Sistemas de Modelo de Tecido Organotípico para Investigação de Interações Patógeno-Hospedeiro In Vitro

Resumo

O presente protocolo descreve a aplicação de modelos de tecidos organotípicos para investigar as interações patógeno-hospedeiro in vitro. Especificamente, o sistema modelo descrito usa um epitélio oral multicamadas exposto a microrganismos associados a biofilmes (placa dentária) no contexto de saúde bucal versus doença.

Resumo

Recapitular a interface patógeno-hospedeiro na barreira epitelial ou mucosa in vitro continua sendo uma perspectiva desafiadora para os biólogos de infecções. Embora as monocamadas epiteliais 2D cultivadas internamente não tenham uma representação verdadeira da situação in vivo , os modelos de tecidos disponíveis comercialmente são frequentemente negligenciados devido ao seu custo e praticidade. No entanto, com um planejamento cuidadoso, esses modelos fornecem plataformas reproduzíveis para uma vasta gama de aplicações diferentes. Aqui, relatamos o uso de modelos epiteliais que podem ser utilizados para uma ampla variedade de propósitos experimentais para investigar as interações patógeno-hospedeiro em vários nichos ecológicos, como cavidade oral, pele e mucosa vaginal. De células planctônicas simples a co-cultura de biofilme complexo, modelos epiteliais são usados para avaliar a adesão e invasão microbiana e para avaliar a resposta do hospedeiro em nível transcricional e / ou proteico, com escopo para perfis mais detalhados usando diferentes abordagens ômicas. Além disso, esses sistemas biológicos podem ser usados como bancos de teste mais precisos para avaliar a atividade antimicrobiana convencional e nova em um microambiente complexo hospedeiro-patógeno in vitro. Os protocolos aqui descritos documentam como os modelos são manuseados na chegada e preparados em laboratório para estimulação de co-cultura com comunidades de biofilme. Os métodos detalham como os resultados experimentais são alcançados a partir dos sistemas modelo, incluindo o processamento de tecidos, a configuração da co-cultura e a geração de dados. Esses experimentos incluem a expressão gênica do hospedeiro por meio de análises de qPCR simples e multiplex e detecção de proteínas inflamatórias usando ELISAs. Em conclusão, os modelos epiteliais fornecem sistemas in vitro úteis para estudos investigativos pré-clínicos em interações simples ou complexas entre hospedeiro e patógeno.

Introdução

Os sistemas modelo in vitro fornecem excelentes leitos de teste para investigar as interações patógeno-hospedeiro. Esses sistemas organotípicos visam recapitular o microambiente de diferentes nichos ecológicos propensos a perturbações microbianas. Vários artigos de pesquisa foram publicados utilizando modelos de tecido EpiSkin (anteriormente SkinEthic) para avaliar as interações patógeno-hospedeiro na cavidade oral 1,2,3,4,5, barreira cutânea 6,7,8,9,10,11 e mucosa vaginal ^5,12,13, entre outros^14,15. Ao contrário da cultura de células "bidimensionais" ou "2D", que depende do uso de monocamadas de linhagens de células epiteliais expostas a microrganismos, esses modelos disponíveis comercialmente consistem em várias camadas de células diferenciadas cultivadas em uma interface ar-líquido. Embora mais baratos e muitas vezes considerados mais reprodutíveis, os sistemas de cultura 2D são propensos a danos celulares quando cultivados com microrganismos, o que nem sempre representa com precisão as barreiras epiteliais ou mucosas in vivo^16,17.

Evidências recentes demonstram que as técnicas de cultura "tridimensionais" ou "3D" estão se tornando mais populares em várias disciplinas científicas, incluindo ciências do câncer, pesquisa com células-tronco e descoberta de medicamentos^16,18. No contexto da biologia da infecção, os modelos de tecido 3D podem ser utilizados para investigações sobre interações hospedeiro-bactérias, fúngicas ou espécies mistas na interface da barreira epitelial ou mucosa dentro de um microambiente controlado in vitro. Esses modelos têm muitas vantagens para os sistemas de cultura 2D, permitindo a avaliação da colonização e / ou invasão de tecidos por organismos patogênicos ou comunidades complexas de biofilme¹⁷ e avaliando as respostas do hospedeiro em um nível multicomponente para diferentes biomarcadores, onde os modelos 2D às vezes são restritos por seus perfis transcricionais ou proteômicos^{16 , 17 , 18}. Em última análise, as aplicações pré-clínicas de tais sistemas 3D são vastas, fornecendo dados exploratórios importantes que podem ser levados adiante em modelos in vivo ou estudos clínicos.

No contexto da saúde e doença bucal, entender as vias inflamatórias envolvidas na superfície da mucosa oral é importante para os médicos, pois isso pode direcionar as modalidades de tratamento. Estudos anteriores mostraram que biofilmes "associados à saúde" podem provocar respostas inflamatórias mínimas 3,19,20,21. Isso pode ser decorrente de uma menor carga microbiana associada à saúde bucal ou devido à composição do biofilme com Streptococcus spp., amplamente considerado imunomodulador ^22,23. Por outro lado, biofilmes compostos por microrganismos associados a doenças, como Fusobacterium nucleatum e Porphyromonas gingivalis, são de natureza pró-inflamatória 3,20,24,25,26,27. Uma revisão de Mountcastle et al. em 2020 descreveu todos os modelos de co-cultura relevantes que existiam na época para o microambiente oral¹⁷. Embora esses modelos organotípicos sejam abundantes, com vários produzidos desde^28,29, ainda há uma série de obstáculos desafiadores associados à criação de tais modelos 3D. Para citar alguns, esses modelos exigem otimização significativa e são altamente trabalhosos e intensivos em recursos para produzir; A reprodutibilidade também pode ser altamente variável, a menos que seja cuidadosamente controlada^16,17. Modelos comercialmente disponíveis contornam esses problemas, fornecendo plataformas para investigar as interações patógeno-hospedeiro dentro da cavidade oral e em outros nichos ecológicos do corpo humano.

Em resumo, o presente protocolo visa delinear a aplicação de modelos de tecidos organotípicos para investigar interações patógeno-hospedeiro in vitro no contexto da saúde e doença bucal. Especificamente, o sistema modelo descrito usa um epitélio oral multicamadas comercialmente disponível exposto a uma comunidade de biofilme definida representativa da doença inflamatória oral, a gengivite.

Protocolo

O protocolo a seguir envolve a preparação de um biofilme multiespécies representativo da gengivite, contendo um total de 7 espécies (spp.)^7,30. Três Streptococcus spp., Streptococcus mitis (NCTC 12261), Streptococcus intermedius (DSM 20753) e Streptococcus oralis (NTCC 11427) são incluídos para mimetizar a saúde bucal, atuando como colonizadores iniciais da película salivar. Quatro microrganismos anaeróbicos associados à mudança da saúde bucal para a doença são adicionados em seguida: Veillonella dispar (NCTC 11831), Actinomyces naeslundii (DSM 17233) e dois Fusobacterium spp. Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953) e Fusobacterium nucleatum subespécie (subspp.) vincentii (DSM 19507). Todas as etapas envolvidas são conduzidas assepticamente na chama ou em um gabinete de segurança classe II. Todos os meios e solução salina tamponada com fosfato (PBS) usados para preparações microbiológicas são autoclavados antes do uso, e a esterilidade é avaliada em intervalos regulares durante o protocolo. Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de comunidades microbianas para co-cultura

NOTA: Este protocolo descreve a geração de um biofilme multiespécies representativo de consórcios associados à inflamação do tecido gengival, também conhecida como gengivite. Tal modelo tem sido utilizado para avaliação da resposta do hospedeiro na saúde bucal e na doença, conforme descrito anteriormente³.

1. Reviva todas as três espécies de Streptococcus em placas de ágar sangue (base Columbia Blood Agar contendo 5% de sangue de cavalo desfibrinado estéril) de estoques congelados de grânulos porosos (obtidos comercialmente) contendo os microrganismos armazenados a -80 ^{° C.} Isso é conseguido usando uma alça de inoculação e a técnica de placa de listra.
   1. Incubar durante 24 h a 37 °C, 5% de CO₂ e, em seguida, isolar 3-4 colónias para propagação em 10 ml de meio de caldo de soja triptona. Caldos de cultura por 16-18 h a 37 °C, 5% CO₂.
2. Para os patógenos intermediários, reviva V. dispar, A. naeslundii, F. nucleatum e F. nucleatum subspp. vincentii anaeróbio em ágar anaeróbio fastidioso contendo 5% de sangue de cavalo desfibrinado estéril por 48 h a 37 ° C, antes da cultura em caldo de Schaedler por mais 24-48 h nas mesmas condições.
3. Após o crescimento, suspensões de células de pellets por centrifugação por 5 min, 20 ° C a 3000 x g, depois lave os pellets em 10 mL de PBS estéril (pH 7,2-7,6). Suspensões de células de pellets novamente por centrifugação por 5 min, 20 °C a 3000 x g e, em seguida, repita as etapas de lavagem pela segunda vez. Ressuspenda as células lavadas em 10 mL de PBS estéril para padronização.
4. Padronizar os três Streptococcus spp. individualmente usando um espectrofotômetro a 550 nm. Valores de absorbância de 0,50 (intervalo de 0,45-0,55 aceitável) são indicativos de uma contagem de células de ~ 1 x 10⁸ células / mL, conforme determinado anteriormente usando a técnica de contagem de células de Miles e Misra³¹. Para atingir essa leitura de absorbância, dilua ainda mais 10 mL de suspensões de células lavadas em PBS estéril.
5. Após a padronização, diluir todos os Streptococcus spp. 1:10 para 1 x 10⁷ células/mL em uma mistura 1:1 de caldo Todd Hewitt (THB) e meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Adicionar 500 μL de suspensões celulares pipetando para uma placa de cultura de tecidos com microtitulação de 24 poços contendo um disco de hidroxiapatita de 13 mm de diâmetro. Deixar os biofilmes amadurecerem durante 24 h a 37 °C, 5% de CO₂.
   NOTA: Biofilmes multiespécies podem ser cultivados em diferentes substratos orais relevantes, como esmalte, dentina³² e superfícies de prótese dentária de poli (metacrilato de metila)^33,34. Meios alternativos também podem ser usados para esses modelos, como saliva artificial ou sintética, embora uma consideração cuidadosa deva ser feita dependendo dos consórcios de microrganismos usados: estudos mostraram que a seleção do meio de crescimento tem implicações importantes para o crescimento do biofilme da comunidade mista^35,36.
6. No dia seguinte, padronize os quatro microrganismos anaeróbicos de maneira semelhante ao acima (etapas 1.2-1.4). Suspensões de células de pellets, lave duas vezes e, em seguida, padronize V. dispar para absorbância de 0,50 (faixa de 0,45-0,55) e os três microrganismos restantes para absorbância de 0,20 (faixa de 0,18-0,22). Uma vez padronizado, dilua ainda mais todas as suspensões 1:10 para 1 x 10⁷ células/mL em uma mistura de 1:1 de THB e RPMI.
7. Remova cuidadosamente as células não aderidas e os meios gastos e descarte-os dos biofilmes de Streptococcus por pipetagem. Substitua os poços das placas de microtitulação por 500 μL de suspensões padronizadas de 1 x 10⁷ células/mL dos quatro anaeróbios. Cultura de biofilmes durante 24 h em condições anaeróbias a 37 °C.
8. Após 24 h, remova as células não aderidas e os meios gastos dos biofilmes de 7 espécies e substitua por 500 μL de mistura estéril 1:1 de meio THB: RPMI. Os biofilmes são deixados para amadurecer anaerobicamente a 37 ° C por 4 dias, com o meio removido e reabastecido diariamente (quatro mudanças de meio no total).
9. No dia 7, o biofilme multiespécies está totalmente maduro e pronto para experimentos a jusante. Lave os biofilmes duas vezes com 500 μL de PBS estéril para uso em co-cultura.
   NOTA: Os biofilmes podem ser perfilados usando uma variedade de metodologias biológicas, como qPCR (para avaliação composicional) e perfil microscópico com microscopia confocal ou eletrônica, conforme descrito anteriormente³.

2. Manipulação organotípica do tecido e configuração experimental

NOTA: A configuração experimental descrita abaixo envolve tecido de Epitélio Oral Humano (HOE) composto de células TR146 cultivadas em um filtro de membrana de policarbonato inerte. Existem outros modelos, incluindo modelos de epiderme, bexiga, esofágico, córnea, gengiva e epitélio vaginal. Todos os modelos são manuseados e preparados de maneira semelhante à descrita abaixo para investigar as interações patógeno-hospedeiro.

1. Na chegada, desembale e transfira o tecido e a mídia HOE para um gabinete de segurança classe II. Adicione um total de 1 mL de meio de manutenção fornecido com o tecido a placas de 12 poços.
2. Remova as inserções de policarbonato contendo o HOE com pinças estéreis das placas de 24 poços e do ágar nutriente usado para o transporte e transfira-as para as placas de 12 poços que contêm a mídia, garantindo que não haja bolhas de ar sob o tecido. Certifique-se de que qualquer excesso de ágar preso nas laterais ou na parte inferior das inserções seja cuidadosamente removido usando uma pinça adicional ou papel de seda.
3. Incubar modelos de tecido por 24 h a 37 ° C, 5% de CO₂ antes da configuração experimental para se aclimatar às condições de laboratório após o envio. Vale ressaltar que meios de manutenção adicionais ou meios de crescimento estão disponíveis para manutenção mais longa ou maturação adicional dos modelos de tecido.
4. Experimentos de co-cultura agora podem ser conduzidos. Para o exemplo fornecido aqui, remova os biofilmes de 7 espécies criados como acima (etapas 1.1-1.9) de seus substratos por sonicação. Para conseguir isso, remova os discos de HA contendo biofilmes do fundo das placas de 24 poços usando uma agulha e pinça de 19 G e, em seguida, transfira uma bijuteria contendo 1 mL de PBS estéril de Dulbecco. Sonicar a 35 kHz por 10 min em banho-maria de sonicação.
5. Remova cuidadosamente as inserções contendo os modelos de tecido usando uma pinça da aclimatação noturna e adicione 100 μL de suspensão de sonicado de biofilme diretamente ao tecido por pipetagem. Use tecidos de controle não estimulados para fins comparativos. Para essas inserções de tecido de controle, adicione 100 μL de PBS estéril de Dulbecco sem a suspensão de biofilme.
   NOTA: Células planctônicas, sobrenadantes de biofilme gasto contendo células dispersas ou biofilmes inteiros podem ser utilizados para o modelo de co-cultura no lugar do sonicato de biofilme. Diferentes aplicações para esses modelos de patógeno hospedeiro usando diferentes estimulantes microbianos são esquematizadas na Figura 1, conforme documentado em outro lugar 3,5,6,8,13,37,38.
6. Após a adição, transfira as pastilhas para outra placa de 12 poços contendo 1 mL de meio de manutenção novo, garantindo novamente que não haja bolhas de ar embaixo das pastilhas. Incubar placas contendo modelos de tecido por 24 h a 37 ° C, 5% de CO₂ antes do processamento de tecido para aplicações a jusante.
   NOTA: Os fornecedores de tecidos podem fornecer meios adicionais para apoiar a cultura contínua do tecido após a exposição a agregados sonicados ou biofilmes. Para tanto, vários modelos anteriores que investigam a inoculação prolongada de biofilme tecidual foram publicados 21,28,39. Para obter resultados semelhantes usando o modelo organotípico atual, sonicar o tecido (como acima, etapa 2.6) e deixar os microrganismos se fixarem por 24 h. Rejeitar qualquer suspensão microbiana remanescente e continuar a cultura na interface ar-líquido durante o período experimental necessário.

3. Processamento de tecidos para saídas experimentais

NOTA: Após a co-cultura, os modelos de tecido são processados para resultados experimentais. As etapas a seguir documentam como o RNA é extraído do tecido para perfil transcricional e como o meio de tecido gasto é usado para detecção de proteínas. O tecido também pode ser fixado em formalina, paraformaldeído ou fixador similar para avaliação histológica, conforme descrito anteriormente ^3,6.

1. Em primeiro lugar, prepare 350 μL de tampão de lise RLT em tubos O-Ring com tampa de rosca de 2,0 mL contendo 1% de β-mercaptoetanol e ~ 100 μL equivalente a esferas de vidro lavadas com ácido de 0,5 mm.
2. Remova as inserções contendo o tecido da mídia usando uma pinça e descarte qualquer suspensão microbiana restante da inserção. Em seguida, segure, invertido, no nível dos olhos para facilitar. Usando uma agulha de 19 G, corte cuidadosamente o tecido e a membrana da parte inferior da inserção e transfira para o tampão RLT.
   1. Homogeneizar o tecido aos 30 s usando um homogeneizador batedor de esferas de bancada e, em seguida, extrair o RNA do lisado seguindo as instruções do fabricante do kit de extração de RNA (consulte a Tabela de Materiais).
      NOTA: O RNA extraído é usado para síntese de cDNA para traçar o perfil da expressão de genes de citocinas e quimiocinas como marcadores de inflamação usando PCR quantitativo (qPCR) ou sequenciamento de RNA. O qPCR é obtido usando matrizes multiplex, como a matriz de perfilador de PCR RT₂ contendo poços com primers prontos para genes específicos, ou reagente à base de verde SYBR com sequências de primers projetadas internamente e ddH₂O³ livre de nuclease.
3. Colete os meios de tecido gastos restantes (~ 850-900 μL) para análises proteômicas usando metodologias de baixo e alto rendimento, como ELISAs, imunoensaios multiplex ou análise de biomarcadores de proteínas multiplex⁷.
4. Usando o meio de tecido gasto, avalie uma variedade de marcadores associados à inflamação no nível da proteína. A mídia gasta pode ser usada diretamente para as metodologias acima (etapa 3.3) ou armazenada a -20 °C ou -80 °C. Evite vários ciclos de congelamento e descongelamento da mídia para tais análises.
   NOTA: O meio pode precisar ser diluído 1:10, dependendo do estimulante tecidual para um perfil proteômico preciso usando ELISAs.

Resultados

Neste experimento, o HOE foi exposto a um sonicado de biofilme de 7 espécies contendo o organismo representativo da mudança da saúde bucal para a inflamação das gengivas (conhecida como gengivite). Esta doença surge da inflamação do tecido epitelial gengival ou oral devido a perturbações microbianas do acúmulo de placa dentária na superfície do dente. Após a estimulação, o tecido e os meios gastos são utilizados para análises transcricionais e proteômicas, conforme discutido acima. Para este experimento, a expressão gênica de um painel de biomarcadores inflamatórios foi detectada no tecido pós-estimulação com sonicado de biofilme (Figura 2). Isso foi conseguido usando uma matriz de perfilador de PCR RT₂ personalizada contendo 16 genes diferentes, e a expressão gênica foi mostrada como mudança de dobra em relação ao tecido não estimulado após a normalização para o gene de manutenção GAPDH. A estimulação microbiana aumentou a expressão de todos os genes, com exceção de CXCL5, com diferenças estatísticas observadas para NFKB, CCL2, CXCL1, CXCL3, CSF2, CSF3, TNF, IL1A, IL1B e TLR4 (Figura 2A). A maior mudança de dobra foi observada para CCL2, CXCL1 e CSF3, com aumentos de 16,9, 10,3 e 15,1, respectivamente (Figura 2B).

O meio HOE gasto foi utilizado para análises proteômicas para detectar proteínas produzidas e liberadas pelo tecido após a estimulação. Isso é útil para determinar se a expressão gênica se correlaciona com a produção de proteínas. Para isso, a expressão gênica de IL8 e a liberação da proteína IL-8 foram avaliadas em tecido controle e tecido estimulado por biofilme-sonicado (Figura 3). A expressão gênica foi avaliada usando qPCR à base de SYBR-green com primers para IL8 e GAPDH, conforme descrito anteriormente³. A expressão de mRNA de IL8 em HOE aumentou 8,67 vezes após estimulação com sonicado de biofilme ( Figura 3A ). No nível proteico, os níveis de IL-8 foram quantificados usando um kit ELISA de IL-8. A concentração de IL-8 no meio gasto foi aumentada de ~ 1,005 ng / mL no tecido controle para ~ 4,245 ng / mL no tecido estimulado por biofilme-sonicado ( Figura 3B ).

Figura 1: Diferentes aplicações para modelos de co-cultura de tecidos organotípicos. Suspensões padronizadas de microrganismos são aplicadas diretamente ao tecido para investigar as interações espécie-hospedeiro (A). Eles são frequentemente usados para avaliar a colonização microbiana em um curto período de tempo (por exemplo, <24 h). Biofilmes complexos são sonicados para investigar os efeitos de células dispersas ou agregados de biofilme nos tecidos (B). Isso é importante, pois anteriormente foi demonstrado que essas células têm fenótipos únicos em comparação com as contrapartes planctônicas ou de biofilme; para esse fim, biofilmes intactos podem ser adicionados diretamente ao tecido usando inserções menores adicionais para criar exposição adjacente com o hospedeiro (C). Finalmente, células planctônicas são adicionadas ao tecido em meios de cultura apropriados para avaliar a colonização microbiana, a formação de biofilme e a dinâmica de crescimento no tecido (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Expressão gênica do tecido HOE após estimulação com biofilme sonicado de 7 espécies. Alteração da dobra da expressão de mRNA de um total de 15 genes inflamatórios normalizados para o gene housekeeping, GAPDH, em tecido HOE em amostras controle, não estimuladas e expostas a 100 μL de sonicado de biofilme de 7 espécies (A). Os três genes (CCL2, CXCL1, CSF3) com as maiores alterações na expressão de mRNA são mostrados em (B). As análises estatísticas foram conduzidas por meio de um teste T paramétrico não pareado, com alterações significativas representadas como *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001, respectivamente. Os dados foram plotados e analisados usando software estatístico e gráfico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Expressão do gene IL8 e níveis de proteína IL-8 produzidos pelo tecido HOE. Alteração na dobra da expressão de mRNA de IL8 no tecido HOE, conforme determinado por qPCR (A) baseado em SYBR-green e níveis de proteína IL-8 quantificados a partir de meios de tecido gastos usando a metodologia ELISA (B). As análises estatísticas foram conduzidas usando um teste T não pareado paramétrico, com mudanças significativas representadas como *p < 0,05 e **** p < 0,0001, respectivamente. Os dados foram plotados e analisados usando software estatístico e gráfico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Aqui, são descritas metodologias para produzir um modelo complexo de biofilme multiespécies representativo da gengivite para co-cultura com tecido HOE para avaliar a resposta do hospedeiro após estimulação microbiana. Este protocolo pode ser adaptado para uso na investigação de interações patógeno-hospedeiro entre células planctônicas, biofilmes de espécies únicas, duplas ou mistas, ou células dispersas em biofilme com tecido epitelial de diferentes nichos ecológicos do corpo humano. O uso de modelos de tecido para investigar as interações patógeno-hospedeiro fornece um avanço importante para os sistemas de co-cultura anteriores que são restritos a monocamadas 2D que nem sempre recapitulam verdadeiramente a situação in vivo, em que o tecido epitelial contém várias camadas celulares 16,17,18. Além disso, os desafios associados ao crescimento in vitro de modelos de tecidos multicamadas são abundantes, com o uso de várias linhagens celulares e/ou crescimento de camadas celulares em uma interface ar-líquido propensa à contaminação. Os tecidos disponíveis comercialmente fornecem uma plataforma reprodutível com modelos consistentemente de alta qualidade que são comparáveis entre réplicas e lotes, conforme mostrado em publicações anteriores ^3,7.

Para a seção "preparação de comunidades microbianas para co-cultura", a inclusão desses microrganismos para o modelo de gengivite de 7 espécies foi escolhida com base em comensais e patógenos comumente identificados associados à mudança da saúde bucal para a doença. Tal como acontece com todos os sistemas complexos de modelo de biofilme in vitro, a inclusão de microrganismos é direcionada por estudos de microbioma relacionados ao nicho ecológico saudável ou doente específico. Para esse fim, nós e outros relatamos o uso de um modelo de biofilme associado à saúde bucal contendo microrganismos comensais (por exemplo, Streptococcus e Rothia spp.)^3,40,41. Além disso, patógenos adicionais podem ser adicionados a esses modelos para criar biofilmes associados a outras doenças. Por exemplo, três microrganismos podem ser adicionados às 7 espécies descritas aqui para criar um modelo de doença associado à periodontite³, enquanto o patógeno fúngico Candida albicans pode ser adicionado para aumentar a polimicrobiociência, bem como adicionar uma camada de complexidade entre reinos³³. De fato, a promoção de interações fúngico-bacterianas pode ter enormes implicações em vários resultados experimentais usando esses modelos de biofilme in vitro quando comparados a biofilmes apenas bacterianos⁴². Em última análise, é altamente recomendável que uma consideração cuidadosa seja tomada ao criar um novo modelo de biofilme multiespécies para tais estudos. Embora os microrganismos incluídos devam ser facilmente identificáveis a partir de extensas pesquisas bibliográficas, para a maioria dos nichos e/ou doenças, eles podem não se integrar bem a um modelo complexo in vitro por diferentes razões. A seguir, são apresentadas algumas outras considerações potenciais que devem ser feitas:

Dinâmica de formação de biofilme
A formação de biofilme in vivo geralmente envolve colonização precoce, intermediária e tardia por microrganismos específicos. A formação de placa dentária supra e subgengival é fortemente caracterizada pela fixação inicial da película salivar encontrada no esmalte por espécies pioneiras (por exemplo, espécies de Streptococcus ), com patógenos intermediários e posteriores que os requerem como suporte para colonização⁴³. Um fenômeno semelhante foi proposto no ambiente vaginal durante a vaginose bacteriana, em que se acredita que a Gardnerella vaginalis seja o colonizador inicial, seguido por anaeróbios subsequentes⁴⁴. No entanto, é importante notar que este pode não ser o caso de outras doenças em outros nichos ecológicos.

Densidade de semeadura para cada microrganismo
Os microrganismos terão diferentes tamanhos e/ou dinâmica de crescimento quando cultivados in vitro; portanto, é importante considerar isso durante o processo de padronização. Por exemplo, C. albicans é 100-150 vezes o tamanho das células bacterianas^45,46, portanto, pode justificar a adição em uma concentração mais baixa, por exemplo, 1 x 10⁶ células / mL, a esses modelos de biofilme.

Antagonismo de espécies
Alguns microrganismos (incluindo a mesma espécie, mas diferentes isolados, cepas laboratoriais e/ou clínicas) utilizados para esses modelos podem competir com outros durante a formação do biofilme, levando à inibição do crescimento de algumas espécies microbianas⁴⁷. Um estudo de Sadiq et al. destacou como diferentes combinações de microrganismos podem influenciar a biomassa do biofilme resultante da sinergia microbiana (ou antagonismo)⁴⁸. Embora a investigação de tais interações dentro de um modelo de biofilme possa ser de interesse para grupos de pesquisa (por exemplo, testar o tratamento pré ou probiótico), outros podem não levar em conta esse antagonismo, o que pode afetar a complexidade de várias espécies ao criar o modelo.

Duração da maturação do biofilme
É fundamental otimizar os prazos de maturação do biofilme, pois isso pode depender da dinâmica de crescimento dos microrganismos incluídos e do sistema modelo (incluindo substratos) usado para a cultura. Tempos de maturação mais longos podem resultar em melhor colonização para patógenos posteriores, mas mais morte celular dentro dos modelos, particularmente dos colonizadores anteriores. Por outro lado, tempos de incubação mais curtos podem ser importantes se quisermos investigar os efeitos de modelos de biofilme imaturos no hospedeiro. Um estudo de Brown et al. descreveu como o mesmo modelo de biofilme de ferida de 10 espécies tinha diferentes perfis inflamatórios em células THP-1 humanas quando amadurecidas por 24 h, 48 h e 72 h, sugerindo que quanto menos maduro o biofilme, mais pró-inflamatório ele é⁷. Resultados semelhantes podem ser observados em modelos de tecido multicamadas. Também é importante observar que as mudanças diárias regulares de meio são uma necessidade para minimizar a morte celular no biofilme, embora isso possa ser alterado dependendo dos esquemas de tratamento em andamento, por exemplo, se estiver avaliando os efeitos de intervenções antimicrobianas prolongadas.

Para a seção "manuseio de tecidos organotípicos, configuração experimental e processamento de tecidos", os prazos de incubação podem ser ajustados de acordo com as necessidades do pesquisador. As interações patógeno-hospedeiro podem ser investigadas em pontos de tempo anteriores, por exemplo, 1-12 h, a pontos de tempo posteriores de 48 h e 72 h, dependendo da questão de pesquisa. Em segundo lugar, todos os meios de manutenção que contenham antibióticos são fornecidos; Assim, as solicitações precisam ser feitas à empresa no momento do pedido para removê-los, dependendo do projeto experimental. Embora o meio sob a inserção não entre em contato direto com a periferia superior do tecido, a menos que uma ferida seja infligida no modelo ^6,8, a remoção de antibióticos pode merecer consideração se investigar a invasão microbiana no tecido.

O material microbiano usado para estimulação de co-cultura também pode ser alterado, conforme discutido acima, com o escopo para avaliar planctônicos, sobrenadantes de biofilme gastos (filtrados e não filtrados), biofilmes inteiros ou incubações de sonicado de biofilme com o tecido. Por exemplo, evidências anteriores mostraram que modelos de tecido, como os fornecidos pela EpiSkin, fornecem modelos úteis para investigar interações fúngicas planctônicas com hospedeiro: células de C. albicans, Candida auris, Malassezia furfur e Trichophyton rubrum demonstraram se ligar e interagir com camadas de tecido periférico em HOE, Epiderme Humana Reconstruída (RHE) ou Epitélio Vaginal Humano, com alguns desses estudos mostrando estimulação de uma resposta do hospedeiro após infecção fúngica 1,5,6,11,12,49. Existem publicações semelhantes para interações bactéria-hospedeiro, por exemplo, a formação de biofilme de Cutibacterium acnes, um patógeno comum associado à microbiota do couro cabeludo na caspa, foi estudada na superfície do RHE, quando cultivada isoladamente e com o organismo fúngico da pele, Malassezia restricta¹⁰. Outros investigaram a capacidade de Staphylococcus spp. de se ligar ao RHE, medindo as características físico-químicas e microbiológicas dessa interação bactéria-hospedeiro⁵⁰. N'Diaye e os co-autores exploraram como o neuropeptídeo derivado de humanos, o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina, influenciou a virulência do Staphylococcus aureus no modelo de tecido RHE⁵¹. Outros investigaram os efeitos protetores das intervenções probióticas na infecção por Pseudomonas aeruginosa do epitélio da córnea humana¹⁴. Enquanto isso, de uma perspectiva polimicrobiana, diferentes grupos estudaram os efeitos de biofilmes de espécies mistas em diferentes substratos de tecido 2,3,7,13.

No geral, esses protocolos e estudos mencionados acima documentam a vasta gama de aplicações para modelos de tecidos organotípicos para investigar as interações patógeno-hospedeiro. Embora estudos tenham mostrado que os modelos EpiSkin, particularmente o modelo de pele RHE, têm boa aplicabilidade para testar produtos cosméticos quanto à corrosão/irritação 52,53,54,55, existem algumas limitações entre esses e explantes de tecidos ex vivo do mundo real ou outros fornecedores de tecidos disponíveis comercialmente^56,57. Uma limitação óbvia seria que todos os modelos de tecido disponíveis comercialmente são gerados a partir de linhagens celulares em um ambiente estéril e "livre de germes", o que significa que o tecido nunca foi exposto a perturbações microbianas: isso pode exacerbar qualquer resposta inflamatória no hospedeiro, muito além do que seria visto in vivo ou após a estimulação de explantes de tecido ex vivo ⁵⁷. Por outro lado, esses sistemas de modelo de laboratório não conterão camadas conjuntivas subjacentes ou vasculatura que se associariam ao tecido in vivo, características que podem ser preservadas durante o explante de tecido ex vivo e características que afetam as respostas inflamatórias. De fato, uma revisão sistemática recente destacou que uma consideração cuidadosa deve ser feita para utilizar modelos de tecido com vasculatura apropriada criados usando várias tecnologias de engenharia, incluindo biomateriais⁵⁸. Por exemplo, um estudo recente usou uma matriz à base de fibrina incorporada com fibroblastos gengivais e células endoteliais microvasculares para criar um equivalente de tecido gengival vascularizado. Os autores descreveram uma resposta inflamatória diferencial no modelo após a exposição a microrganismos associados à saúde ou a doenças⁵⁹. Do ponto de vista comercial, existem modelos mais complexos, como o "modelo T-Skin", que contém um tecido de espessura total que consiste em uma derme composta por fibroblastos revestidos com a epiderme. Seria interessante ver como esses modelos complexos se comparam aos sistemas apenas de epiderme.

Embora nenhum modelo seja perfeito, os modelos de tecidos organotípicos representam alternativas promissoras para testes pré-clínicos, alinhando-se com a estrutura delineada pelos três R's, para Substituição, Redução e Refinamento na realização de pesquisas com animais. Para esse fim, embora os modelos animais forneçam informações importantes sobre a complexa natureza fisiopatológica das doenças humanas relacionadas ao biofilme, eles apresentam desvantagens óbvias. Esses modelos 3D são facilmente manipuláveis, permitindo mudanças grandes e sutis nas investigações sem aprovação ética. A combinação desses modelos com os sistemas complexos de biofilme existentes descritos acima pode melhorar muito nossa compreensão das interações patógeno-hospedeiro e prever melhor o sucesso de novas terapias antes das investigações in vivo .

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Discos de hidroxiapatita (HA) de 13 mm	Plasma Biotal Limited	n/a (feito sob encomenda)	Substrato para formação de biofilme oral, imitando a superfície do dente
Agulha de 19 G (40 mm)	VWR	613-2028	Usado para ajudar na remoção de discos HA de placas e para cortar tecido de inserções
Placas de microtítulo de fundo plano tratadas com TC de 24 poços com tampas	Suprimentos de Laboratório Científico	3524 (pacote de 100)	Placas para cultura de biofilmes e experimentos de co-cultura de tecidos
Contas de vidro lavadas com ácido (425-600 μ m)	Merck: Sigma-Aldrich	G8772	Para lise de tecido para melhorar o rendimento da extração de RNA
Actinomyces naeslundii DSM 17233	Leibniz Institute DSMZ	n/a	Um dos microrganismos usados para o modelo de biofilme complexo
Bead Mill 24 Homogeneizador (ou equivalente)	Fisher Scientific	15-340-163	Para lise de tecido para melhorar o rendimento da extração de RNA
Bijouxes  (7 ml)	Greiner Bio-One	189170 (700 por saco)	Usado para sonicação de biofilme
kit de síntese de cDNA (alta capacidade)	Thermo Fisher Scientific	4368814 (para 200 reações)	síntese de cDNA a partir do RNA do tecido
Columbia Blood Agar (CBA) base	Thermo Fisher Scientific	CM0331B (para 500 gramas)	Usado para preparar placas CBA para cultura de microorganismos aeróbicos Sangue de
cavalo desfibrinado	E & O Laboratories	DHB	Usado para suplementar as placas CBA e FAA para cultura de microrganismos aeróbicos e anaeróbicos
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (dPBS: sem CaCl2 e MgCl2)	Merck: Sigma-Aldrich	DB537	dPBS para co-cultura celular com sonicado de biofilme
Fusobacterium nucleatum ATCC 10953	Coleção de cultura de tipo americano	n/a	Um dos microrganismos usados para o modelo de biofilme complexo
Fusobacterium nucleatum subespécie (subspp.) vincentii DSM 19507	Leibniz Institute DSMZ	n/a	Um dos microrganismos usados para o modelo de biofilme complexo
GraphPad Prism (Versão 10)	GraphPad Software, Inc	n/a	Para criação de gráficos e análise de dados
Kit ELISA IL-8 Humano (kit ELISA não revestido com placas)	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	88-8086-86 (para testes 10 x 96)	Kit ELISA e placas para avaliação de proteínas de meios de tecido gasto
Epitélio Oral Humano (HOE)	Episkin	n/a (feito sob encomenda)	O tecido epitelial utilizado para o sistema modelo de co-cultura
Alças de inoculação (descartáveis, 10 µ L, ou equivalente)	Fisher Scientific	12870155 (pacote de 1000)	Para cultura microbiológica em meios sólidos e líquidos
MicroAmp Fast Reaction 96-well qPCR plates (0.1 mL)	Thermo Fisher Scientific	4346907 (para 10 placas)	Para o perfil de expressão gênica qPCR de
tecido Microbank beads	Pro-Lab Diagnostics	PL.170	Armazenamento e ciropreservação de microrganismos
Água livre de nuclease	Thermo Fisher Scientific	AM9935 (10 x 1.5 mL)	Água de grau RT-PCR para experimentos de qPCR
Placas de Petri (90 mm)	Fisher Scientific (Sterilin)	11309283 (pacote de 500)	Usado para preparação de placas de ágar para cultura microbiana
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	18912014 (pacote de 100 comprimidos)	PBS para padronização de microrganismos e etapas de lavagem de biofilme
Kit mini Rneasy	Qiagen	74106 (para 250 reações)	Kit de extração de RNA baseado em coluna para tecido
Roswell Park Memorial Institute 1640 médio	Merck: Sigma-Aldrich	R7755-10L (para 10 L)	Meios para cultura de biofilme
Matriz de perfilador RT2	Qiagen	330171 (feito sob medida)	qPCR contendo primers prontos para perfil de expressão gênica
Base de ágar anaeróbia Schaedler	Merck: Sigma-Aldrich (Millipore)	91019 (para 500 g)	Usado para preparar placas de ágar anaeróbico fastdioso
Caldo anaeróbio Schaedler	Thermo Fisher Scientific	CM0497B (para 500 g)	Meio líquido para crescimento de microrganismos anaeróbicos
Tubo de anel O de beadbug com tampa de rosca	Suprimentos de Laboratório Científico	Z763837-1000EA (pacote de 1000)	Para uso no homogeneizador Bead Mill 24, para lisar tecidos
Banho de sonicação	Fisher Scientific (Fisherbrand)	n/a	Para sonicação de biofilmes de discos HA
Streptococcus intermedius DSM 20753	Leibniz Institute DSMZ	n/a	Um dos microrganismos usados para o modelo de biofilme complexo
Streptococcus mitis NCTC 12261	Coleção Nacional de Culturas de Tipo	n/a	Um dos microrganismos usados para o modelo de biofilme complexo
Streptococcus oralis NTCC 11427	Coleção Nacional de Culturas de Tipo	n/a	Um dos microrganismos usados para o modelo de biofilme complexo
SYBR-green (qPCRBIO SyGreen Mix Hi-ROX)	PCR Biosystems	PB20.12	SYBR-green mix para qPCR
Caldo Todd Hewitt	Merck: Sigma-Aldrich	T1438	Meios para cultura de biofilme
Caldo de soja triptona (TSB) meio	Merck: Sigma-Aldrich	22092 (para 500 g)	Meio líquido para crescimento de microrganismos aeróbicos
Pinças (150 mm, Aço Inoxidável, Serrilhado)	RS-Pro	545-187	Usado para mover discos de HA e inserções de tecido/extratos de tecido
Tubos universais  (30 ml)	Greiner Bio-One	201150 (400 por saco)	Recipientes para cultura de microrganismos em cultura líquida
Veillonella dispar NCTC 11831	Coleção Nacional de Culturas de Tipo	n/a'Um	dos microrganismos usados para o modelo de biofilme complexo
β-metacaptoetanol	Merck: Sigma-Aldrich	M3148	Desativação de RNase em amostras de tecido