Avaliação da deposição de ferro no cérebro de camundongos 5xFAD por coloração Perls/DAB

Resumo

Este protocolo apresenta métodos para avaliar a distribuição e a quantidade de deposição de ferro nos tecidos, especialmente no cérebro. O protocolo detalha os procedimentos para preparação de amostras, coloração Perls/DAB, captura de imagens e análise de dados.

Resumo

A doença de Alzheimer (DA), uma doença neurodegenerativa comum, é a principal causa de demência em idosos. A deposição de ferro está intimamente ligada à patogênese da DA. No cérebro com DA, níveis elevados de ferro estão fortemente correlacionados com patologias características da DA, incluindo placas β-amilóides, emaranhados neurofibrilares tau e apoptose. Evidências crescentes sugerem que o estresse oxidativo, devido ao metabolismo desregulado do ferro, desempenha um papel importante na fisiopatologia da DA. Compreender o papel do acúmulo de ferro na patologia da DA é, portanto, fundamental para o tratamento da DA. Um protocolo abrangente de coloração de ferro é essencial para detectar a expressão e distribuição de ferro no cérebro. Este protocolo tem como objetivo descrever um método para avaliar a quantidade e distribuição da deposição de ferro no cérebro. Descrevemos os processos envolvidos na preparação de reagentes, tratamento com camundongos e preparação de seções cerebrais. Além disso, apresentamos um protocolo passo a passo detalhado para detecção histoquímica de ferro em seções de tecido cerebral, acompanhado por uma estrutura analítica sistemática que integra avaliação quantitativa e avaliação morfológica para garantir uma interpretação abrangente dos resultados da coloração. Este protocolo experimental ajudará os pesquisadores a entender as deposições de ferro no cérebro e apoiar a pesquisa da DA.

Introdução

A doença de Alzheimer (DA) é a doença neurodegenerativa mais comum e tornou-se um sério problema para a sociedade. A prevalência de DA aumenta drasticamente com a idade 1,2,3,4. As principais características patológicas da doença de Alzheimer (DA) incluem a deposição de placas β-amilóides (Aβ) e emaranhados neurofibrilares (NFTs) devido à fosforilação aberrante das proteínas tau. Aβ é gerado através da clivagem sequencial da proteína precursora de amilóide (APP) pelas enzimas β-secretase e γ-secretase. A desregulação na produção ou depuração de Aβ leva ao seu acúmulo no cérebro, formando placas amilóides, que são reconhecidas como um dos primeiros marcadores patológicos da DA. Essas placas não apenas causam danos neuronais diretos, mas também iniciam uma cascata de efeitos prejudiciais, incluindo neuroinflamação, estresse oxidativo e disfunção sináptica. Coletivamente, esses processos contribuem para a morte neuronal e o declínio cognitivo progressivo observado no^{AD 5}. Apesar de décadas de pesquisa visando predominantemente as características patológicas da doença de Alzheimer (DA), incluindo deposição de placa β amilóide e agregação hiperfosforilada da proteína tau, avanços terapêuticos clinicamente significativos permanecem indescritíveis, com intervenções existentes demonstrando eficácia limitada na modificação da progressão da doença⁶.

O ferro é um metal importante para manter a função cerebral e está envolvido no transporte de oxigênio, síntese de DNA, respiração mitocondrial, síntese de mielina, síntese de neurotransmissores e metabolismo. No entanto, o ferro torna-se nocivo quando as concentrações excedem a capacidade de sequestro celular ^6,7,8. Aumento da deposição de ferro, geralmente co-localizado com placas Aβ, foi observado nas regiões cortical e hipocampal do cérebro em pacientes com DA ^9,10. Através da reação de Fenton¹¹, o ferro livre intracelular pode gerar radicais hidroxila (•OH), bem como espécies reativas de oxigênio. Essas substâncias nocivas não apenas induzem neuroinflamação ativando as células gliais, mas também atacam as biomoléculas da célula por meio do estresse oxidativo, interrompendo a função celular normal e levando à disfunção sináptica ^8,12. Além disso, o aumento do ferro está diretamente envolvido no desenvolvimento de sinais patológicos da DA: o ferro contribui para a produção de Aβ¹² e também aumenta a disfunção da proteína tau, levando a emaranhados neurofibrilares¹³.

Várias técnicas têm sido desenvolvidas para avaliar o conteúdo de ferro no cérebro, incluindo ressonância magnética (RM), bem como métodos químicos e histoquímicos¹⁴. A quantificação in vivo dos níveis de ferro intracerebral por meio da RM é clinicamente importante para pacientes idosos e neurodegenerados¹⁵. A ressonância magnética tem a vantagem de ser não invasiva e altamente sensível: pode detectar a deposição de ferro nos estágios iniciais da doença. Em particular, a técnica de aumento de R2 dependente de campo (FDRI) pode distinguir entre diferentes formas de ferro, como ferritina ferro e heme-ferro¹⁶. No entanto, a RM não consegue detectar o acúmulo de ferro no nível celular e é cara, por isso é usada principalmente em investigações clínicas¹⁷.

A medição colorimétrica é um método químico que determina a concentração de uma substância (como o ferro) medindo a intensidade da cor produzida pela reação da substância em solução com um agente cromogênico¹⁸. Esse método é de fácil execução e utiliza reagentes e instrumentação de baixo custo, tornando-o adequado para laboratórios com orçamentos limitados¹⁸. No entanto, a precisão e a sensibilidade deste método são muito limitadas, pois os resultados estão sujeitos à influência de fatores ambientais, tempo de desenvolvimento da cor e julgamento subjetivo do operador. A espectrometria de absorção atômica com chama (FAAS) é outro método que pode ser usado para avaliar os níveis de ferro¹⁹. Neste método, uma solução de amostra clarificada é obtida queimando o tecido de interesse em um forno de alta temperatura. A amostra é então dissolvida com ácido clorídrico e a concentração de ferro na solução é determinada por espectrometria de absorção atômica. Este método é altamente sensível e adequado para todos os tipos de amostras biológicas¹⁹. No entanto, o processo é demorado e requer equipamentos caros, por isso seu uso é limitado.

A coloração de Perls / DAB para detectar ferro férrico não heme é o método de detecção de ferro mais comumente usado devido à sua alta especificidade e facilidade de implementação em comparação com outros métodos histoquímicos¹⁴. Ao contrário da análise colorimétrica, a coloração de Perls é um método de coloração histoquímica qualitativa que se baseia na reação entre íons de ferro e ferrocianeto de potássio para gerar um precipitado azul. É usado para visualizar microscopicamente a presença e distribuição de ferro nos tecidos. Além disso, este método permite distinguir a deposição de ferro em diferentes tipos celulares e observar a distribuição subcelular da deposição de ferro, fornecendo um método para o estudo do^{AD 20}. A coloração de Perls detecta principalmente ferro férrico não heme e depende da formação do complexo azul da Prússia:

(Azul da Prússia)

No entanto, a coloração tradicional de Perls é ineficaz para detectar a localização de ferro em baixos níveis de ferro. Quando a diaminobenzidina (DAB) é adicionada, ela reage com hexacianoferrato férrico para formar um composto marrom, aumentando a especificidade do ensaio²¹.

O objetivo deste protocolo é descrever como avaliar a quantidade e distribuição da deposição de ferro no cérebro de um modelo de camundongo com DA. Neste protocolo, camundongos transgênicos 5×FAD (C57BL/6J) de 8 meses de idade foram usados como modelo de camundongo AD e foram comparados com camundongos do tipo selvagem da mesma idade. Detalhes dos procedimentos para preparar o reagente químico, seccionar o cérebro, realizar a coloração de Perls / DAB e analisar as imagens tiradas após a coloração são apresentados aqui.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Xuzhou e os regulamentos governamentais chineses para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Perfusão de animais

1. Prepare o fixador: Dissolva o paraformaldeído a 4% (PFA) em solução salina tamponada com fosfato a 1× (PBS) (ver Tabela 1).
2. Anestesiar o camundongo por injeção intraperitoneal com cetamina (100 mg / kg) e xilazina (15 mg / kg). Depois que o mouse estiver anestesiado, fixe-o na bandeja de cirurgia de perfusão com quatro pinos para prender os membros.
   CUIDADO: Para garantir a anestesia adequada, verifique a perda de respostas ao beliscão do dedo do pé, relaxamento dos músculos dos membros e respiração profunda, lenta e constante.
3. Abra o peito com uma tesoura para expor o coração e corte o átrio direito. Injete 20 mL de PBS 1× no ventrículo esquerdo com uma seringa para lavar o sangue. Em seguida, injetar 20 mL de PFA a 4% para fixação.
   NOTA: Controle a profundidade e a direção da agulha para evitar perfurar o septo interventricular. Lembre-se de que uma perfusão ideal apresenta um fígado pálido e membros rígidos após o tremor inicial.
4. Decapite o camundongo perfundido, corte o osso ao redor do crânio com uma tesoura fina, levante o crânio cuidadosamente usando uma pinça romba e extraia o cérebro. Em seguida, mergulhe o cérebro em PFA a 4% a 4 ° C durante a noite.
   CUIDADO: Tenha cuidado com 4% de PFA, que é um forte irritante respiratório. Use uma máscara apropriada e execute esta etapa em uma hotte.
   NOTA: O método de eutanásia foi aprovado pela IACUC das Diretrizes de Eutanásia do Programa de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Xuzhou: Camundongos / Ratos.

2. Crioseccionamento cerebral

1. Desidratar o cérebro com soluções graduadas de sacarose (15% e 30%) a 4 °C durante 24 h para cada passo. O cérebro deve finalmente afundar no fundo da solução de sacarose.
2. Hemisseccione o cérebro ao longo da fissura inter-hemisférica com um bisturi. Coloque a metade esquerda em um tubo de microcentrífuga de 5 mL cheio de 1 mL de solução de sacarose a 30% e um volume igual de composto de temperatura de corte ideal (OCT) para aumentar o contato entre a OCT e o cérebro.
3. Apare o tecido estranho do hemisfério esquerdo com uma lâmina de barbear e mova-o para a plataforma OCT.
4. Incorporar o tecido em OCT com o apoio de uma parede circular feita de folha de alumínio.
5. Congele o tecido em um micrótomo criostato a -22 ° C por pelo menos 1 h e ajuste a temperatura da cabeça de corte para -19 ° C.
   NOTA: Lembre-se de pré-resfriar o vidro anti-rolo e as escovas no criostato junto com a amostra.
6. Monte o bloco de tecido congelado. Apare o bloco de tecido novamente para uma posição apropriada, dependendo da área de interesse e, em seguida, comece a seccionar o cérebro em seções sagitais de 20 μm de espessura.
   NOTA: Se as seções dobrarem, use escovas macias para desdobrar as seções.
7. Recolha cada secção nas lâminas revestidas de gelatina e espalhe uma gota de 1× PBS sobre ela. Vire a seção do cérebro usando um pincel fino e, em seguida, monte rapidamente a seção no slide.
8. Seque as seções coletadas em temperatura ambiente durante a noite e armazene-as a -20 °C.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui por até 2 semanas. Maior tempo de armazenamento pode interferir na qualidade do tecido e, assim, influenciar o resultado do experimento.

3. Coloração Perls / DAB

1. Prepare as seguintes soluções: ferrocianeto de potássio a 2% (K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O), ácido clorídrico (HCI) a 2% e solução DAB a 20× (ver Tabela 1).
2. Coloque uma lâmina contendo seções em um frasco de coloração cheio de PBS 1× e coloque o frasco em um agitador orbital por 5 min para lavar a OCT do tecido.
   NOTA: Ajuste a velocidade do agitador orbital com cuidado (velocidade recomendada: 20 rpm) para evitar que o tecido caia da lâmina em altas velocidades.
3. Misture 20 mL de solução de ferrocianeto de potássio a 2% e um volume igual de ácido clorídrico a 2% em um tubo de centrífuga de 50 mL.
4. Use uma pinça de plástico para transferir a lâmina para o tubo de 50 mL e, em seguida, aqueça o tubo em banho-maria a 60 °C por 30 min.
5. Enxágue a lâmina com 1× PBS e seque o excesso de solução com papel de seda.
6. Use uma pipeta para adicionar 50 μL de solução DAB a cada seção do cérebro e incube por 10 minutos em temperatura ambiente.
7. Aspire o excesso de solução DAB com uma pipeta e lave a lâmina 3 vezes em PBS.
8. Desidrate as seções com soluções alcoólicas graduadas (50%, 70%, 95%, 100%) e xileno (100%, 100%). Incube as lâminas por 3 min cada.
9. Sele as seções com goma neutra²² e coloque a lamínula.
10. Secar as lâminas numa hotte durante 24 horas antes de as guardar numa caixa de lâminas de microscópio.

4. Exames por imagem

1. Ligue o microscópio, ajuste o brilho da fonte de luz e concentre-se na seção do cérebro sob uma objetiva de ampliação de 4×.
2. Capture a imagem com o software de controle da câmera e ajuste as configurações dos parâmetros para evitar a superexposição. As configurações específicas (10×, 40× objetiva) são mostradas na Figura 1.
   NOTA: Evite usar o balanço de branco automático para garantir o mesmo tempo de exposição para cada imagem.
3. Mude para uma objetiva de ampliação de 10×, mova o estágio do microscópio para focar nas áreas com altos sinais de coloração Perls / DAB, especialmente o hipocampo e o córtex cerebral, e capture imagens (Figura 1A).
4. Mude para uma objetiva de ampliação de 40x para capturar imagens com sinais de coloração claros.
5. Salve cada imagem como um TIFF de 8 bits e exporte as imagens para análise posterior.

5. Análise de imagem

1. Em ImageJ/Fiji, selecione Plug-ins > costura > Costura de grade/coleção no menu e, em seguida, selecione Posição desconhecida para escolher as imagens que devem ser costuradas (Figura 2A).
2. Escolha Arquivo > Salvar como > Tiff para salvar a imagem finalizada como TIFF (Figura 2B).
3. Use ImageJ/Fiji para abrir uma imagem e garantir que o formato da imagem seja RGB Color (Figura 2C).
4. Selecione Plug-ins > IHC Profiler Image no menu e, em seguida, escolha Mode > Cytoplasmic Stained Image e o padrão de Deconvolução de Cor H DAB (Figura 2D). Em seguida, converta o formato da imagem para escala de cinza de 8 bits.
5. Converta os valores de cinza da imagem em valores de OD selecionando Analisar > Calibrar > OD não calibrado (Figura 2E).
6. Use a função Threshold para selecionar a área de coloração positiva de Perls / DAB e, em seguida, ajuste as barras de rolagem horizontais até que todos os pontos de sinal marrons estejam cobertos de vermelho (Figura 2F).
7. Clique em Analisar > Definir Medições e selecione as opções Área, Valor médio de cinza, Densidade integrada e, o mais importante, Limitar ao limite para excluir o ruído de fundo (Figura 2G).
8. Selecione Analisar > Medir para obter a tabela de resultados (Figura 2H).
9. Agrupe os resultados e use software estatístico para realizar a análise estatística. Em nosso caso, comparamos o acúmulo de ferro no hipocampo e no córtex de camundongos transgênicos 5xFAD com o do controle negativo (camundongos do tipo selvagem). Para comparações de três grupos, a análise de variância (ANOVA) de uma via foi usada para dados da distribuição gaussiana com o mesmo desvio padrão.

Resultados

Para investigar a distribuição e o acúmulo de ferro em um modelo de camundongo com DA, realizamos a coloração de Perls / DAB em fatias sagitais de camundongos 5xFAD de 8 meses de idade. Conforme mostrado na Figura 3, os sinais de coloração de Perls / DAB foram observados em camundongos 5xFAD e selvagens de 8 meses de idade e em camundongos selvagens de 2 meses de idade. Em camundongos 5xFAD, altos sinais de coloração Perls / DAB foram observados no hipocampo e no córtex, especialmente no sub...

Discussão

A deposição de ferro está intimamente associada à doença de Alzheimer. Por um lado, pode levar à produção de Aβ por meio de vários mecanismos, incluindo aumento da expressão da proteína precursora de amilóide {NOTE: 20}²³, e também aumento da atividade da γ-secretase, o que pode levar à produção acelerada de Aβ²⁴; Por outro lado, a peroxidação lipídica induzida pelo aumento do ferro pode promover a polimerização da tau, o que também pode le...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0.1 M PBS	biosharp	BL601A	Adicione água deionizada para fazer a solução
4% PFA	Beyotime	P0099	Restaurar em 4 ° C para uso
20X DAB solução	Bioss	C-0003	Mix 10 μ l solução A, 10 μ l solução B e 180 μ l
PBS Alcohol	Supelco	107017
HCL	Sigma	7647-01-0	Adicione água destilada a 50 ml
cetamina	China National Medicines	H20193336	100 mg/kg para anestesiar
Microscópio	Olympus	CX43
Composto de temperatura de corte ideal (OCT)	Sakura Finetek	4583
solução de ferrocineto de potássio	Sigma	14038-43-8	Adicione água destilada a 50 ml
de sacarose	Sigma	57-50-1
xilazina& nbsp;	Biotecnologia YS-	(BC) -2842	de Y-S 15 mg/kg para anestesiar
Xilenos	Sigma	1330-20-7

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