Técnicas de Patch-Clamp para Análise de Vesícula Endolisossômica Única

Summary

Este protocolo detalha um método para medir diretamente a atividade do canal iônico em vesículas intracelulares usando um sistema manual de patch-clamp endolisossomal. Ilustramos o método que envolve o aumento dos endolisossomos e o isolamento manual dessas vesículas. Essa abordagem garante que os pesquisadores possam replicar e aplicar o procedimento com precisão.

Abstract

Os canais iônicos endolisossômicos são críticos para a homeostase do íon endolisossômico e do pH, regulação do potencial de membrana e tráfego de vesículas. No entanto, o acesso eletrofisiológico a esses canais dentro de pequenas vesículas intracelulares tem sido um desafio. O desenvolvimento de técnicas de patch-clamp endolisossomal tem sido fundamental para superar essa barreira, permitindo a medição direta da atividade do canal iônico nas membranas endolisossômicas.

Em comparação com as técnicas de patch-clamp planar existentes, o patch-clamp endolisossomal pode registrar simultaneamente várias células e combinar facilmente com outros métodos de medição. A operação manual oferece a vantagem de visualizar vesículas alvo. Também aborda a limitação da presença indispensável de Ca²⁺ em um lado da membrana endolisossômica, aumentando a flexibilidade do planejamento experimental. A utilização de técnicas de patch-clamp endolisossômico permite a medição e análise diretas da atividade do canal iônico dentro dos endolisossomos.

Dada a estreita ligação entre a função aberrante do canal iônico endolisossômico e doenças como doenças neurodegenerativas e distúrbios metabólicos, investigar e modular esses canais pode revelar novos alvos de drogas. Ao restaurar o equilíbrio iônico intracelular, podemos aliviar ou curar doenças relacionadas. Portanto, essa técnica é fundamental para descobrir novos alvos de drogas e desenvolver medicamentos relevantes.

Introduction

Os canais iônicos desempenham um papel crucial em vários processos fisiológicos. Embora os canais iônicos de superfície tenham recebido atenção significativa, a importância dos canais intracelulares, particularmente aqueles dentro dos endolisossomos, está sendo gradualmente reconhecida. O sistema endolisossômico é composto por organelas multifuncionais ligadas à membrana, especializadas em funções celulares fundamentais, incluindo endossomos de reciclagem (RE), endossomos iniciais (EE), endosssomos tardios (LE), lisossomos (LY) e organelas híbridas com características endolisossômicas e outras características compartimentais, como fagossomos e autofagossomos.

EE, também conhecidos como endossomos de classificação (SE), são um dos primeiros destinos de materiais internalizados a partir da membrana plasmática (PM). Os EEs são compartimentos críticos responsáveis por classificar a carga em várias vias endocíticas, como a via de maturação para LE/LY para degradação, a via de reciclagem rápida de volta ao PM e a via de reciclagem lenta envolvendo o compartimento de reciclagem ou ER periférico. Os corpos multivesiculares (MVBs) derivados de endossomos são compartimentos esféricos circundados por uma membrana limitante, que pode ser preenchida com vesículas intraluminais (ILVs)¹. Para manter a função normal dessas organelas, elas requerem canais de íons de membrana para regular o pH vesicular, a osmolaridade e a transdução de sinal. No entanto, medir a atividade desses canais não é simples.

Para canais iônicos localizados na membrana plasmática, a técnica patch-clamp desenvolvida na década de 1970 tem sido o método padrão-ouro². No entanto, acessar canais eletrofisiologicamente dentro de pequenas vesículas intracelulares continua sendo um desafio. A aplicação do padrão-ouro para medir os canais iônicos na membrana plasmática às organelas intracelulares enfrenta três desafios principais. Primeiro, o tamanho dos endolisossomos é tipicamente muito pequeno (menos de 1 μm de diâmetro), tornando-os difíceis de observar e isolar ao microscópio e menores do que o diâmetro de abertura das micropipetas de vidro típicas, tornando o experimento inoperante. Em segundo lugar, isolar endolisossomos diretamente das células-alvo, mantendo a integridade das organelas, requer habilidades especiais. Em terceiro lugar, devido à ausência de um citoesqueleto nas organelas intracelulares, formar um selo na membrana endolisossômica dentro da pipeta de adesivo e, em seguida, rompê-la para obter uma configuração endolisossomal total pode ser um desafio, pois compromete a integridade estrutural da organela³.

Vários métodos foram desenvolvidos para superar esses problemas, incluindo registro de bicamada lipídica, modificação de sequências de direcionamento lisossômico e técnicas de eletrofisiologia baseada em membrana com suporte sólido (SSM ou SSME). O método de registro de bicamada lipídica envolve a reconstrução de membranas fosfolipídicas sintéticas com canais iônicos purificados, permitindo o estudo eletrofisiológico detalhado da função da proteína da membrana sob condições controladas ^4,5. A modificação das sequências de direcionamento lisossômico nos canais iônicos envolve o redirecionamento dos canais iônicos endolisossômicos para a membrana plasmática para medição usando métodos convencionais de patch-clamp⁶. As técnicas de eletrofisiologia baseada em membrana com suporte sólido (SSM ou SSME), também conhecidas como método de patch-clamp planar endolisossomal, usam lascas de vidro planar de substrato sólido com pequenas aberturas (<1 μm de diâmetro) em lascas de borossilicato planar microestruturadas. Essas lascas de vidro de pequena abertura permitem a análise de endolisossomos pequenos, até mesmo nativos, usando um sistema de controle de pressão e sucção (Nanion). No entanto, nos dois primeiros métodos, os canais iônicos não estão em seu ambiente fisiológico natural. As tentativas de registrar canais lisossômicos expressos na membrana plasmática ou reconstituídos em bicamadas lipídicas produziram resultados incertos e contraditórios.

Embora as técnicas planares de patch-clamp tenham abordado efetivamente a questão da interferência artificial e ofereçam a vantagem de medições de alto rendimento, as soluções usadas também são limitadas por esse método. A técnica endolisossomal patch-clamp introduzida neste artigo pode registrar simultaneamente várias células e combinar facilmente com outros métodos de medição. A operação manual oferece a vantagem de visualizar as vesículas-alvo. Também supera a inevitável limitação de Ca²⁺ na solução em um lado da membrana endolisossômica, aumentando a liberdade de planejamento experimental³. Recentemente, as técnicas de patch-clamp endolisossomal têm desempenhado um papel fundamental na pesquisa de desenvolvimento de medicamentos. Por exemplo, em doenças neurodegenerativas, essa técnica tem ajudado a identificar novos medicamentos direcionados aos canais iônicos endolisossômicos associados às doenças de Alzheimer e Parkinson ^7,8. Os pesquisadores também podem usar essa técnica para explorar o papel dos canais iônicos endolisossômicos nas células tumorais⁹, controlando assim o crescimento e a proliferação do tumor. Em relação às doenças metabólicas, os estudos com patch-clamp endolisossômico estão revelando compostos que regulam os canais iônicos endolisossômicos, oferecendo novas abordagens de tratamento para diabetes e obesidade. A técnica endolisossomal patch-clamp auxilia na compreensão da disfunção endolisossômica e na descoberta de possíveis terapias⁶, melhorando significativamente nossa compreensão das funções dos canais iônicos endolisossômicos e promovendo a descoberta de novos alvos de drogas.

Protocol

1. Configuração do instrumento

1. Hardware
   NOTA: Consulte a Figura 1 para obter uma configuração padrão do equipamento de eletrofisiologia.
   1. Proteja a configuração contra interferências externas usando uma mesa e uma gaiola de Faraday.
   2. Use um microscópio invertido com um micromanipulador para posicionar o microeletrodo de forma estável.
   3. Configure um amplificador para coletar e amplificar os sinais adquiridos.
   4. Use um digitalizador para converter os sinais analógicos em sinais digitais.
   5. Use software de aquisição e análise de dados para configurar protocolos experimentais e extrair resultados significativos e analisáveis dos dados coletados.
2. Eletrodos
   1. Use dois eletrodos: um eletrodo de banho e um eletrodo de pipeta.
      NOTA: A platina e o cloreto de prata têm as melhores propriedades de polarização. Os eletrodos de cloreto de prata consistem em fio de prata ou pellets que foram cloretados, possuindo assim uma camada de AgCl na superfície externa do fio ou pellet (Figura 2).
3. Preparação de pipetas
   1. Puxando
      1. Instale o tubo capilar no extrator.
         NOTA: Os parâmetros usados para a fabricação de pipetas abaixo são específicos do instrumento. O instrumento que utilizamos neste artigo é mencionado na Tabela de Materiais.
      2. Em condições experimentais (temperatura ambiente de 22 °C, filamento aquecedor em forma de passagem, vidro borossilicato com filamento) que não queimam o filamento do aquecedor, execute um teste RAMP no extrator para determinar o valor calorífico (HEAT) necessário para derreter o capilar de vidro.
      3. Projete um novo programa de tração com seis ciclos de tração separados usando os parâmetros HEAT, velocidade (VEL) e tempo (TIME) (Tabela 1).
         NOTA: HEAT refere-se ao parâmetro que aquece o filamento do aquecedor, permitindo que o filamento de vidro derreta. A velocidade indica a velocidade com que o extrator puxa o filamento em ambas as direções. O tempo representa a duração do intervalo entre cada ciclo.
      4. Pressione o botão verde Puxar no teclado.
      5. Afrouxe o clampbotão e remova as pipetas do extrator.
      6. Inspecione as pontas da pipeta sob a ocular da microforja para determinar o diâmetro, a nitidez e a geometria da ponta. Certifique-se de que o diâmetro da ponta seja de 0,5-0,9 μm.
         NOTA: À medida que o filamento é usado com mais frequência, o valor calorífico necessário para derreter o capilar de vidro mudará.
      7. Se o tamanho da ponta não atender às expectativas, ajuste os parâmetros HEAT e VEL. Temperaturas mais altas e velocidades mais rápidas produzirão pontas mais finas e longas e vice-versa. Ajuste o HEAT em incrementos de 5 graus e a velocidade em incrementos de 3.
   2. Polimento
      1. Coloque as pipetas puxadas no suporte da microforja.
      2. Inspecione as pontas da pipeta usando uma lente objetiva de 35x (combinada com uma ocular de 15x, resultando em ampliação de 525x ).
      3. Use o micromanipulador para aproximar as pipetas de remendo do filamento.
      4. Ajuste o botão de temperatura para 80.
      5. Use o pedal para ligar o aquecedor e aplicar um breve pulso de calor (1 - 2 s), monitorando o processo de polimento através da ocular microforge.
      6. Repita o processo até que todas as pipetas estejam polidas.
      7. Coloque as pipetas completas em uma caixa lacrada para evitar a entrada de poeira.
         NOTA: O objetivo é derreter rapidamente a ponta para que o vidro reforme a geometria final da ponta sem torná-la muito afiada. Isso evita que a pipeta penetre na membrana da vesícula contra a qual é pressionada e promove efetivamente a formação de vedação. Após o polimento final, o caminho interno da ponta da pipeta deve ser muito estreito, reto e linear.
         As melhores pipetas de gravação normalmente têm uma resistência de 5 a 8 MΩ após o polimento a fogo. O diâmetro de abertura da ponta deve ser de 2 μm. Uma pipeta de remendo perfeitamente polida é essencial para a formação bem-sucedida do gigaseal, pois esta é uma das principais técnicas cruciais para o sucesso do procedimento.

2. Preparação da amostra

1. Cultura de células (usando HEK293 como exemplo)
   1. Cultive as células em uma incubadora umidificada padrão a 37 ° C com 5% de CO₂.
   2. Cultive as células HEK293 em DMEM com baixo teor de glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS), 100 U/mL de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina.
   3. Colocar lamínulas de 12 mm revestidas com poli-L-lisina numa placa de 24 poços.
2. Aumento de organelas
   1. Adicione 1 μM de vacuolina-1 às células HEK293 na placa de 24 poços (da etapa 2.1) e incube a 37 ° C com 5% de CO₂ durante a noite até que as vesículas aumentadas comecem a se formar.
      NOTA: O tamanho dos endolisossomos aumentados pode atingir 1-10 μm, dependendo da ferramenta, composto, tempo de incubação e tipo de célula (Figura 3 e Tabela 2).
3. Preparação da solução
   NOTA: A preparação da solução padrão visa simular as concentrações iônicas dentro da célula e organelas. Por exemplo, as soluções padrão para medir canais iônicos em lisossomos são as seguintes:
   1. Prepare a solução do banho (em mM): 140 K-metanossulfonato (MSA), 5 KOH, 4 NaCl, 0,39 CaCl₂, 1 EGTA, 10 HEPES. Ajuste o pH para 7,2 com KOH. Ajuste a osmolaridade para 300 mosm/L com glicose.
   2. Prepare a solução de pipeta (em mM): 140 Na-MSA, 5 K-MSA, 2 Ca-MSA, 1 CaCl₂, 10 HEPES, 10 MES. Ajuste o pH para 4,6 com MSA. Ajuste a osmolaridade para 310 mosm / L com glicose.
      NOTA: Passe a solução por um filtro de 0,2 μm, prepare alíquotas de 45 mL em tubos cônicos de 50 mL e armazene-as a 4 ° C por até 2-4 semanas.

3. Isolamento de organelas

1. Remova uma lamínula com células tratadas (consulte a seção 2) da placa de 24 poços, transfira-a para a câmara do microscópio e adicione 1 mL de solução de banho.
   NOTA: As células não devem ser armazenadas na solução do banho por >1 h para experimentos de patch-clamp endolisossômico completo que envolvem isolamento, selamento e registro do endolisossomo. Após 1 h, os endolisossomos aumentados encolherão, aderirão à pipeta e se tornarão difíceis de isolar.
2. Use uma agulha de enchimento de plástico caseira para encher a pipeta de isolamento com solução de pipeta e instale a pipeta na extremidade frontal da configuração do patch-clamp.
3. Defina o ângulo de movimento diagonal do micromanipulador para estar próximo de 30° (valor padrão de fábrica).
4. Sob o microscópio (objetiva de 40x e ocular de 10x), examine as células em busca de endossomos ou lisossomos suficientemente aumentados localizados perto da borda da membrana celular para isolamento. Mova a pipeta de isolamento para perto da célula selecionada.
5. Abaixe a pipeta de isolamento usando o micromanipulador até que ela toque a borda da membrana plasmática (Figura 4). Mova rapidamente a pipeta de isolamento horizontalmente para arrancar um pequeno pedaço da membrana plasmática.
6. Usando a mesma pipeta, pressione a célula do lado oposto para espremer o endossomo/lisossomos a uma distância de ~ 2 μm da célula.
   NOTA: Se houver membrana celular residual na organela, isso pode impedir a formação de um gigaseal.
7. Examinar o endolisossoma isolado ao microscópio.

4. Formação de Gigaseal

1. Encha uma pipeta recém-polida com a solução de pipeta apropriada e instale a pipeta na extremidade frontal do amplificador.
2. Aplique 20 - 50 mbar de pressão positiva na pipeta (ou use 0,03-0,05 mL de uma seringa de 1 mL para controle de pressão) e mantenha essa pressão (trave a válvula).
   NOTA: 1 mbar (milibar) = 0,001 bar = 0,1 kPa (quilopascal) = 1 hPa (hectopascal) = 1.000 din/cm2.
3. Movendo a ponta da pipeta para a solução do banho, no centro do campo de visão, confirme se a pressão é alta o suficiente para ver o líquido fluindo para a solução do banho.
4. Aplique pulsos de corrente repetidos (+5 mV; 5 ms) para determinar a resistência da pipeta, a resistência da vedação e a resistência em série. Monitore o tamanho da ponta da pipeta, a formação do selo e o estabelecimento da configuração endolisossômica total.
5. Mova rapidamente a pipeta para perto do topo da vesícula alvo. Aproxime a pipeta da vesícula até que a vesícula se mova ou role devido ao fluxo de fluido da pipeta (Figura 5).
6. Ajuste a tensão de deslocamento da pipeta para 0 mV. Libere imediatamente a pressão positiva. Idealmente, a vesícula será puxada em direção à pipeta e conectada à membrana, formando um gigaseal (1-20 GΩ) dentro de 1 s.Procure uma diminuição para <10 pA da amplitude da corrente evocada pelo pulso de tensão de 5 mV, o que indica a formação bem-sucedida do gigaseal.
   NOTA: A pressão positiva estável é essencial para a formação do gigaseal. Às vezes, vazamentos na tubulação podem impedir a formação de gigaseal. Recomenda-se usar um manômetro para garantir que não haja vazamentos. Se for detectado um vazamento, reconecte a tubulação ou aplique uma pequena quantidade de vaselina nas costuras para melhorar a vedação.

5. Medição de corrente

1. Quebra de membrana
   NOTA: Dependendo das necessidades experimentais, o contato eletrodo-membrana pode ser categorizado em quatro modos: modo ligado à célula, modo de célula inteira, modo de dentro para fora e modo de fora para fora (Figura 6).
   1. Para registro de vesículas inteiras, use um pulso curto de alta tensão (pulso ZAP) de 200 μs ou 500 μs para quebrar a membrana no ponto de contato entre a pipeta e a organela. Defina a tensão de -500 mV a -1.200 mV, diminuindo em 100 mV a cada vez até que a membrana seja rompida.
   2. Para o modo de dentro para fora (gravação de canal único), após formar o gigaseal, puxe a pipeta para longe da organela, arrancando um pequeno pedaço da membrana, expondo o lado que estava originalmente voltado para o lúmen da vesícula.
   3. Para o modo de fora para fora, depois de formar o gigaseal e fazer a transição para o modo de vesícula inteira, puxe a pipeta para longe da organela, arrancando um pequeno pedaço da membrana enquanto mantém uma pequena estrutura vesicular.
2. Gravação atual
   1. Registre a corrente através da membrana endolisossômica à medida que a tensão de entrada varia em experimentos de grampo de grampo de tensão endolisossomal.
      1. Controle essas tensões por degraus de tensão ou rampas de tensão; usar uma ampla faixa de tensões de entrada (por exemplo, -100 mV a +100 mV) em experimentos de pinça de tensão endolisossomal.

Results

A seguir, descrevem-se as formas atuais observadas durante os experimentos com patch-clamp endolisossomal. Se a forma atual não for a esperada, pode ser devido a mau contato ou vazamento. Pode ocorrer mau contato se o eletrodo de referência não estiver totalmente em contato com a solução do banho ou se o eletrodo da pipeta estiver prestes a quebrar. O vazamento pode ocorrer se houver um espaço entre a câmara e a lamínula, permitindo que o fluido flua para a lente objetiva ou para a platina; Ter muita ou pouca solução de ...

Discussion

As configurações experimentais eletrofisiológicas têm quatro requisitos laboratoriais principais: i) ambiente: métodos para manter a amostra saudável; ii) óptica: métodos para visualizar a amostra; iii) mecânica: métodos para posicionar o microeletrodo de forma estável; e iv) eletrônica: métodos para amplificar e registrar o sinal.

Para realizar com sucesso experimentos de patch clamp endolisossômico, várias etapas importantes são cruciais. Primeiro, a condiçã...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
INSTRUMENTO SUTTER DE VIDRO BOROSSILICATO		BF150-75-10	O.D.:1,5 mm, I.D. 0,75 mm 10 cm de comprimento, com filamento
Digidata 1140A	Axon Instruments
Microscópio invertido IX73	OLYMPUS
MODELO P-97 extrator de micropipetas	SUTTER INSTRUMENT
MPC-200	SUTTER INSTRUMENT
MultiClamp 700B	Axon Instruments
POLISHER
Câmara de Liberação Rápida	Warner instruments	641943	QR-40LP, para lamínulas de 25 mm