudos anteriores também relataram diferenças sexuais nas estratégias de ingestão dependentes do tipo de fluido^40,41, embora as diferenças observadas nesses estudos não tenham se limitado apenas à ingestão de água. A duração da história de ingestão pode desempenhar um papel nas diferenças observadas entre os estudos, já que a escolha de duas garrafas foi limitada a 5 semanas no conjunto de dados atual, enquanto excedeu 12 semanas em trabalhos anteriores^40,41.

Figura 1: Consumo em gaiola própria com escolha entre duas garrafas. (A) Os pesquisadores podem medir a ingestão voluntária de etanol na gaiola própria e a preferência (em relação à água) utilizando uma abordagem padrão que calcula a ingestão com base na variação do peso das garrafas. (B) Ao utilizar o LIQ HDR, um sistema caseiro de detecção de lambidas de baixo custo projetado para ratos, os pesquisadores podem obter as mesmas medidas do procedimento padrão de escolha entre duas garrafas, além de capturar a microestrutura detalhada do consumo durante todo o período de gravação. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 2: Construção de unidades de sensores capacitivos. (A) Componentes eletrônicos e diagrama de fiação. (B) Materiais para a construção de três unidades de sensores capacitivos necessários para montar um sistema LIQ HDR. (C) Solde cabos conectores fêmea de 2 pinos para as gaiolas nº 1-6 na placa A, pinos nº 0-11, e fixe as soldas com cola quente. Codifique os cabos por cores usando tubos termorretráteis coloridos e identifique cada um com um número de identificação único do lickômetro. (D) Conecte a placa A e o conversor de nível de 5V para 3V a um ponto final (EndPoint) de comunicação diferencial I²C com cabos de 4 pinos (1) e aloje a placa A e o módulo de comunicação na caixa impressa em 3D (2-3). (E) Altere os endereços I²C das placas B e C soldando um fio de jumper do pino ADDR para os pinos 3Vo e SDA, respectivamente. (F) Solde cabos conectores fêmea de 2 pinos nas placas de sensor B e C, identifique-as com os números de identificação correspondentes do lickômetro e conecte a placa B a um ponto intermediário (MidPoint) de comunicação e a placa C a um ponto final (EndPoint) com cabos de 4 pinos. (G) Aloje as unidades de sensor B e C em suas respectivas caixas impressas em 3D e conecte em série as três unidades com cabos Ethernet. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 3: Monte o lickômetro LIQ HDR. (A) Representação 3D dos componentes dentro da gaiola. (B) Materiais para montar um lickômetro de duas garrafas. Observação: um sistema LIQ HDR acomoda 18 lickômetros de duas garrafas. (C) Estenda o comprimento do cabo do conector macho de 2 pinos com um par de fios preto e vermelho e codifique as cores com tubos termorretráteis. (D) Passe os fios preto e vermelho pelas aberturas esquerda (E) e direita (D) do suporte de garrafas (1) e solde as pontas às fitas de cobre (2-3). (E) Adira as fitas de cobre às paredes internas dos suportes dos bicos (1-2) e reforce-as com cola quente (3-4). (F) Passe o cabo pelo protetor de cabo. (G) Instale o prendedor de cabo. (H) Identifique o conector com o número de identificação correspondente ao lickômetro. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 4: Instalação do lickômetro. (A) Use fita isolante para isolar as hastes metálicas ao redor das aberturas do bebedouro na tampa metálica da gaiola. (B) Instale o lickômetro e a placa de acrílico na parte superior da gaiola com dois conjuntos de parafusos e porcas M5. (C) Fixe o clipe de cabo à haste mais externa do topo da gaiola de arame. (D) Certifique-se de usar o protetor de cabo apropriado (esquerdo L ou direito R) para cada gaiola. (E) Certifique-se de que apenas cerca de 2 cm do bico dos garrafões fique exposto (1), de modo que, quando os garrafões forem colocados na gaiola (2), apenas as pontas dos bicos ultrapassem o painel de acrílico e fiquem acessíveis aos ratos. (F) O topo do filtro deve encaixar-se sobre o clipe do cabo sem perturbar o próprio cabo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 5: Instalação e uso do bloqueador de bebedouro. (A) Representação tridimensional do bloqueador de bebedouro. (B) Peças personalizadas impressas em 3D para um bloqueador de bebedouro. (C) Monte as peças impressas em 3D. (D) Instale o bloqueador de bebedouro montado na tampa da gaiola com um parafuso M5 + porca + arruela. (E) Gire o botão no sentido horário para bloquear o acesso aos bebedouros. (F) Gire o botão no sentido anti-horário para remover os bloqueadores dos bebedouros (1), levante os bloqueadores e gire 90° (2), e continue girando o botão no sentido anti-horário até que os bloqueadores estejam acima da tampa da gaiola (3-4). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 6: Configuração do vivário e operação da interface gráfica do usuário (GUI). (A) Configuração recomendada do biotério e diagrama de fiação. (B) Monte cada unidade sensora nas prateleiras e organize e estabilize os cabos dos sensores nas prateleiras. (C) Monte a interface do microcontrolador na prateleira e conecte seu jumper de 4 pinos ao conversor de nível de 5V para 3V conectado à unidade de sensor A. (D) Fixe o fio terra extra com fita isolante. (E) Conecte os cabos do sensor aos cabos correspondentes do lickômetro. (F) Conecte a fonte de alimentação para ligar a interface do microcontrolador. (G) Página principal da interface GUI. (H) Toque Configurações ajustar o horário de ligar/desligar as luzes de acordo com o cronograma de luz do vivário (1) e tocar Configurações do Sensor para ajustar os limiares de toque e liberação para ratos (2). (I) Para gravar os dados, selecione o lado da garrafa de EtOH na página principal, toque INICIAR! para calibrar os sensores (1) e iniciar a gravação (2). Toque Atualizar para atualizar o número de lambidas exibido na tela, e toque Salvar & Sair para interromper a gravação. (J) Toque Ejetar SD na página principal para remover o cartão SD e transferir os dados. Toque Montar SD após inserir o cartão SD. (K) Captura de tela de um arquivo de dados brutos representativo ilustrando como os dados de microestrutura são salvos em intervalos de 1 minuto pela interface do microcontrolador. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 7: Dados representativos de consumo em escolha de duas garrafas obtidos utilizando o procedimento padrão. No paradigma de consumo de EtOH em gaiolas domiciliares com acesso intermitente e escolha de duas garrafas, (A) ratos recebem solução de EtOH a 20% (v/v) (laranja) e H₂O (azul) às segundas, quartas e sextas-feiras (MWF), e duas garrafas contendo H₂O às terças, quintas-feiras e fins de semana. (B) As medidas de ingestão diária de líquido revelam que, embora os ratos mantenham um nível relativamente constante de ingestão total de líquido (mL) ao longo do período do estudo, (C) frequentemente apresentam aumento na ingestão de EtOH durante as primeiras sessões de consumo, após as quais os níveis de ingestão se estabilizam. (D) Esse padrão de aumento e manutenção é igualmente refletido na preferência pelo EtOH. Os pesquisadores também podem registrar ingestão de EtOH semelhante a episódios de bebedeira (E) se os pesos das garrafas forem coletados após os primeiros 30-60 minutos do início da sessão. (F) Isso geralmente está associado a uma alta preferência pelo EtOH em relação à H₂O. As barras de erro sombreadas representam ± SEM (n = 32 para machos e n = 16 para fêmeas). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 8: O LIQ HDR capta com precisão o consumo com alta resolução temporal. A precisão e exatidão do sistema LIQ HDR são confirmadas, em parte, pela presença de uma correlação positiva significativa entre o número de lambidas e a alteração no peso do frasco em dias em que os ratos recebem (A) H₂O e EtOH, bem como (B) dias em que ambos os frascos contêm H₂O. (C) Diferenças nos padrões de ingestão entre H₂O (azul) e EtOH (laranja) ao longo do período de 24 h de consumo podem ser facilmente avaliadas ao agrupar as lambidas médias em intervalos de 30 min. O gráfico interno corresponde às lambidas médias em intervalos de 5 min durante os primeiros 30 min de acesso aos frascos (destacado em cinza), período no qual os ratos frequentemente exibem comportamento significativo de consumo inicial intenso. Diferenças entre grupos nos padrões de ingestão também podem ser examinadas usando uma abordagem semelhante, exemplificada pela microestrutura das lambidas para (D) EtOH e (E) H₂O representadas para ratos machos e fêmeas ao longo de um período de 24 h. (F) Os padrões de ingestão também podem ser avaliados com alta resolução temporal em um período de teste mais curto, (G) durante o qual o LIQ HDR continua a rastrear com precisão a ingestão e (H) prever a concentração sanguínea de etanol (BEC), mesmo para níveis relativamente baixos de ingestão de EtOH. Barras de erro sombreadas representam ± SEM (n = 6 para cada sexo). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 9: Dados representativos da microestrutura da ingestão de líquidos. O LIQ HDR permite a obtenção de medidas da microestrutura da ingestão de líquidos, incluindo (A) o número de lambidas, (B) o número de episódios de ingestão e (C) a duração do episódio, além de (D) medir a ingestão total de água por meio da alteração no peso do frasco. (E-H) Medidas semelhantes podem ser obtidas para etanol. Comparações entre grupos dessas medidas podem identificar padrões distintos de ingestão, como no exemplo atual, que revela diferenças entre os sexos nas estratégias de ingestão com base na solução consumida. A linha sólida indica a mediana e as linhas tracejadas indicam os quartis (n = 6 para cada sexo); teste t não pareado; *p < 0,05. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar 1: Configuração da interface do microcontrolador. (A) Peças eletrônicas e diagrama de ligações. (B) Materiais para montar a interface do microcontrolador necessária para um sistema LIQ HDR. (C) No lado traseiro da placa de toque capacitivo, adicione uma ponte de solda entre os pontos de solda da luz de fundo. (D) No lado traseiro da placa de registro de dados, corte a trilha do ponto de jumper do pino CS (1). Solde um fio de jumper do pino CS ao pino nº 7 (2). (E) Solde pinos cabeçalho ao registrador de dados usando a placa de toque como base. (F) Empilhe os 2x4 pinos cabeçalho restantes no microcontrolador (1), empilhe o registrador de dados sobre o microcontrolador e solde os pinos no lugar (2). (G) Insira a bateria de moeda no registrador de dados (1), empilhe a tela sensível ao toque sobre o registrador de dados e insira o cartão SD no registrador de dados (2). (H) Para fazer o fio de terra extra, corte um conector macho do fio de jumper e solde a extremidade a um fio rígido descascado. (I) Conecte os fios de jumper de 4 pinos e o fio de terra extra ao microcontrolador (1) e fixe com cola quente (2). (J) Aloje a interface do microcontrolador na caixa personalizada impressa em 3D. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O protocolo atual fornece instruções passo a passo para capturar dados de consumo de etanol usando um procedimento de gaiola doméstica de acesso intermitente de duas garrafas. Este método pode ser implementado com relativa facilidade e com pouco ou nenhum custo ou necessidade de equipamentos de pesquisa especializados. Usando os procedimentos fornecidos aqui para construir e implementar o LIQ HDR - um sistema de detecção de lambedura para uso em ratos - os pesquisadores podem capturar dados de microestrutura de consumo de alta resolução, além de medidas padrão de ingestão e preferência.

O esquema de acesso intermitente descrito no protocolo atual é um procedimento amplamente utilizado em grande parte porque é bem conhecido por gerar níveis mais altos de ingestão de etanol do que muitos esquemas alternativos de acesso ao etanol. De fato, pesquisas anteriores mostraram que ratos com acesso em um horário intermitente têm maior ingestão média diária de etanol do que ratos com acesso contínuo de 24 horas ^6,7. No entanto, diferentes esquemas de acesso ao etanol podem ser desejáveis, dependendo da questão de pesquisa ou de outros parâmetros de projeto experimental. Os pesquisadores podem modificar facilmente o protocolo atual para acomodar diferentes horários (por exemplo, acesso contínuo, beber no escuro, etc.) simplesmente alterando o horário e os dias de ligar/desligar a garrafa.

Embora o consumo de duas garrafas seja um paradigma relativamente simples de implementar, podem surgir problemas que têm o potencial de comprometer a coleta de dados. É, portanto, crucial que os experimentadores inspecionem os dados diariamente para identificar rapidamente possíveis problemas. Em particular, os pesquisadores devem prestar muita atenção a mudanças muito grandes ou muito pequenas no peso das garrafas que podem ser indicativas de um gole com vazamento ou entupido, respectivamente. Detectar sinais desses problemas precocemente pode impedir a exclusão de todos os dados de um determinado assunto da análise. De fato, se os pesquisadores notarem mudanças drásticas (ou ausência de mudança) no peso da garrafa em um período de 24 horas, uma simples mudança para uma nova garrafa pode ajudar a confirmar se uma determinada garrafa deve ser retirada de circulação. Por esses motivos, é aconselhável ter garrafas e goles extras à mão. No entanto, deve-se notar que alguns ratos exibem naturalmente níveis muito baixos de consumo de etanol, por ^exemplo,35. Isso é particularmente verdadeiro para ratos de certas cepas, consulte⁸ para revisão. Assim, os pesquisadores não devem se alarmar se uma pequena população de animais em um determinado experimento tiver baixo ou nenhum consumo de etanol. Da mesma forma, alguns animais são propensos a brincar com o bebedor/garrafa de maneiras que podem promover derramamento. Embora raros, casos repetidos de altas mudanças no peso da garrafa que não estão associados ao consumo podem exigir que um determinado animal seja removido do experimento.

Nosso protocolo passo a passo detalhado demonstra a facilidade de implementação e uso do sistema LIQ HDR para ratos. Pesquisadores sem conhecimento prévio ou habilidades em eletrônica e programação de microcontroladores podem adaptar prontamente este sistema às suas necessidades experimentais com pouca ou nenhuma modificação. Nossos dados representativos demonstram ainda mais sua aplicação bem-sucedida para estudos de consumo de álcool em gaiolas domésticas de ratos e sua poderosa capacidade de capturar inúmeras medidas de microestrutura de consumo em alta resolução temporal. O LIQ HDR inclui várias modificações de design em relação ao seu antecessor de mouse³⁰. Isso foi feito não apenas como uma necessidade para uma adaptação bem-sucedida para uso em ratos, mas também para melhorar a funcionalidade e a experiência do usuário. Os componentes da gaiola, incluindo o porta-garrafas impresso em 3D, o bloqueador de sipper e os componentes eletrônicos, são realocados para a parte superior da gaiola para proteger contra a mastigação, o que pode resultar em perda frequente e significativa de dados e rotatividade de hardware. A adição de um painel de acrílico cortado a laser ajuda ainda mais a evitar a destruição desses componentes vulneráveis. Além do painel de acrílico, que é o mesmo material de uma gaiola de rato de caixa de sapatos padrão, todos os outros componentes LIQ HDR são inacessíveis ao animal de dentro da gaiola ou acessíveis apenas por um breve momento durante a troca da garrafa. Este projeto limita o potencial de destruição dos componentes do dispositivo e o risco para o animal por meio da ingestão de itens não alimentares. Em contraste com as garrafas personalizadas relativamente trabalhosas usadas no design LIQ HD, o porta-garrafas impresso em 3D da LIQ HDR foi projetado para ser compatível com garrafas comerciais de roedores prontas para uso. As mamadeiras são instaladas no topo da gaiola e acessíveis aos ratos da mesma forma que as mamadeiras são aplicadas durante o tratamento padrão e a criação. A adição de bloqueadores sipper é uma solução simples, mas eficaz, que melhora a confiabilidade do sistema e evita a perda de dados valiosos que, na ausência do bloqueador, pode resultar do consumo que ocorre antes de iniciar a captura de dados na interface do Arduino ou medidas errôneas de lambida que ocorrem quando os ratos interagem com os sipers durante a calibração diária. Embora as gaiolas de rato consideravelmente maiores exijam a ampliação do tamanho do design de hardware original, o uso de cabos significativamente mais longos pode afetar negativamente a sensibilidade e a precisão da detecção capacitiva devido à interferência, bem como a integridade da comunicação I²C entre as placas de sensor encadeadas e a interface Arduino. Contornamos esse problema com a adoção do sistema de comunicação diferencial I²C para obter transmissão de sinal de alcance ultralongo e quase sem perdas por meio de cabos Ethernet. Os materiais usados para os componentes da gaiola permitem fácil limpeza e desinfecção entre os usos. O lickômetro pode ser esterilizado e limpo com solução de EtOH a 70%, enquanto deve-se tomar cuidado para garantir que os componentes elétricos, como a fita de cobre condutora, permaneçam intactos. Equipamentos não elétricos que estão em contato direto com o animal, como o bloqueador de sorvete e o painel de acrílico, podem ser bem lavados com água morna e sabão.

A confiabilidade e a eficácia de qualquer sistema de detecção de lambedura requerem construção e instalação adequadas, bem como testes extensivos, monitoramento diligente de erros e solução de problemas eficaz. Todos os componentes DIY precisam ser feitos e montados com habilidade e cuidado. Isso é especialmente importante para etapas que envolvem soldagem, que podem exigir prática para iniciantes. Independentemente disso, testes extensivos de todos os licômetros são necessários antes do uso em experimentos reais. Se o sistema precisar ser modificado para se adaptar às necessidades experimentais individuais, as configurações do sensor (por exemplo, limites de toque e liberação) podem precisar ser ajustadas para uma detecção precisa de lambidas. Para usuários iniciantes, sugerimos testar o sistema em um estudo piloto breve e de pequena amostra usando uma solução altamente palatável que gerará altos níveis de consumo de álcool. A detecção de lambida pode ser verificada em tempo real inspecionando visualmente a placa do sensor, pois o LED pisca sempre que uma lambida é registrada. Correlações fortes, significativas e consistentes entre o número de lambeduras e a mudança no peso da garrafa devem ser usadas como referência para a configuração adequada de hardware e software. Mesmo após a finalização da configuração, recomendamos iniciar a gravação de um determinado experimento em um dia em que os ratos recebem duas garrafas contendo água para solucionar problemas de equipamento que podem ser evidentes no início de um experimento. Também pode ser vantajoso testar a função do lickômetro no dia da água associada à troca da gaiola, pois isso requer que os lickômetros sejam desconectados e reconectados ao sensor. A falha aleatória do lickômetro ou sensor individual, que resultaria em dados discrepantes muito óbvios (por exemplo, nenhuma ou poucas lambidas detectadas apesar de uma mudança substancial no peso da garrafa) consistentemente para o mesmo licômetro, é indicativa de componente(s) defeituoso(s). Recomendamos preparar componentes extras para cada elemento do sistema de licômetro com antecedência para permitir uma fácil substituição conforme necessário. Finalmente, a importância de garantir que os cabos do sensor não se sobreponham ou dobrem excessivamente não pode ser subestimada. Isso pode resultar em casos aleatórios de detecção de lambida ruim, evidente por um número de lambida excessivamente baixo para uma determinada mudança no peso da garrafa ou durações de lambida extremamente grandes (perto de 60.000 ms para uma caixa de 1 minuto) abrangendo minutos ou horas. No entanto, pequenas perdas de dados são inevitáveis em estudos que coletam dados em 24 horas para muitos animais ao longo de muitos dias usando a abordagem padrão ou equipada com licômetro. Os pesquisadores podem excluir dados errôneos para as raras sessões de consumo quando os pesos das garrafas e / ou lambidas claramente não refletem a ingestão (por exemplo, entupimento do bebedor, erro de calibração, etc.). Em ocasiões como essas, o valor médio de uma determinada medida (por exemplo, ingestão (g/kg), lambidas, etc.) durante o período de estudo para esse assunto específico pode ser substituído pelo valor ausente durante a análise dos dados. A ANOVA de efeitos mistos também pode ser usada como uma alternativa para acomodar pontos de dados ausentes.

Uma das vantagens do paradigma de beber com duas garrafas é o aspecto voluntário da ingestão de etanol. Isso proporciona excelente validade de face, particularmente à luz dos achados que mostram que o álcool administrado pelo experimentador pode produzir efeitos significativamente diferentes na função cerebral e no comportamento em comparação com o álcool autoadministrado voluntariamente⁴². Além disso, a natureza voluntária do paradigma permite que os pesquisadores capturem diferenças individuais na ingestão semelhantes à variabilidade na preferência pelo álcool e nos padrões de consumo observados em humanos. Essas diferenças individuais podem fornecer uma oportunidade poderosa para os pesquisadores correlacionarem o consumo (ingestão e / ou padrões) com a magnitude dos efeitos patológicos observados.

No entanto, algumas limitações do paradigma de beber em gaiola doméstica de duas garrafas devem ser consideradas. Por exemplo, embora a variabilidade individual na ingestão de etanol possa ser vantajosa para alguns experimentos, pode ser uma desvantagem em outros experimentos onde um nível consistente de intoxicação ou exposição ao etanol pode ser desejável. Isso é particularmente verdadeiro para experimentos que examinam as consequências da dependência e abstinência da exposição crônica ao etanol. É importante ressaltar que o consumo de duas garrafas não é caracterizado como um modelo de dependência - mesmo em ratos com acesso ao etanol por períodos prolongados de tempo. Assim, na ausência de sintomas de abstinência associados, os pesquisadores devem ter cautela ao interpretar as consequências do consumo prolongado de etanol como efeitos da dependência e/ou abstinência. De fato, é possível, se não plausível, que ratos que bebem quantidades relativamente grandes de etanol durante o procedimento de escolha de duas garrafas exibam sintomas de abstinência, mas que ratos que bebem volumes totais mais baixos em um determinado período de 24 horas não mostrem sinais semelhantes de dependência. Os padrões de consumo também podem desempenhar um papel importante nessa consideração, pois dois animais que bebem a mesma quantidade durante um período de 24 horas podem experimentar níveis muito diferentes de intoxicação (ou seja, BEC), dependendo do padrão de ingestão de etanol²². Isso destaca a utilidade do LIQ HDR no procedimento de escolha de duas garrafas, pois pode identificar prontamente ratos que consomem uma determinada dose de etanol em um ritmo rápido (ou seja, engolir) versus aqueles que consomem a mesma dose em um ritmo muito mais lento (ou seja, gole). Embora potencialmente indesejável para estudos que investigam os efeitos de uma dose controlada de etanol, a detecção de mudanças nos padrões de consumo (por exemplo, episódios de compulsão alimentar reduzidos) após uma intervenção experimental específica tem valor translacional significativo, dada a abordagem de redução de danos que é cada vez mais adotada na clínica. Finalmente, não é necessário esforço para que os animais tenham acesso ao etanol em paradigmas de consumo doméstico em gaiolas, incluindo o descrito aqui. Portanto, a utilidade desse paradigma é limitada à análise apenas do consumo de álcool, enquanto os métodos operante são favorecidos nos casos em que os pesquisadores estão interessados em examinar a busca de álcool - uma característica importante do AUD.

Em resumo, o protocolo descrito aqui fornece aos pesquisadores todas as informações e recursos necessários para medir a ingestão de etanol em ratos em gaiolas domésticas. Apresentamos opções para abordagens de resolução relativamente baixa e alta, proporcionando aos pesquisadores a flexibilidade de escolher o método mais adequado às suas necessidades de pesquisa.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Componentes disponíveis comercialmente			Quantidade
Quebra do sensor de toque capacitivo de 12 teclas (MPR121)	Adafruit	1982	3
Par correspondente de cabo de 2 pinos (passo JST XH 2,5 mm)	Adafruit	4872	18
Jumper de placa de ensaio de 4 pinos (Qwiic)	SparkFun	PRT-17912	1
Cabo de 4 pinos (Qwiic de 100 mm)	SparkFun	PRT-17259	1
cabo de 4 pinos (Qwiic de 50 mm)	SparkFun	PRT-17260	3
breakout de deslocador de nível de 5V para 3V Adafruit		5637	1
Protetor de toque capacitivo (2,8 polegadas)	Adafruit	1947	1
Fita condutora de cobre (1/4 de polegada)	DigiKey	4393-CFT-1/4-ND	1
Dados escudo de registro	Adafruit	1141	1
Kit de breakout de comunicação diferencial I2C (QwiicBus)	SparkFun	KIT-17250	1
Fita isolante	DigiKey	3M156004-ND	1
Tubo termorretrátil (3/16 polegadas várias cores)	Abraçadeiras e mais	HS357-S10	6
Kit de tubo termorretrátil (4 polegadas preto)	Jameco	2095963	1
Bateria de lítio para moedas (3V 12.5mm)	DigiKey	1908-CR1220JAUCHSB-ND	1
arruela plana M5	Grainger	54FN66	1
porca hexagonal M5	Grainger	6CA72	1
parafuso de máquina M5 (12mm)	Grainger	6GU88	1
M5 parafuso de máquina (25mm)	Grainger	6GU91	2
Fio jumper macho/macho	Adafruit	1957	1
Placa microcontroladora (Arduino Mega 2560 Rev3)	DigiKey	1050-1018-ND	1
filamento PETG (prata 2,85mm)	MatterHackers	M-DDH-UZR2	2
filamento PLA (2,85mm preto)	Filamento PLA	MatterHackers M-SEW-RUAW	2
(prata 2,85mm)	MatterHackers	M-66P-6CLE	1
Fonte de alimentação (DC 9V 1A)	Newegg	9SIBPPKJYR5991	1
cartão de memória SD/microSD (8GB)	Adafruit	1294	1
Conectores de empilhamento de blindagem	Adafruit	85	1
Fio de núcleo sólido (vermelho 22AWG)	Adafruit	288	1
Fio de núcleo trançado (22AWG preto)	Adafruit	2976	1
Fio de núcleo trançado (vermelho 22AWG)	Adafruit	3068	1
Tubo de sipper com tampa de torção com bola	Design alternativo	TCCN8.5-ST2.5SB	38
Garrafa de água (8oz)	Design alternativo	WB8FS	38
Custom Componentes impressos em 3D			Quantity
3D-printed Arduino case bottom	N/A	ARDUINO_Bottom.stl	1
Tampo de caixa Arduino impresso em 3D	N/A	ARDUINO_Top.stl	1
Clipe de cabo impresso em 3D L	N/A	CLIP_L.stl	18
Porca de clipe de cabo impresso em 3D	N/A	CLIP_Nut.stl	18
Clipe de cabo impresso em 3D R	N/A	CLIP_R.stl	18
Suporte para garrafa de lickometer impresso em 3D	N/A	LICKOMETER_Bottle Holder.stl	19
Protetor de cabo de licômetro impresso em 3D L	N/A	LICKOMETER_Cable Protector_L.stl	6
Protetor de cabo de licômetro impresso em 3D R	N/A	LICKOMETER_Cable Protector_R.stl	12
letras de licômetro impresso em 3D	N/A	LICKOMETER_Letters.stl	19
Parafuso de montagem impresso em 3D	N/A	Parafuso de montagem.stl	4
Estojo do sensor impresso em 3D A inferior	N/A	SENSOR_A_Bottom.stl	1
Estojo do sensor impresso em 3D A superior	N/A	SENSOR_A_Top.stl	1
Estojo do sensor impresso em 3D B inferior	N/A	SENSOR_B_Bottom.stl	1
Estojo do sensor impresso em 3D B superior	N/A	SENSOR_B_Top.stl	1
Estojo do sensor impresso em 3D C inferior	N/A	SENSOR_C_Bottom.stl	1
Estojo do sensor impresso em 3D C top	N/A	SENSOR_B_Top.stl	1
Letras do estojo do sensor impresso em 3D	N/A	SENSOR_Letters.stl	1
Bloqueador de sipper impresso em 3D	N/A	SIPPER_Blocker.stl	36
Base do bloqueador de sipper impresso em 3D	N/A	SIPPER_Base.stl	18
Engrenagem do bloqueador de sipper impresso em 3D	N/A	SIPPER_Gear.stl	18
Porca bloqueadora de sipper impressa em 3D	N/A	SIPPER_Nut.stl	18
Worm bloqueador de sipper impresso em 3D	/A	SIPPER_Worm.stl	18
Painel acrílico de lickometer cortado a laser	N/A	LICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf	19

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