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Análise GC-MS do enriquecimento de deutério de retinol no soro e estimativa dos estoques corporais totais de vitamina A

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DOI:

10.3791/67518

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31 de janeiro de 2025

1Centre for Food and Nutrition Research, IMPM

Neste artigo

Resumo

Este método envolve a extração de retinol do soro, separando-o usando HPLC e determinando isótopos de retinol marcados e não marcados usando GC-MS. A proporção de retinol rotulado para não rotulado é usada para estimar os estoques corporais totais de vitamina A.

Resumo

Este método descreve a determinação do enriquecimento de deutério do retinol no soro e a estimativa dos estoques de vitamina A no corpo. O processo envolve a extração de retinol de 0,4 mL de soro usando 0,5 mL de solução salina a 0,85%, 100 μL de solução de padrão interno e 5 mL de solução de clorofórmio-metanol (2:1 v/v). Após centrifugação e remoção da camada inferior de clorofórmio, a mistura é seca sob nitrogênio e ressuspensa em 0,1 mL de etanol, e a fração de retinol é separada dos demais constituintes por meio de um sistema de HPLC equipado com uma coluna de PE C18. A fração de retinol pode ser coletada manualmente ou com um coletor de frações. Posteriormente, a fração retinol é seca sob nitrogênio e derivatizada com O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) contendo 10% de trimetilclorossilano. Finalmente, os isótopos de retinol marcados e não marcados são quantificados usando um sistema GC-MS equipado com uma coluna capilar de metil siloxano 19091z-431 HP-1, empregando ionização química negativa de captura de elétrons com hélio como gás transportador e metano como agente de ionização. A proporção de retinol marcado para não marcado é então usada nas equações de Olson, Green ou balanço de massa para estimar os estoques de vitamina A.

Introdução

A vitamina A é um nutriente essencial necessário para o sistema visual e manutenção da função celular para o crescimento, integridade epitelial, produção de glóbulos vermelhos, imunidade e reprodução1. A deficiência de vitamina A é um grave problema de saúde pública em todo o mundo, afetando mais de 100 países. Afeta desproporcionalmente crianças pequenas e mulheres grávidas em países de baixa renda. Aproximadamente 190 milhões de crianças em todo o mundo sofrem de deficiência de vitamina A, tornando-se uma questão crítica para a saúde pública e o desenvolvimento infantil2.

Em resposta a essa situação, vários programas, incluindo suplementação de vitamina A com distribuição semestral de altas doses de vitamina A para crianças menores de 5 anos de idade e fortificação de vitamina A de certos produtos alimentares, foram implementados há décadas em muitos países de baixa renda. No entanto, essas intervenções muitas vezes se sobrepõem, expondo algumas populações à ingestão excessiva crônica inadvertida de vitamina A 3,4. Esse risco duplo de deficiência e excesso destaca a necessidade de um biomarcador que possa avaliar com precisão o status da vitamina A em todo o espectro, da deficiência à toxicidade, para orientar a avaliação do programa.

Os biomarcadores de vitamina A são cruciais para avaliar o estado nutricional. Os biomarcadores mais comumente usados são as concentrações séricas de retinol e proteína de ligação ao retinol (RBP). No entanto, é importante notar que esses biomarcadores podem ser temporariamente suprimidos por infecções e inflamações, o que pode diminuir a especificidade das avaliações de vitamina A em certas populações 5,6,7.

Embora as amostras de biópsia ou autópsia hepática sejam consideradas o padrão-ouro para avaliar o status de vitamina A, o indicador indireto mais sensível das reservas totais de vitamina A do fígado é o método de diluição de isótopos de retinol (RID)8. O RID fornece uma estimativa quantitativa do status de vitamina A em todo o espectro, variando de estoques deficientes a excessivos9. Na maioria das aplicações de pesquisa, o método RID envolve a administração de uma dose oral de deutério (2H) ou acetato de retinila marcado com 13C, que então se mistura com os estoques corporais por um período de 14 a 21 dias. Após este período, é recolhida uma amostra de sangue e o soro é armazenado a -80 °C. A proporção de retinol marcado para total é então analisada usando espectrometria de massa para estimar os estoques de vitamina A10, empregando a equação de Olson11, a equação de balanço de massa12 ou a equação de Green13. O protocolo apresentado neste trabalho é válido para a administração de acetato de retinonila marcado com deutério (2H) ou 13C e é baseado no trabalho de Tang et al.14. O objetivo geral desse método é avaliar e monitorar com precisão o status de vitamina A no corpo11. É um método poderoso que fornece uma estimativa quantitativa das concentrações de vitamina A em um amplo espectro de status, da deficiência ao excesso15. É mais exato e preciso do que outros métodos, que muitas vezes dependem de medidas indiretas9.

Protocolo

O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Ministério da Saúde Pública (nº 2015/02/550/CE/CNERSH/SP), e o consentimento informado foi obtido dos pais/responsáveis.

NOTA: Como a vitamina A é sensível à luz, é crucial que todos os procedimentos sejam realizados com pouca luz ou sob iluminação fluorescente dourada16. Os materiais utilizados são detalhados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de reagentes

  1. Cloreto de sódio (0,85% p/v): Dissolver 0,85 g de NaCl em água destilada em balão volumétrico de 100 mL. Encha até a marca de graduação com água destilada e misture.
  2. Clorofórmio-metanol (2:1 v/v): Transferir 300 ml de clorofórmio para um balão volumétrico de 500 ml com uma proveta graduada. Adicione 150 mL de metanol e misture.
  3. Fase móvel A para HPLC: Acetonitrila/tetrahidrofurano/água ultrapura (50/20/30, v/v/v): Transferir 500 mL de acetonitrila para um balão volumétrico de 1000 mL. Adicione 200 mL de tetrahidrofurano e 300 mL de água. Misturar a solução, filtrá-la com um filtro de membrana com poros de 0,45 μm e sonicar (amplitude de 100%, frequência de 40 kHz e duração de 15 min).
  4. Fase móvel B para HPLC: Acetonitrila/tetrahidrofurano/água ultrapura (50/44/6, v/v/v): Transferir 500 mL de acetonitrila para um balão volumétrico de 1000 mL. Adicione 440 mL de tetrahidrofurano e 60 mL de água. Misturar a solução, filtrá-la com um filtro de membrana com poros de 0,45 μm e sonicate.

2. Preparação de soluções-padrão

  1. Preparar a solução-mãe dissolvendo 40 mg do padrão em etanol num balão volumétrico de 100 ml, conforme ilustrado no quadro 1. Encher até à marca de graduação com o solvente e homogeneizar.
  2. Soluções-mãe diluídas: Preparar a solução-mãe diluída transferindo 1 ml da solução-mãe para um balão volumétrico de 50 ml, como indicado no quadro 2. Encher até à marca de graduação com o solvente adequado e homogeneizar.
  3. Determinação da concentração das soluções-mãe diluídas: Colocar uma alíquota (1 ml) da solução diluída num tubo de quartzo e medir a sua absorvância no espectrofotómetro no comprimento de onda especificado (quadro 3) utilizando etanol como branco. Calcule o usando a Lei de Lambert-Beer17. Certifique-se de que o espectrofotômetro esteja calibrado antes da análise, aquecendo o instrumento por 15-30 min, selecionando o comprimento de onda desejado e zerando o instrumento colocando o branco no suporte de amostra. Calcular a concentração utilizando a seguinte fórmula:
    Concentração = (coeficiente de absorbância/absorção) x10,6 (μg/dL)
    NOTA: Para converter valores de unidades convencionais (μg/dL) em unidades SI (μmol/L), multiplique o valor convencional pelos seguintes fatores de conversão: 0,0304 para acetato de retinila e 0,0349 para retinol18.
  4. Preparação dos padrões de trabalho: Com uma pipeta volumétrica, transferir 2 ml das soluções-mãe diluídas para um balão cónico de 100 ml. Encher o balão até à marca de graduação com etanol, homogeneizar e fechar com uma rolha.
    1. Para determinar a concentração exacta de cada solução, avaliar a pureza de cada componente utilizando HPLC equipada com uma coluna C18 e um detector de díodos regulado para 340 nm. Programe a bomba para usar a Fase Móvel A e a Fase Móvel B de acordo com o cronograma mostrado na Tabela 4. Certifique-se de que o sistema HPLC esteja calibrado antes da análise, validando vários componentes, como bomba, detector, amostrador automático e o desempenho de todo o sistema.
    2. Transferir 1 ml das soluções-mãe diluídas para frascos de crimpagem e injectar as amostras no sistema de HPLC de acordo com o procedimento normal. Determine a pureza usando a seguinte equação:
      figure-protocol-1
      EQUAÇÃO 1
      Com esta correção de pureza, calcular a concentração exata dos diferentes componentes na solução-padrão.
  5. Preparação do padrão interno (acetato de retinilo OD ~ 0,2): Usando uma pipeta volumétrica, transfira 30 mL do padrão de trabalho de acetato de retinila para um frasco cônico de 100 mL. Encher o balão até à marca de graduação com etanol, homogeneizar e fechar com uma rolha.
  6. Preparação de soluções de trabalho: Adicione 20 μg de retinol não marcado a 10,00, 3,33, 1,00, 0,33 e 0,00 μg de retinol marcado para fornecer proporções de retinol marcado e não marcado de 0,500, 0,167, 0,050, 0,0167 e 0,00.

3. Análise da amostra

NOTA: As amostras de soro utilizadas neste estudo foram coletadas no14º dia de crianças que receberam uma dose oral (2 mg equivalentes de retinol) de D8-retinol como parte de um estudo projetado para monitorar e avaliar o status de vitamina A de crianças em Camarões.

  1. Extração de retinóides no soro: Esta extração é baseada no trabalho de Folch et al.19 modificado por Tang et al.14. Siga as etapas descritas abaixo.
    1. Deixar as amostras de soro congeladas descongelarem suavemente à temperatura ambiente (20-25 °C) antes da análise. Alíquota de 400 μL de soro em um tubo de cultura descartável de 16 x 100 mm. Adicione 500 μL de solução salina a 0,85% mais 100 μL de padrão interno e 5 mL de solução de clorofórmio-metanol (2:1 v/v).
    2. Vórtice por 30 s e centrifugue a 1157 x g por 10 min a 4 °C. Usando uma pipeta Pasteur de vidro, remova cuidadosamente a camada inferior de clorofórmio para um tubo de cultura descartável de 13 x 100 mm. Secar em banho-maria em nitrogênio gasoso (40 °C) e ressuspender o resíduo em 100 μl de etanol. Vórtice e sonicar por 30 s. Transfira a amostra para um frasco de crimpagem com uma inserção, feche o poço e etiquete. A amostra está pronta para coleta de retinol por HPLC.
  2. Realize a coleta de retinol por HPLC conforme descrito abaixo.
    1. Injectar 70 μL de cada amostra de soro num sistema de HPLC equipado com uma coluna C18 e um detector de díodos regulado para 340 nm. Programe a bomba para fornecer as Fases Móveis A e B a uma vazão constante de 1 mL/min, seguindo o cronograma mostrado na Tabela 4.
    2. Antes de injetar as amostras de soro, injete 70 μL da solução de trabalho de retinol no sistema HPLC e registre o tempo de retenção do pico de retinol. Em seguida, configure o coletor de frações para coletar a fração de retinol eluída dentro de uma faixa especificada em um tubo de 5 mL com uma rolha de vidro fosco. Neste caso, a fração retinol foi coletada em um intervalo de 3 min, de 7,5 a 10,5 min.
      NOTA: A concentração de retinol também pode ser calculada nesta etapa usando uma curva de calibração dos padrões de retinol e a taxa de recuperação obtida do padrão interno.
  3. Realize a derivatização do retinol conforme descrito abaixo.
    1. Secar a fracção de retinol recolhida da HPLC em azoto, em banho-maria, a 40 °C, durante, pelo menos, 3 h. Adicione etanol para facilitar a evaporação da umidade durante a secagem (as amostras devem estar completamente secas, pois a derivatização é sensível à umidade). Adicione 20 μL de BSTFA com 10% de TMCS ao tubo.
    2. Coloque o tubo em um aquecedor de bloco seco regulado para 70 °C e incube por 30 min. Usando uma pipeta Pasteur de vidro, transfira a mistura de reação para um frasco de crimpagem com uma inserção, feche bem com a tampa de crimpagem usando um crimpador de tampa e rotule. A amostra está agora pronta para análise GC/MS e pode ser armazenada em um dessecador a 4 °C até a análise.
    3. Além disso, seque um conjunto de 100 μL de soluções-padrão de trabalho e derivatize conforme descrito acima para calibrar o GC / MS.
      NOTA: A derivatização do retinol usando BSTFA envolve uma reação química onde o grupo hidroxila (-OH) do retinol é substituído pelo grupo trimetilsilil (-Si(CH3)3), formando éter retinil trimetilsilílico. Esse processo aumenta a volatilidade e a estabilidade do retinol, tornando-o mais adequado para a análise de GC/MS20.
  4. Análise de GC/MS: A análise de GC/MS é realizada usando o procedimento descrito por Tang et al.14. Siga as etapas descritas abaixo.
    1. Injete 3 μL da amostra de retinol derivatizado usando um amostrador automático no GC com um injetor frio na coluna conectado através de um conector de volume morto zero a uma coluna capilar de sílica fundida de 15 m x 0,25 mm de diâmetro interno revestida com uma fase estacionária DB-1 de 0,25 μm de espessura de filme.
    2. Programe as temperaturas do forno de coluna e do injetor na coluna para aumentar de 50 °C para 285 °C a uma taxa de 15 °C/min e defina a temperatura da interface GC/MS para 285 °C. Use hélio como gás transportador para eluir o derivado trimetilsilil do retinol por aproximadamente 12 min.
    3. Detectar o eluído de GC com um espectrômetro de massa quadrupolo usando ionização química de íons negativos de metano de 0,5 torr, com a temperatura da fonte de íons ajustada para 150 °C. Configure o espectrômetro de massa para escanear entre 260 e 280 daltons.

4. Análise dos dados

  1. Use o software de análise de dados GC/MS.
  2. Extraia todos os íons desejados com base em suas proporções massa-carga (m/z), integre a área do pico (use a integração manual para ajustar os pontos inicial e final do pico) e transfira os resultados para um arquivo de planilha.
    NOTA: Dependendo do isótopo utilizado, os íons desejados serão os seguintes: 268-270 m/z para retinol nativo; 271-274 m/z para [2H4]-retinol; 278-280 m/z para [13C]-retinol; e 276-280 m/z para [2H8]-retinol.
  3. Calcule a soma dos picos para retinol marcado (ΣD) adicionando a área do pico em m / z 274, 275, 276, 277 e 278. Calcule a soma dos picos para retinol não marcado (ΣH) adicionando a área do pico em m / z 268, 269 e 270.
  4. Calcule o enriquecimento do retinol marcado (D) usando a seguinte equação: D = ΣD/(ΣH + ΣD). Calcule a quantidade de retinol não marcado (H) usando a seguinte equação: H = 1 - D.
    NOTA: A espectrometria de massa de ionização química negativa de captura de elétrons por cromatografia gasosa do éter trimetilsilílico retinil não fornece nenhum íon molecular, mas um íon fragmento principal em m / z 268 a 271 para retinol não marcado, em m / z 272 a 275 para D4-retinol e em m / z 276 a 280 para D8-retinol14.
  5. Para controlar o sistema, calcule uma equação de regressão linear entre as proporções de peso dos padrões de calibração e as áreas integradas para retinol marcado e retinol não marcado.

5. Estimativa de estoques de vitamina A

NOTA: Esta etapa permite a avaliação do status de vitamina A de um indivíduo.

  1. Calcule os estoques totais de vitamina A no fígado usando a equação de Olson11
    Reservas Totais de Vitamina A no Fígado = F x Dose x [S x a x (H/D - 1)]
    onde F é um fator para a eficiência de absorção e armazenamento da dose administrada por via oral (F = 0,50), Dose é a quantidade de vitamina A marcada administrada por via oral (μmol), S é um fator que corrige a desigualdade do plasma para a proporção hepática de retinol marcado para não marcado (S = 0,65), a é um fator que corrige a perda irreversível de vitamina A marcada durante o período de mistura; especificamente, a = e-kt, onde k é a taxa catabólica fracionária estimada do sistema (k = ln 2/32 dias para crianças) e t é o tempo, expresso em dias desde a dose; D/H é a razão isotópica sérica de retinol marcado para não marcado, -1 corrige a contribuição da dose de vitamina A marcada para o pool total de vitamina A do corpo.
  2. Para calcular os estoques corporais totais de vitamina A (TBS), use a equação de Green13
    TBS = Fa × S × (1/SAp)
    onde Fa é a fração da dose de VA marcada por via oral absorvida e encontrada nos reservatórios de armazenamento trocáveis do corpo no tempo t, e S é a razão entre a atividade específica do retinol no soro e a dos estoques no tempo t (para crianças, Fa × S = 0,642 em 14 dias)21. SAp é a fração da dose no soro por dose de μmol (ou seja, [retinol marcado] / ([não marcado + retinol marcado] no soro) / dose oral de retinol marcado (μmol)).

Resultados

A injeção de 3 μL de uma amostra derivatizada de uma solução seca contendo aproximadamente 50 pM/μL de calibrantes (retinol e D8-retinol) no GC/MS não mostrou nenhum íon molecular, mas exibiu um íon fragmento maior em m/z 268 para retinol (Figura 1) e m/z 278 para D8-retinol (Figura 2). Isso indica que os íons moleculares do éter retinil trimetilsilílico, formados durante a derivatização do retinol e do D 8-retinol, não são estáveis nas condições de ionização usadas no GC/MS. Eles se decompõem em fragmentos menores, principalmente por meio da clivagem alfa. Este padrão de fragmentação comum envolve a quebra da ligação adjacente ao grupo éter trimetilsilílico. A clivagem alfa resulta na perda do grupo trimetilsilil (TMS, que tem massa de 73 Da) e um átomo de hidrogênio, levando a um íon fragmento com massa de 268 Da para retinol e 278 Da para D8-retinol 22. Esse mecanismo ajuda a identificar e confirmar a presença de retinol e seus derivados na amostra, analisando os íons de fragmentos específicos produzidos durante a espectrometria de massa. A injeção de misturas de retinol e D8-retinol mostrou dois íons fragmentos principais em m/z 268 para retinol e m/z 276 para D8-retinol (Figura 3), indicando a presença desses compostos na amostra. A curva de calibração apresentou excelente linearidade, conforme indicado por um alto coeficiente de correlação (Figura 4), mostrando que a relação entre a razão de pico e a razão de peso tem um padrão muito reto e previsível.

A resposta GC/MS obtida a partir das injeções de amostras de soro (soro de crianças que receberam uma dose oral de 2 mg de retinol equivalentes de D8-retinol; Figura 5) mostra a presença de retinol e D8-retinol, com os dois principais íons de fragmentos observados em m/z 268 e m/z 274. Os resultados obtidos após a extração de íons e integração das áreas de pico em m/z 274, 275, 276, 277 e 278 para D8-retinol e em m/z 268, 269 e 270 para retinol não marcado são apresentados na Tabela 5. Esses resultados devem ser integrados à equação de Olson11 ou à equação de Green13 para calcular os estoques de vitamina A no corpo.

A técnica de diluição de isótopos estáveis fornece medições dos níveis de vitamina A que não podem ser obtidas por outros métodos, permitindo avaliações precisas do status de vitamina A. Este método é valioso para estudos nutricionais, diagnósticos clínicos e pesquisas epidemiológicas.

figure-results-1
Figura 1: Cromatograma e espectro de massa do retinol. A figura mostra a cromatografia gasosa / captura de elétrons de metano cromatograma de ionização química negativa-espectrometria de massa (painel superior) a partir da análise do padrão de retinol derivatizado. O painel inferior é um espectro de massa mostrando m / z 268 para retinol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Cromatograma e espectro de massa do D8-retinol. A figura mostra a cromatografia gasosa / captura de elétrons de metano cromatograma de ionização química negativa-espectrometria de massa (painel superior) a partir da análise do padrão D8-retinol derivatizado. O painel inferior é um espectro de massa mostrando m / z 278 para D8-retinol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Cromatograma e espectro de massa de uma mistura de retinol e D8-retinol. A figura mostra a cromatografia gasosa / elétrons de metano capturam cromatograma de ionização química negativa-espectrometria de massa (painel superior) a partir da análise de uma mistura derivatizada de padrões de retinol e D8-retinol. O painel inferior é um espectro de massa mostrando m / z 268 para retinol e m / z 276 para D8-retinol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Curva de calibração. Esta figura ilustra a relação entre a resposta GC/MS e a concentração de retinol não marcado e marcado. É descrito pela equação y = 9,8379x + 0,7019, onde y (as razões de área) representa a resposta do instrumento, 9,8379 é a sensibilidade, x (as razões de peso) representa a concentração do analito e 0,7019 é o sinal de fundo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: Cromatograma e espectro de massa da amostra de soro. Esta figura ilustra a cromatografia gasosa / captura de elétrons de metano cromatograma de ionização química negativa de espectrometria de massa (painel superior) a partir da análise da fração de retinol derivatizada do soro. O painel inferior é um espectro de massa mostrando m / z 274 para D8-retinol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

PadrãoPeso (mg)Balão volumétrico (ml)Solvente
Retinol40100Etanol
Acetato de retinilo40100Etanol
Acetato de retinilo marcado com deutério40100Etanol

Tabela 1: Preparação da solução-mãe. Esta tabela demonstra como preparar soluções concentradas de retinol e acetato de retinila marcado com deutério, que podem ser diluídas em concentrações mais baixas para experimentos futuros.

PadrãoSolução estoque (mL)Balão volumétrico (ml)Solvente
Retinol150Etanol
Acetato de retinilo150Etanol
Acetato de retinilo marcado com deutério150Etanol

Tabela 2: Preparação de soluções de estoque diluídas. Esta tabela demonstra como preparar soluções prontas para uso de retinol e acetato de retinila marcado com deutério.

PadrãoComprimento de onda (nm)E1%1 cm
Retinol3251850
Acetato de retinilo3261550

Tabela 3: Comprimento de onda e E1% 1 cm (coeficiente de absorção).

Tempo (min)Fluxo (mL / min)Móvel Fase A (%)Móvel Fase B (%)
0 – 611000
6 – 131100 → 500 → 50
13 - 1815050
18 - 20150 → 050 → 100
20 - 2810100
28 - 2910 → 100100 → 0

Tabela 4: Cronograma para fases móveis de HPLC. Este quadro ilustra a sequência planeada e a duração das diferentes fases durante a execução cromatográfica por HPLC.

SHSDDH
Assunto 164030809566089.70.0087630.991237
Assunto 219435443861.390.1841250.815875
Assunto 379349080179.280.0917730.908227
Assunto 4200206345286.70.022120.97788
Assunto 580999193355980.70.0043760.995624
Assunto 632196717.7216152.70.0066690.993331
Assunto 740905724.5334818.10.0081190.991881
Assunto 828336711.5218924.10.0076670.992333
Assunto 98695135.55420770.0586840.941316
Assunto 1010326021217177280.0163630.983637
SH: soma da área do pico em m/z 268, 269 e 270
DP: soma da área do pico em m / z 274, 275, 276, 277 e 278
D: enriquecimento de retinol marcado
H: nível de retinol não marcado

Tabela 5: Resultados de GC/MS da fração de retinol derivatizada do soro. Esta tabela relata os resultados de GC/MS necessários para o cálculo do estoque corporal total de vitamina A. H é a soma da área do pico em m/z 268, 269 e 270; D é a soma da área do pico em m/z 274, 275, 276, 277 e 278; D é o enriquecimento do retinol marcado; H é o nível de retinol não marcado; TBS é vitamina A Total Body Store.

Discussão

A implementação bem-sucedida deste protocolo depende da execução efetiva de cada etapa. A preparação adequada de soluções e padrões é crucial para garantir que os dados coletados sejam precisos e confiáveis. Os procedimentos descritos no protocolo foram testados em vários cenários e são adequados para a obtenção de soluções e padrões que atendam aos objetivos da análise da amostra.

A análise das amostras começa com a extração e separação do retinol no soro. O armazenamento de amostras de soro a -80 °C até a análise é essencial para evitar a degradação da vitamina A. Além disso, é necessário trabalhar com pouca luz16. O procedimento de HPLC usado para coletar a fração de retinol é projetado para separar o retinol de outros componentes lipossolúveis para evitar interferência no processo de derivatização. Também permite executar centenas de amostras sem lavar a coluna.

A fração de retinol coletada da HPLC é derivatizada com BSTFA a 70 °C por 30 min. A etapa de derivatização é crítica para melhorar a volatilidade do retinol e sua detectabilidade em GC-MS. Por ser sensível à água, é crucial secar completamente a amostra antes da derivatização e permitir tempo suficiente para que a reação de derivatização ocorra antes da análise por GC-MS. Percebeu-se que o processo de derivatização com BSTFA é muito suave e eficiente em comparação com o que utiliza N-metil-N-(terc-butildimetilsilil) trifluoroacetamida (MTBSTFA)23,24 e fornece um pico muito acentuado para o retinol derivatizado, sem picos de cauda ou fundo na faixa de massaescaneada14. O retinol derivatizado em um frasco selado pode ser mantido em um dessecador a 4 ° C por 1 mês sem degradação14.

Para a análise GC-MS, é fundamental garantir a calibração e manutenção adequadas da coluna e otimizar o volume de injeção, temperatura e vazão. As condições aqui utilizadas com injeção na coluna mostraram resultados bons e confiáveis14. Durante a análise por CG-EM do retinol deuterado e não marcado, Tang et al.14 observaram que os picos de retinol deuterado apareceram tanto na dose administrada quanto no soro dos indivíduos que receberam a dose. Esse padrão não foi observado com retinol não marcado. Portanto, eles concluíram que os picos de retinol deuterado são pré-formados na dose e não resultado da fragmentação no espectrômetro de massa, sugerindo que o retinol deuterado mantém sua estrutura através do processo metabólico, fornecendo um marcador confiável para rastrear o retinol em estudos biológicos. O enriquecimento de retinol deuterado no soro após a administração de 2 mg de D8-retinol em crianças em idade pré-escolar começou a aumentar às 7 h e atingiu seu pico aos 14 dias, que é o menor tempo ideal de amostragem25. Em 200 μL de soro humano, o percentual mínimo detectável de enriquecimento de retinol é de 0,01%, demonstrando que o método é sensível o suficiente para analisar amostras de soro coletadas de indivíduos com uma ampla gama de status de vitamina A14.

Embora a técnica de diluição de isótopos estáveis apresentada aqui ofereça vantagens significativas para avaliar o status da vitamina A, deve-se notar que esse método requer equipamentos sofisticados e conhecimento técnico, tornando-o caro e menos acessível para uso rotineiro em muitos ambientes26. Portanto, é essencial considerar essa limitação ao planejar o uso dessa técnica.

Divulgações

Este manuscrito faz parte de uma série intitulada Utilizando o Método de Diluição de Isótopos de Retinol para Avaliação de Reservas Corporais de Vitamina A e Concentração de Vitamina A no Fígado apoiada pela AIEA.

Agradecimentos

Aprendemos este protocolo durante uma bolsa no Laboratório de Carotenóides e Saúde, Jean Mayer USDA Human Nutrition Research Center on Aging, Tufts University, Boston, EUA, sob a supervisão de Guangwen Tang e com o apoio financeiro da Agência Internacional de Energia Atômica (AIEA).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de cultura descartáveis 13x100 mm99445-13 Tubos de Cultura Descartáveis Sem Aro
16x100 mm Tubos de99445-16PYREX  Tubos de Cultura Descartáveis Sem Aro
24 Posições N-EVAP
Evaporador de Nitrogênio		Organomation Associates, Inc11250N-EVAP 112, Evaporador de Nitrogênio, com sistema de aquecimento OA-SYS
AcetonitrilaSigma-Aldrich00687Acetonitrila, adequado para HPLC, grau gradiente, ≥ 99,9%
Frascos de crimpagem de cor âmbar, 2 mL,SU860033Frasco de amostrador automático de rosca curta, frasco âmbar 11,6 x 32 mm
Balança Analíticade30133525 Mettler ToledoMS303TS/00
coluna C18Perkin-Elmer Inc2580195Brownlee Pecosphere RA C18 Coluna de Cartucho - 33 mm x 4,6 mm I.D., Pkg. Crimpador de 5
tampasMilliporeSigmaZ114243Crimpador de tampa de alumínio operado manualmente OD 20 mm
Coluna capilarJ & W Scientific122-101115 m × 0.25 mm i.d. coluna capilar de sílica fundida revestida com uma fase estacionária DB-1 de espessura de filme de 0.25 mm
CentrífugaSigma 3-18KS
ClorofórmioSigma-Aldrich528730Clorofórmio, grau HPLC, ≥ 99.9%
Frascos Cônicos: 100 mL,4980016Frascos Erlenmeyer Borosil Cônicos Graduados NM Borosilicato
Tampas de crimpagem com vedação de PTFESupelco27455-USelos de crimpagem com septos de PTFE/silicone
Acetato de D8-RetiniloCambridge Isotope Laboratories Inc. DLM-2244-PKAcetato de vitamina A 3-4% cis (10, 14, 19, 19, 19, 20, 20, 20-D8, 90%)
Dispensador para 1-10 mLGilson F110103DISPENSMAN Dispensador de Garrafa de Aquecedor de
Bloco SecoGrantGrant QBH2 Aquecedor de Bloco Seco Digital de Alto Desempenho
EtanolSigma-Aldrich459844Álcool etílico, Puro,  ≥ 99,5%, reagente ACS, 200 prova
GC-MSAgilent Agilent7890 Série A Cromatografia Gasosa com Sistema de Espectrômetro de Massa 5975C equipado com um Sistema Turbo CI 5975C inerte XL EI/CI MSD/DS, um Auto-injetor 7693A Inclui torre de transferência e uma amostra de 7693
Frascos volumétricos com tampa de vidro de bandeja:  2000 mL956854MARCA  BLAUBRAND  balão volumétrico, tampa de vidro, vidro transparente
Frascos volumétricos com tampa de vidro: 100 mL956849MARCA  BLAUBRAND  balão volumétrico, tampa de vidro, vidro transparente
Frascos volumétricos com tampa de vidro: 1000 mL956853MARCA  BLAUBRAND  balão volumétrico, tampa de vidro, vidro transparente
Frascos volumétricos com tampa de vidro: 25 mL956841MARCA  BLAUBRAND  balão volumétrico, tampa de vidro, vidro transparente
Frascos volumétricos com tampa de vidro: 50 mL956847MARCA  BLAUBRAND  balão volumétrico, tampa de vidro, vidro transparente
Frascos volumétricos com tampa de vidro: 500 mL956852MARCA  BLAUBRAND  balão volumétrico, rolha de vidro, vidro transparente
Hélio (pureza mais alta)Air LiquideUN 1046 Hélio comprimido, HPLC Classe 2.2
HPLC VarianVarian 940LC com coletor de frações
Inserções para frascos de crimpagem, 5 mm, 175 μ L,AR0-4521-12Inserção Verex, 5 mm de diâmetro, 175 µ l, fundo cônico transparente, com mola inferior
Cilindros de medição: 100 mL213902402Cilindro de medição DURAN, com base hexagonal, Cilindros
de medição Classe A: 250 mL213903604Cilindro de medição DURAN, com base hexagonal, Metano classe A
(pureza mais alta)Air LiquideUN1971 Metano comprimido, Classe 2.1
MetanolSigma-Aldrich34860Metanol, adequado para HPLC, ≥ 99,9%
N, O-bis(trmetilsilii)trifluoroacetamida (BSTFA) com 10% de Trimetilclorossilano (TMCS) Thermo Scientific043939.22
Nitrogênio Produzido por Parker Balston Gerador NitroVap
Pipetas Pasteur, vidro, 13-678-20AMarca Fisher  Pipetas de Vidro Borosilicato Descartáveis Pasteur
CuvetesEW-83301-12Cole-Parmer Standard Single Quartz Cuvettes
RetinolSigma-Aldrich17772≥ 95,0% (HPLC), ~2700  U/mg
Acetato de retiniloSigma-AldrichR0635grau padrão analítico
Cloreto de sódioSigma-AldrichS9888Cloro de sódio, reagente ACS, ≥ 99.0%
EspectrofotômetroShimadzuUvmini-1240 UV-Vis Espectrofotômetro
TetrahidrofuranoSigma-Aldrich439215Tetrahidrofurano, grau HPLC, ≥ 99.9%,
ultrassônicoBransonicCPX-952-339R
Branson CPX Bransonic Ultrasonic Bath
Pipetas Volumétricas: 100-1000 µ Micropipeta de3123000063Eppendorf com T.I.P.S. Box 2.1
Pipetas Volumétricas: 20-200 µ Micropipeta de3123000055Eppendorf com T.I.P.S. Box 2.0
Misturador de vórticeIkaVortx Genius 3
PYREX  Cultura Descartáveis Balança Precisão de Vidro de Quartzo limpador sem inibidores 1 canal L 1 canal L

Referências

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Reimpressões e permissões

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Soro de RetinolReservas de Vitamina AExtração de RetinolSeparação por HPLCPadrão InternoExtração com Clorofórmio-MetanolIonização por Captura de ElétronsQuantificação de Isótopos de Retinol

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