Comparando o acesso retroperitoneal transperitoneal e a punção percutânea para modelagem da degeneração discal lombar em coelhos

Summary

Este protocolo comparou punções percutâneas e trans-retroperitoneais em um modelo de degeneração do disco intervertebral (DDIV) de coelho. Ambos os métodos induziram DDIV; no entanto, a abordagem trans-retroperitoneal resultou em alterações mais extensas e menor mortalidade.

Abstract

Este estudo compara a eficácia de dois métodos para induzir a degeneração do disco intervertebral (DDIV) em coelhos: punção percutânea e trans-retroperitoneal do anel fibroso. Quinze coelhos brancos da Nova Zelândia machos saudáveis foram aleatoriamente divididos em três grupos: simulação, punção percutânea e punção trans-retroperitoneal. Uma avaliação abrangente, incluindo taxas de mortalidade, avaliações morfológicas e histológicas, imagens radiológicas e análise de biomarcadores, foi realizada para garantir uma comparação precisa e detalhada entre os dois métodos. Os resultados demonstram que ambas as técnicas de punção induziram com sucesso o DDIV no modelo de coelho. No entanto, a abordagem trans-retroperitoneal resultou em alterações degenerativas mais pronunciadas nos discos intervertebrais, mantendo uma taxa de mortalidade significativamente menor em comparação com o método percutâneo. Esses achados destacam as vantagens da abordagem trans-retroperitoneal na modelagem do IVDD. Este estudo fornece informações valiosas sobre o estabelecimento de modelos de IVDD e estabelece uma base para futuras investigações sobre estratégias eficazes de tratamento para dor lombar, melhorando os resultados dos pacientes.

Introduction

Nas últimas décadas, a lombalgia (DL) emergiu como o distúrbio musculoesquelético mais significativo que afeta a qualidade de vida¹. A lombalgia tornou-se uma preocupação de saúde pública cada vez mais importante, impondo um fardo econômico substancial à sociedade devido à perda de mão de obra e despesas médicas adicionais ^2,3. Somente nos Estados Unidos, os custos diretos e indiretos associados à lombalgia excedem US$ 100 bilhões anualmente, incluindo despesas médicas, perdas de renda e perdas de mão de obra⁴. A lombalgia é frequentemente causada pela degeneração do disco intervertebral (DDIV)5,6,7,8. Dada a alta prevalência e o impacto econômico da lombalgia, a modelagem precisa do DDIV é crucial para explorar estratégias de tratamento.

Para entender a fisiopatologia do DDIV e avaliar as estratégias de tratamento, vários modelos animais pré-clínicos in vivo foram desenvolvidos e utilizados⁹. Vários métodos têm sido empregados nesses modelos para induzir degeneração discal, incluindo lesão discal cirúrgica ou química, estresse mecânico não invasivo, modificação genética e ocorrência natural¹⁰. Dentre esses métodos, a lesão cirúrgica é responsável por até 64,9% da indução do DDIV, sendo a punção com agulha a principal técnica cirúrgica¹¹. O modelo de punção com agulha é caracterizado por sua facilidade de estabelecimento e danos mínimos aos animais experimentais. As abordagens comuns de punção com agulha incluem acesso retroperitoneal aberto ao espaço discal lombar e punção póstero-lateral percutânea. A profundidade de inserção pode ser determinada usando monitoramento radiográfico ou comprimento da agulha. Notavelmente, a abordagem percutânea pode reduzir o dano tecidual iatrogênico em comparação com os métodos cirúrgicos abertos, enquanto o acesso retroperitoneal fornece o benefício de recursos de visualização direta que não foram comparados quantitativamente na literatura anterior. Embora os estudos tenham investigado os efeitos do uso de agulhas de diferentes diâmetros¹² e da punção de diferentes discos¹⁰ na indução de DDIV, os estudos comparativos com foco em diferentes abordagens de punção com agulha permanecem limitados. O modelo de coelho selecionado oferece particular utilidade para pesquisadores que necessitam de estudos longitudinais custo-efetivos com avaliações frequentes por imagem, dada sua semelhança anatômica com discos humanos e suas vantagens sobre os modelos de roedores em termos de tamanho e estrutura¹³.

Neste estudo, modelos de coelhos de DDIV lombar foram estabelecidos usando dois métodos: acesso retroperitoneal aberto para punção do espaço discal lombar e punção póstero-lateral percutânea. Um conjunto abrangente de medidas de desfecho, incluindo alterações morfológicas, histológicas e radiológicas, foi analisado.

Protocol

Os procedimentos experimentais em animais seguiram rigorosamente o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório emitido pelos Institutos Nacionais de Saúde e foram aprovados pelo Comitê de Ética em Animais Experimentais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Número de Aprovação Ética: 2021-23). Foram utilizados quinze coelhos New Zealand White, saudáveis, com 4 meses de idade, de grau limpo (2,25 kg ± 0,25 kg), incluindo sete machos e oito fêmeas. Os animais foram alojados em ambiente com temperatura ambiente de 23 °C ± 3 °C e umidade de aproximadamente 60% ± 10% por uma semana de adaptação, com livre acesso à água e alimento. Antes do experimento, os 15 coelhos foram aleatoriamente divididos em um dos três grupos: o grupo sham (Grupo A), o grupo de punção percutânea do anel fibroso (Grupo B) e o grupo de punção do anel fibroso do espaço trans-retroperitoneal (Grupo C), com cinco coelhos em cada grupo. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Estabelecimento do modelo de DDIV em coelho por punção percutânea do anel fibroso

NOTA: O modelo de DDIV em coelhos foi estabelecido pelo método de punção percutânea do anel fibroso. O procedimento seguiu o método de modelagem de punção descrito por Luo TD et ^al.14 e foi realizado sob orientação radiográfica (Figura 1).

1. Prepare o coelho.
   1. Jejue os coelhos por 24 horas antes da cirurgia, garantindo o acesso à água.
   2. Administrar anestesia por injeção intravenosa de pentobarbital sódico a 3% (1,3 mL/kg) na veia da orelha (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
   3. Confirme a anestesia bem-sucedida verificando se há imobilidade, músculos relaxados, falta de reflexo da córnea e ausência de resposta à dor.
2. Posicione e marque o coelho.
   1. Fixe o coelho em decúbito ventral em uma placa de fixação.
   2. Faça a barba e prepare a área cirúrgica e, em seguida, palpe os pontos de referência ósseos.
   3. Palpe os pontos ósseos nas costas lombares do coelho. Localize a costela mais baixa do coelho, que normalmente corresponde à vértebra logo acima do processo espinhoso L1.
   4. Identifique o processo espinhoso imediatamente abaixo desta vértebra para determinar o processo espinhoso L1.
   5. Localize os pontos mais altos das cristas ilíacas, aproximadamente no nível da vértebra L6.
   6. Rastreie a partir do processo espinhoso L1 para identificar sequencialmente cada processo espinhoso até L7.
   7. Use uma caneta marcadora para marcar o processo espinhoso L1 claramente nas costas do coelho.
   8. Passe para o próximo processo espinhoso e marque-o como L2.
   9. Continue marcando cada processo espinhoso subsequente como L3, L4, L5, L6 e L7. Certifique-se de que cada marca seja distinta e em ordem sequencial para uma identificação clara.
3. Localize e marque o local da punção.
   1. Palpe os processos transversos e localize o ponto médio entre as extremidades distais de L5 e L6.
   2. Marque este ponto e prepare-se para inserir a agulha de punção aproximadamente 1 cm acima dele.
4. Insira a agulha de punção.
   1. Segure a agulha de punção horizontalmente e insira-a em direção ao solo, rompendo a pele.
   2. Avance a agulha para alcançar o corpo vertebral L4 e verifique o posicionamento correto sob orientação de raios-X.
   3. Incline a agulha ligeiramente cefálica em um ângulo de aproximadamente 20° em direção ao disco intervertebral L4-5. Perfure o disco e confirme a precisão da punção sob exame de raios-X.
5. Realize punções de disco.
   1. Perfure com precisão o anel fibroso, usando orientação de raios-X, se necessário.
   2. Repita o processo de punção para os discos intervertebrais L2-3 e L3-4, perfurando cada um uma vez.
   3. Mantenha uma profundidade de perfuração de aproximadamente 5 mm com um tempo de permanência de 5 s para cada disco.
6. Cuidados pós-procedimento
   1. Desinfete e enfaixe o local da punção.
   2. Injete penicilina por via intramuscular no glúteo máximo na dosagem de 40.000 U por coelho diariamente durante 3 dias.
      NOTA: Ajuste a abordagem se a agulha encontrar tecido duro. Use orientação por raios-X para perfuração precisa. Monitore a recuperação do coelho e forneça os cuidados adequados.

2. Estabelecimento do modelo de DDIV em coelhos por punção do anel fibroso do espaço trans-retroperitoneal

NOTA: O modelo de DDIV em coelhos foi estabelecido pelo método de punção do anel fibroso do espaço transretroperitoneal¹² (Figura 2).

1. Jejue os coelhos por 24 horas antes da cirurgia, permitindo o acesso à água.
2. Anestesiar o coelho injetando pentobarbital sódico a 3% por via intravenosa (1,3 mL/kg) na veia da orelha (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
3. Certifique-se de que o coelho esteja imóvel, com os músculos relaxados, sem reflexo da córnea e sem resposta à dor à pressão para confirmar o sucesso da anestesia.
4. Fixe o coelho em decúbito ventral em uma placa de fixação.
5. Faça a barba e prepare a área cirúrgica.
6. Palpe os pontos de referência ósseos, marcando os processos espinhosos lombares L1-L7 nas costas lombares do coelho com uma caneta marcadora.
7. Palpeie novamente os processos transversos do coelho para determinar o local da incisão cirúrgica.
8. Coloque uma cortina estéril e desinfete a pele local para garantir condições assépticas.
9. Use uma abordagem retroperitoneal posterior para dissecar a fáscia e os músculos camada por camada, expondo o aspecto lateral do disco intervertebral lombar.
10. Perfure o anel fibroso com uma agulha de punção a uma profundidade de aproximadamente 5 mm e um tempo de permanência de 5 s.
11. Puncione sequencialmente os discos intervertebrais L3-4, L4-5 e L5-6, garantindo que cada disco seja perfurado apenas uma vez.
12. Suturar os tecidos camada por camada usando um fio de sutura de 0,25 mm de diâmetro.
13. Desinfete e enfaixe o local da punção após a modelagem.
14. Injete penicilina por via intramuscular no glúteo máximo do coelho diariamente na dosagem de 40.000 U por coelho por três dias consecutivos.
    NOTA: Use penicilina com uma especificação de 800.000 unidades/frasco e número de aprovação Medicamento Veterinário 140051251.

3. Seleção de modelos de IVDD e avaliação de resultados

1. Avaliação da mortalidade e do estado geral de coelhos
   1. Observe os coelhos semanalmente para determinar a sobrevivência e registrar a condição geral, incluindo estado mental, padrões de atividade, ingestão de alimentos e água, bem como produção fecal e urinária.
   2. Registre as observações com precisão e anote quaisquer mudanças na condição.
2. Monitoramento de peso de coelhos
   1. Registre o peso corporal dos coelhos antes e depois do estabelecimento do modelo, bem como antes da coleta de tecidos.
   2. Garanta o registro preciso do peso e anote quaisquer alterações significativas.
3. Avaliação radiológica
   1. Obtenha ressonância magnética sagital ponderada em T2 de 1,5T de toda a sequência do explante vertebral lombar de cada coelho branco antes e 4 semanas após o estabelecimento do modelo.
   2. Observe a extensão da degeneração do disco intervertebral.
   3. Realizar uma avaliação quantitativa da degeneração do disco intervertebral usando o sistema de classificação de Pfirrmann modificado proposto por Griffith et ^al.15. Peça a três radiologistas independentes cegos que avaliem as sequências de ressonância magnética ponderadas em T2 de acordo com os critérios estabelecidos: altura do disco, intensidade do sinal do núcleo pulposo e integridade do anel fibroso.
   4. Determine as notas finais por consenso quando as discrepâncias excederem um nível de nota. Realize todas as avaliações usando um software de visualização DICOM padronizado com configurações de exibição calibradas.
4. Avaliação histopatológica e pontuação
   1. Eutanasiar os coelhos 4 semanas após a modelagem usando uma overdose intravenosa de pentobarbital sódico (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) e, em seguida, colher rapidamente os discos intervertebrais L2-L3, L3-L4 e L4-L5 no gelo¹⁵.
   2. Fixe os discos L2-L3 em paraformaldeído a 4% e armazene as amostras restantes a -80 °C.
   3. Mergulhe os discos fixos em uma solução descalcificante, como EDTA a 10%, garantindo a submersão completa. Troque a solução descalcificante a cada 2-3 dias para manter a eficácia.
   4. Monitore o processo de descalcificação regularmente até que a descalcificação total seja alcançada, o que pode levar de vários dias a uma semana, dependendo do tamanho e da espessura do disco.
   5. Enxágue bem os discos descalcificados com água corrente para remover quaisquer vestígios da solução descalcificante.
   6. Desidrate os discos imergindo-os em uma série de soluções graduadas de etanol, começando com 70% de etanol e aumentando gradualmente para 100% de etanol. Conduza cada etapa de desidratação por 1-2 h por grau.
   7. Infiltrar os discos desidratados com cera de parafina (ponto de fusão 56-58 °C) durante um mínimo de 2 h, garantindo uma infiltração completa.
   8. Incorpore os discos infiltrados em um bloco de cera, posicionando-os para seccionamento. Deixe o bloco de cera esfriar e solidificar completamente.
   9. Corte os discos embutidos em fatias finas e uniformes (5-10 μm) usando um micrótomo. Montar os cortes em lâminas de vidro para posterior análise, como coloração histológica ou imuno-histoquímica ^12,13.
   10. Realizar coloração de hematoxilina e eosina (HE), capturar imagens em microscópio óptico e atribuir escores de coloração HE usando a escala de graduação histopatológica do DIV¹².
5. Ensaio TUNEL
   1. Desparafine e reidratie as seções de tecido do disco intervertebral e, em seguida, execute a recuperação do antígeno e a permeabilização da membrana.
   2. Adicione uma mistura de reagente 1 (TdT) e reagente 2 (dUTP) na proporção de 1:9 e incube em uma câmara umidificada.
   3. Lave as seções com tampão PBS, aplique a coloração DAPI e incube no escuro em temperatura ambiente por 10 min.
   4. Capture imagens usando um scanner panorâmico totalmente automatizado e um software de processamento.
6. Detecção de citocinas
   1. Eutanasiar os coelhos experimentais (etapa 3.4.1) e coletar amostras de sangue da aorta abdominal.
   2. Centrifugar amostras de sangue de coelho a 2000 × g durante 10 min a 25 °C para separar o soro das células sanguíneas. Colete cuidadosamente o sobrenadante (soro), garantindo que nenhum detrito celular seja incluído.
   3. Siga as instruções fornecidas no kit ELISA para detectar a expressão de TGF-β em amostras de soro.
   4. Prepare reagentes e padrões conforme indicado no kit ELISA.
   5. Adicione amostras de soro aos alvéolos apropriados na placa ELISA.
   6. Incube a placa na temperatura e duração recomendadas de acordo com as instruções do kit.
   7. Lave a placa conforme as instruções para remover os reagentes não ligados.
   8. Adicione o anticorpo de detecção e outros reagentes necessários, seguindo o protocolo do kit.
   9. Incube a placa novamente pelo tempo e temperatura especificados.
   10. Lave bem a placa para remover o excesso de reagentes.
   11. Adicione a solução de substrato aos poços e incube pelo período recomendado para permitir o desenvolvimento da cor.
   12. Meça a densidade óptica (OD) usando um espectrofotômetro no comprimento de onda especificado nas instruções do kit.
   13. Calcule as concentrações da amostra substituindo os valores de OD na equação fornecida ou usando a curva padrão gerada a partir das concentrações conhecidas dos padrões.

4. Análise estatística

1. Realize análises estatísticas usando software disponível comercialmente.
2. Expresse variáveis contínuas como média ± desvio padrão.
3. Use ANOVA unidirecional para testar as diferenças entre os grupos.
4. Aplique testes de LSD para comparações em pares.
5. Use ANOVA de medidas repetidas para analisar dados de medidas repetidas.
6. Realize a análise de correlação de Spearman para avaliar a correlação entre as variáveis.
7. Defina o nível de significância em α = 0,05 e considere os valores de P menores que 0,05 como estatisticamente significativos.

Results

Os procedimentos cirúrgicos foram realizados sem complicações. Um coelho do Grupo B (grupo punção percutânea) faleceu após o procedimento. Todos os outros animais retomaram os padrões normais de alimentação e atividade no pós-operatório e sobreviveram durante todo o período experimental. Não foi observado sangramento prolongado ou infecção nos sítios cirúrgicos.

Avaliação da mortalidade e do estado geral
A taxa de mortalidade foi de 0% tanto para o Grupo A quanto para o Gru...

Discussion

Os achados deste estudo indicam que tanto a punção percutânea quanto a trans-retroperitoneal são eficazes na indução da degeneração do disco intervertebral (DDIV) em modelos de coelhos. Notavelmente, com base em uma avaliação abrangente do estado geral, mortalidade, avaliação histopatológica, ensaio TUNEL e níveis séricos de TGF-β, o modelo de punção trans-retroperitoneal resultou em alterações degenerativas mais extensas nos discos intervertebrais, mantendo uma taxa de mortalidade mais ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,3 T Ressonância Maenética Veterinária lmaging (MRI)	NINGBO CHUANSHANJIA	CSJ-MR
Álcool médico	LIRCON	20230107
Benzilpenicilina de potássio	Jiangxi Keda Animal	Farmacêutica 140051251
Pinça hemostática	SHINVA	20211239
Seringa de injeção	CONPUVON	20153151307
Lâminas de faca	Hons Medincal	20210615
Medical bola de algodão absorvente	Agulha	Cofoe 20210006
	Shanghai Xiaoyi Medical Devices
Agulha de punção medular	Yangzhou Jiangzhou Medical Devices	20190902	Usado para perfurar disco lombar
Solução salina fisiológica	NeilMed
solução de iodopovidona	Sichuan IJIS Medical Technology
Quasi-microbalance	Explorer
Rabbit	Zhenhua Biomedical	ZH-BXT-3Z
Barbeador	AUX
Análise estatística softeare	IBM	SPSS
Gaze estéril	Cofoe	20202140675
Luvas cirúrgicas	DR. Faca cirúrgica LERSH	20172140028
	Pinças cirúrgicas Hons Medinca	20210019
	SHINVA	20210233
linha de transmissão de dados USB-C	KINI
Microscópio fotográfico de luz branca	Nikon	Eclipse Ci-L