Dispositivo de alongamento equibiaxial para microscopia de fluorescência confocal de células vivas de alta ampliação

Resumo

Aqui, apresentamos um dispositivo de estiramento equibiaaxial versátil que é acionado pneumaticamente e compatível com microscopia de alta resolução.

Resumo

As células são continuamente expostas a forças mecânicas em situações fisiológicas e patológicas, incluindo uma variedade de tensões de tração e compressão. Há pesquisas muito ativas explorando como as células e tecidos respondem e se adaptam a tais estresses e como essas respostas se integram à sinalização mecanoquímica. Isso gerou a necessidade de ferramentas sofisticadas compatíveis com protocolos padrão de cultura celular e métodos de microscopia, reproduzindo estresses fisiológicos em estudos in vitro. Este estudo apresenta o desenho, a função e a caracterização de um dispositivo de alongamento compatível com microscopia óptica e de fluorescência de alta resolução. Numerosos dispositivos de alongamento, pneumáticos ou motorizados, foram desenvolvidos e usados em campo. Apresentamos um desses sistemas em detalhes, incluindo diretrizes de design, uma variedade de aplicações e todas as ferramentas para fabricar uma configuração semelhante. O sistema é baseado em uma membrana deformável de polidimetilsiloxano (PDMS), esticada equibiaxialmente após aplicação a vácuo, tornando uma cepa de amostra homogênea, reprodutível e controlada. Ele fornece uma variedade de tensões de tração, desde alongamento pontual e imediato até ciclos repetidos de liberação de estiramento de amplitude e frequência controladas. O revestimento do substrato com proteínas de adesão permite semear células com repórteres fluorescentes no dispositivo de alongamento e realizar imagens ao vivo dessas células após o estiramento usando microscópios de fluorescência de alta ampliação. As tensões compressivas também podem ser aplicadas permitindo que a amostra se adapte ao estiramento e, posteriormente, liberando-a ou semeando a amostra em um substrato pré-estirado antes da liberação do estiramento. A padronização topográfica adicional do substrato PDMS permite a aquisição de imagens da mesma amostra em diferentes modos de microscopia (como fluorescência e microscopia eletrônica). Os géis de poliacrilamida também podem ser fixados à membrana PDMS, resultando no estiramento das células semeadas em substratos de diferentes rigidezes. No geral, ao aplicar tensões de tração controladas em amostras vivas, este dispositivo de alongamento, juntamente com microscopia de fluorescência de alta qualidade, pode abordar uma grande variedade de questões em mecanobiologia.

Introdução

As membranas finas de polidimetilsiloxano deformável (PDMS) são amplamente utilizadas em uma variedade de dispositivos de alongamento feitos sob medida ^1,2,3, pois o PDMS é um material inerte biocompatível bem estabelecido compatível com imagens de microscopia. Aqui, como muitos outros 4,5,6,7,8,9, o conceito simples de aplicar um vácuo é usado para deformar a membrana para montar um dispositivo de alongamento equibiax robusto e controlável. Ao prender a membrana dentro de um anel circular e selar o anel no topo de um "poste de alongamento" (Figura 1A-C), uma deformação uniforme e isotrópica é alcançada. A amostra biológica está localizada no centro do anel na membrana PDMS independente, que permite a aquisição de imagens usando microscopia de fluorescência. Aqui, são apresentadas duas configurações personalizadas, compatíveis com dois modelos de estágio de microscópio (Figura 1D-F) e altamente versáteis em termos de aplicações biológicas. Embora o design geral seja simples e transponível para outros estágios, as dimensões da configuração devem ser cuidadosamente escolhidas para atender aos requisitos de imagem. Uma vez alcançado, o perfil de deformação do dispositivo deve ser caracterizado e validado.

Além da configuração em si, é apresentado um método simples acompanhado por um código Matlab para caracterizar a magnitude, homogeneidade e isotropia da cepa. O dispositivo de estiramento pode ser usado posteriormente para aplicar tensões de tração equibiaxiais a sistemas sintéticos¹⁰, células individuais^11,12 ou monocamadas¹³, enquanto registra com alta resolução espaço-temporal a resposta biológica da amostra usando microscopia de fluorescência. A membrana pode ser revestida com diferentes proteínas de adesão da matriz extracelular^14,15. Recursos extras podem ser adicionados de acordo com as necessidades do estudo biológico. Por exemplo, géis de poliacrilamida podem ser ligados à membrana PDMS para ajustar a rigidez do substrato durante o alongamento^13,16, e as membranas PDMS podem ser fabricadas com uma grade numerada de referência para imagens posteriores da mesma região de interesse dentro de uma amostra¹². Amostras fixas esticadas também podem ser processadas por imunocoloração e posteriormente reesticadas para imagens de fluorescência¹⁷. O padrão de estiramento aplicado pode ser controlado, variando de um único pulso de estiramento imediato a deformações cíclicas de magnitudes, frequências ou formas variadas^14,16.

Protocolo

1. Projetando a platina e o poste de alongamento (Figura 1)

1. Projete um poste de alongamento compatível em dimensão com o tamanho / suportes do palco e a configuração da objetiva. Os dois postes de alongamento específicos são exibidos na Figura 1A,D.
   NOTA: Os arquivos FreeCAD fornecidos neste protocolo (Pasta Suplementar 1) são compatíveis com os seguintes microscópios e estágios da Nikon: Eclipse Ni-E vertical equipado com um estágio NI-SH-E e Eclipse Ti-E/B invertido equipado com um estágio TI-S-ER, Figura 1D. O poste pode ser impresso tridimensionalmente (3D), mas pode deformar após uso repetido; Postes à base de alumínio não sofrerão com essa desvantagem. Certifique-se de anodizar postes à base de alumínio para evitar a oxidação. A configuração vertical permite uma maior amplitude de movimento. Além disso, uma configuração vertical fornece imagens diretas da amostra sem interface, o que é opticamente favorável no caso do substrato de membrana PDMS deformável. Em vez disso, em uma configuração invertida, o feixe de iluminação passa pela membrana PDMS (Figura 1F); uma vez que, após a aplicação do estiramento, a membrana PDMS se moverá, o meio de imersão para a objetiva deve ser cuidadosamente escolhido (tipos recomendados de imersão em água, ar ou glicerol; a imersão em óleo não é recomendada devido à incompatibilidade com substratos PDMS). Os suportes comerciais podem ser modificados usando furos de parafuso extras; cuidado ao usar plástico ou parafuso à base de Teflon para evitar poeira durante o aparafusamento. Pode ser conveniente projetar um suporte que permita que o poste de alongamento seja encaixado no topo da platina, conforme exibido na Figura 1E. O arquivo FreeCAD fornecido neste protocolo é compatível com o estágio de um microscópio vertical Eclipse Ni-E.
2. Projete anéis elásticos (Figura 1C) compatíveis em tamanho com o poste de alongamento (Figura 1A, B). Os arquivos FreeCAD fornecidos neste protocolo são compatíveis com os postes correspondentes (para cobrir os anéis durante o manuseio de amostras, seu diâmetro pode ser escolhido para ser compatível com o tamanho de uma placa de Petri).
   NOTA: O anel também pode ser à base de alumínio (anodizado) ou impresso em 3D. Inclua juntas de diâmetros adequados para vedar a vácuo o poste de alongamento e os anéis.
3. Opcional: Fabrique um controlador de vácuo. Um mapa elétrico da caixa de controle de vácuo usada neste protocolo é fornecido em informações suplementares (consulte a Pasta Suplementar 2). Permite o controle manual do nível de vácuo aplicado ao dispositivo de alongamento.
   NOTA: Os controladores de vácuo comerciais também podem fornecer funções semelhantes e geralmente podem ser acompanhados por software de controle que permite a aplicação de uma variedade de tipos de sinal (senoidal, triangular, etc.) (Fluigent, cobalto).

2. Fabricação da membrana elástica

1. Projete placas circulares (material recomendado: polimetacrilato, PMMA). Certifique-se de que essas placas sejam mais largas que os anéis e compatíveis em tamanho com o revestidor giratório (Figura 2A). Consulte a Tabela 1 para dimensões sugeridas e a Pasta Suplementar 3.
   NOTA: Para o pino 1, foi utilizado um diâmetro de 12 cm; para o poste 2, um diâmetro de 18-21 cm. Antes e entre cada uso, as placas devem ser cuidadosamente limpas com lenços não tecidos e etanol a 96%. É importante evitar o acúmulo de PDMS nas placas, bem como nas bordas e embaixo.
2. Prepare PDMS 1:10 e misture bem para obter uma emulsão bem homogênea (use colheres de agitação recomendadas).
   NOTA: Para 12 cm, prepare 4,5 g por prato; para placas de 18 cm, 8 g por placa. Para a preparação de várias placas, prepare PDMS extra, por exemplo, 10 mL a mais do que o necessário para 10 placas. Para 10 placas de 12 cm, prepare 50 g do componente A e 5 g do componente B. É útil usar recipientes grandes para pipetar facilmente. O recipiente não deve conter poeira ou qualquer outra sujeira que possa impedir a fiação e cura adequadas do PDMS. Use luvas de material compatível (evite látex; luvas de vinil são apropriadas) para garantir a cura do PDMS.
3. Desgaseifique por no mínimo 1 h usando uma câmara de vácuo.
   NOTA: Alternativamente, o PDMS pode ser centrifugado a 0,2 × g por 5 min usando um tubo de 50 mL, mas cuidado que é complicado aspirar a mistura PDMS de um tubo com a seringa dispensadora (necessário para a etapa 2.4). Não desgaseifique por muito tempo (não mais do que 2 h) com luz direta para evitar a pré-cura do PDMS.
4. Revestimento giratório PDMS na parte superior das placas de PMMA
   1. Dispense 4,2 mL ou 7,5 mL de PDMS desgaseificado em cima das placas de PMMA.
   2. Gire as placas usando as seguintes configurações recomendadas:
      1. Spin coat por 5 s a 500 rpm com uma aceleração de 100 rpm/s.
      2. Spin coat por 1 min a 500 rpm com uma aceleração de 300 rpm/s.
         NOTA: Pode ser conveniente marcar o centro da placa de PMMA em seu lado inferior para garantir a centralização das placas durante a fiação e a fiação homogênea. O passo 2.4.2.1 não é obrigatório, especialmente se o parâmetro de aceleração não puder ser ajustado; ajuda a espalhar o PDMS antes de girar. Este protocolo produz membranas PDMS com uma espessura de cerca de 140 μm (medida com interferometria; ver Figura Suplementar 1 e Tabela 2). As calibrações devem ser realizadas antes dos experimentos, caso o modelo ou os parâmetros do revestidor por rotação levem a diferentes características da membrana.
5. Armazene cada placa em uma placa de Petri para evitar o acúmulo de poeira e polimerize durante a noite a 65 °C dentro do forno.
   NOTA: Cuidado ao usar pratos resistentes à temperatura. A condição de cura afetará a deformabilidade do PDMS para um determinado nível de vácuo aplicado.

3. Sanduíche de membrana em anéis

1. Design do material de montagem.
   1. Projete anéis de PMMA de diâmetro interno / externo para colocar a membrana circular PDMS revestida por rotação (Figura 2A). Veja as dimensões propostas na Tabela 1 e na Pasta Suplementar 3.
   2. Projete um suporte de montagem (Figura 2B) no topo do qual o anel se encaixará, e a altura também determinará o pré-alongamento ao montar a membrana no anel.
      NOTA: O suporte de montagem pode ser uma solução simples baseada em material de laboratório existente (por exemplo, uma placa de Petri). Uma solução mais elegante é imprimir o suporte em 3D (consulte o arquivo FreeCAD desta peça fornecido neste protocolo, consulte a Pasta Suplementar 3), pois a altura pode ser definida pelo usuário e facilmente variada (uma altura de 10 mm foi usada neste protocolo para os pequenos anéis). A altura da parte central do suporte deve ser escolhida menor que a altura do meio anel para que o substrato PDMS não toque no suporte durante a montagem (consulte o uso adicional na etapa 3.4.2). Uma impressora 3D usando filamentos de ácido polilático (PLA) (consulte a Tabela de Materiais) é adequada para isso. Um anel de corte também pode ser projetado, impresso em 3D, para servir como guia para o bisturi (Figura 2A).
   3. Projete e fabrique pesos de latão compatíveis em tamanho para exercer peso no anel durante a montagem da membrana (Figura 2C) e levar a uma pré-tensão reprodutível.
      NOTA: Os arquivos FreeCAD fornecidos aqui (consulte a Pasta Suplementar 3) correspondem às dimensões do anel apresentadas neste protocolo.
2. Remova a membrana PDMS da placa de PMMA.
   1. Prepare anéis de PMMA em cima de uma folha de papel de bancada branco.
      NOTA: É importante que a bancada e o papel permaneçam planos para evitar que o papel toque na membrana PDMS durante a montagem.
   2. Passe cuidadosamente ao redor da borda da placa com uma lâmina (uma ou duas vezes) e, em seguida, trace a mesma borda com uma pinça afiada para garantir que o PDMS tenha um corte limpo ao longo de toda a sua circunferência (Figura 2A).
   3. Use uma pinça para levantar cuidadosamente a membrana em uma borda. Em seguida, descasque suavemente a borda da folha PDMS com os polegares para levantar a membrana uniformemente na borda. Separe a borda da membrana da placa ao longo da metade da circunferência da placa (Figura 2A).
      NOTA: Derramar algumas gotas de etanol a 96% abaixo da membrana PDMS ajudará a levantar a membrana sem quebrá-la.
3. Seque a membrana PDMS.
   1. Limpe o etanol a 96% ao redor de toda a superfície superior do anel de PMMA previamente preparado (etapa 3.2.1), usando os dedos para espalhá-lo uniformemente.
   2. Remova cuidadosamente a membrana PDMS, levantando-a da borda levantada anteriormente (explicada na etapa 3.2.3), e coloque-a simetricamente no anel de PMMA coberto de etanol. Remova quaisquer rugas do PDMS, mas certifique-se de não esticar a membrana; apenas endireite-o.
      NOTA: A aplicação de pré-estiramento neste stage afetará a deformabilidade do PDMS para um determinado nível de vácuo aplicado.
   3. Quando o etanol estiver completamente seco, certifique-se de que a membrana PDMS esteja firmemente presa ao anel de PMMA.
4. Monte o anel elástico.
   1. Pegue outro anel de PMMA vazio. Coloque-o em cima do anel de montagem e use clipes de metal para selá-los, colocando a membrana PDMS entre os dois anéis (sanduíche de membrana PDMS, Figura 2B).
   2. Coloque a metade inferior do anel elástico no suporte de montagem projetado na etapa 3.1.2 (Figura 2B).
   3. Coloque o sanduíche de anel PDMS no anel elástico e empurre-o para baixo com firmeza até que ele atinja totalmente para baixo. O substrato PDMS não toca no suporte de montagem. Fixe a junta na posição correta (Figura 2B).
   4. Coloque os pesos circulares de latão em cima da amostra (Figura 2C). Isso aplica uma pré-tensão fixa semelhante à de todos os anéis montados, garantindo maior reprodutibilidade ao calibrar o sistema.
   5. Coloque a metade superior do anel elástico de metal na parte superior, com os orifícios dos parafusos alinhados, coloque todos os parafusos e aperte (Figura 2C).
      NOTA: Nesta fase, a membrana PDMS tem orifícios, portanto, não tente desmontar ou retroceder no protocolo.
   6. Corte o PDMS ao redor do anel suavemente com uma lâmina (Figura 2C).
   7. Cubra (por exemplo, com uma placa de Petri) para proteger a membrana da poeira (Figura 2C).
      NOTA: Se o PDMS precisar ser funcionalizado com um gel de poliacrilamida, prossiga para a seção 5. Para medições iniciais de calibração, prossiga para a seção 6. Se o anel PDMS for usado para semeadura de células, prossiga para a seção 7.

4. Variação da fabricação de membranas PDMS: padronizar uma grade de referência

1. Prepare uma placa de PMMA (antes do revestimento por rotação PDMS) "padronizada" com uma grade baseada em SU8 criada usando fotolitografia (Figura 2D). Para isso, desenhe um padrão de interesse para criar um filme de fotomáscara (máscara de acetato).
   NOTA: O arquivo pdf fornecido neste protocolo (consulte a Pasta Suplementar 4) cria uma grade com números alternativos; veja a Figura 2D. A grade pode ser criada usando um software simples como o Inkscape, dado o tamanho do padrão (ou alternativas como Clewin ou FreeCAD). O design pode ser impresso por empresas externas em filmes fotográficos (ver Tabela de Materiais).
2. Protocolo de fotolitografia na placa de PMMA (consulte a Pasta Suplementar 3 para propriedades ópticas de PMMA).
   1. Realize um tratamento com plasma de oxigênio das placas de PMMA por 20 min a 7 W com um fluxo constante de oxigênio de 0,8 bar.
      NOTA: Certifique-se de que a possível proteção plástica das placas seja removida e que as placas de PMMA sejam completamente transparentes.
   2. Asse por 5 min a 95 °C.
   3. Resfrie a placa de PMMA usando uma pistola de nitrogênio e, em seguida, coloque 4 mL de resina SU-8 2100 na placa de PMMA de 12 cm (ajuste o volume se estiver usando tamanhos de placa diferentes).
   4. Centrifugar com os seguintes parâmetros (ou ajustar os parâmetros de centrifugação para criar uma camada de aproximadamente 10 μm de altura): 5 s a 500 rpm com uma aceleração de 100 rpm/s, seguidos de 30 s a 4000 rpm com uma aceleração de 300 rpm/s.
   5. Asse por 2,5 min a 95 °C.
   6. Coloque a placa de PMMA em um alinhador de máscara na presença da máscara de acetato e use os seguintes parâmetros: sem i-line. Exposição em banda larga (entre 260 e 460 nm), 25 mW/^cm2, exposição de 7,5 s.
   7. Asse por 3,5 min a 95 °C.
   8. Desenvolva o padrão por 1 min com acetato de éter monometílico de propilenoglicol.
   9. Lave extensivamente com isopropanol.
   10. Realize a verificação visual da qualidade do padrão usando uma objetiva de baixa ampliação (2-10x) em um microscópio de campo claro.
       NOTA: A silanização da placa padronizada de PMMA aumenta a longevidade do padrão para uso repetido. Para isso, ative a placa de PMMA padronizada por 30 s com tratamento com plasma de oxigênio e, em seguida, execute um tratamento de 1 h com Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano sob vácuo em uma capa química.
3. Use a placa de PMMA padronizada como nas etapas 2.2 a 2.5 para revestir a membrana elástica PDMS.
   NOTA: O PDMS padronizado pode ser visualizado em um microscópio de campo claro, conforme mencionado anteriormente, bem como em um microscópio eletrônico de varredura (Figura 2D). Cuidado com o lado do padrão voltado para cima ao montar a membrana PDMS no anel elástico para obter o padrão na orientação desejada.

5. Anexar um gel de poliacrilamida (PAA) no topo da membrana PDMS

NOTA: Esta etapa pode ser executada na membrana PDMS conectada à placa de PMMA (consulte a seção 2) ou nos anéis elásticos montados anteriormente (consulte a seção 3). Trabalhe sob uma capa química; para as etapas que envolvem aquecimento, é conveniente usar um pequeno encaixe de forno sob a coifa química, consulte a Tabela de Materiais; caso contrário, mantenha as amostras em uma caixa hermética no forno).

1. Pré-revestimento de membrana PDMS (Figura 2E)
   1. Prepare a solução de revestimento misturando etanol a 96% com 10% de (3-aminopropil)trietoxissilano (APTES) em um tubo de microcentrífuga (por exemplo, 20 μL de APTES em 180 μL de etanol).
   2. Ative as membranas PDMS com um descarregador de plasma corona por 1 min (ou ative por 30 s usando um limpador de plasma de oxigênio).
   3. Coloque 200 μL da solução APTES/etanol no centro da membrana.
   4. Deixe a membrana a 65 °C dentro do forno por 1 h.
   5. Lave duas vezes com PBS. Para a segunda lavagem, deixe o PBS por 10 min enquanto agita.
   6. Prepare a solução de glutaraldeído (GA) a 3% em PBS. Coloque 200 μL de GA por membrana na mesma região da membrana tratada com APTES.
   7. Aguarde 25 min (não mais do que 30 min).
   8. Lave duas vezes com PBS, a segunda vez agitando.
   9. Aspire o líquido e coloque o anel em uma posição declinada, até que o PBS esteja totalmente seco.
2. Silanização de lamínula
   1. Prepare 6 mL de Repel Sillane e despeje em uma placa de Petri.
   2. Coloque as lamínulas de vidro quadradas de 18 mm com cuidado, uma a uma, no líquido.
   3. Incube as lamínulas por 5 min.
   4. Prepare dois copos; um contendo 96% de etanol e o outro de água ultrapura.
   5. Remova a lamínula do Repel Silano com uma pinça e lave primeiro com etanol a 96%, seguido de uma lavagem em água ultrapura (a lamínula deve sair "seca" da lavagem com água).
   6. Deixe secar por mais 30 minutos na borda de uma placa de Petri.
3. Fixação do gel de poliacrilamida (PAA) à membrana PDMS
   1. Disponha metade das lamínulas tratadas com Repel Silano no fundo de uma placa de Petri.
   2. Prepare uma mistura de gel de PAA com a rigidez desejada ^16,18.
   3. Coloque uma gota de 10 μL de mistura de gel em cima de cada lamínula.
   4. Coloque outra lamínula tratada com Repel Sillane por cima para espalhar o gel. Não alinhe as duas lamínulas. Certifique-se de que eles estejam dispostos em forma de estrela para facilitar a separação. Pressione suavemente para que o gel fique achatado, mas não exceda a área da lamínula.
   5. Aguarde de 45 min a 1 h.
   6. Separe as lamínulas suavemente usando uma pinça. Certifique-se de que o gel permaneça preso a uma das lamínulas.
   7. Pegue a lamínula na qual o gel está fixado e coloque o gel em contato com a área do PDMS previamente tratada com GA (Figura 2E).
   8. Pressione com dois dedos de baixo para cima por 5 s.
   9. Incubar a 37 °C durante a noite.
   10. No dia seguinte, encha o anel com PBS por 30 min.
   11. Solte cuidadosamente a lamínula superior com uma pinça.
   12. Desenhe o perímetro do gel PAA com um marcador permanente do outro lado da membrana PDMS. Isso ajuda a localizar a amostra nas etapas a seguir.
   13. Aspire o PBS.
   14. Execute uma etapa de funcionalização para facilitar a ligação da proteína da matriz extracelular desejada ao gel¹⁵.

6. Operação do dispositivo de alongamento, calibração de tensão e avaliação de resolução

1. Prepare um anel elástico PDMS com esferas fluorescentes para calibração de tensão.
   1. Preparar uma diluição a 1:50000 de 0,1 μm ou 0,2 μm de grânulo fluorescente (ver Tabela de Materiais) em solução salina tampão fosfato (PBS) por diluição em série (solução intermédia 1:500 de 1 ml em PBS com 2 μl da solução stock de grânulos seguida de diluição final de 10 μL da solução intermédia em 1 ml de PBS).
      NOTA: Uma alta densidade de esferas na membrana é ideal para a etapa de calibração; Não sonice a solução, pois aglomerados de esferas ajudam na operação durante a calibração.
   2. Coloque uma gota de 10-30 μL no centro do PDMS.
      NOTA: O suporte de montagem pode ser convenientemente projetado com uma deposição de amostra cruzada para o centro
   3. Deixe secar a não mais de 40 °C para evitar problemas de confusão pós-cura.
2. Prepare um anel elástico PDMS com esferas fluorescentes para avaliação da resolução.
   1. Siga o protocolo de Cole e ^al.19 para preparar a solução de grânulos usando grânulos com diâmetros menores que o limite de difração, normalmente grânulos de 0,1 μm de diâmetro.
      (ver Tabela de Materiais). Sonicar cuidadosamente as soluções de esferas em cada passo intermédio.
   2. Use o tratamento corona no centro do anel para ativar o substrato PDMS.
   3. Espalhe imediatamente 20 μL da solução de esferas sobre a área central do PDMS tratada e deixe secar.
      NOTA: Neste caso, a solução de esferas é altamente diluída e incubada no PDMS hidrofílico para garantir um espalhamento extensivo e obter esferas separadas de 0,1 μm adsorvidas no substrato.
3. Montagem do dispositivo de alongamento no suporte da platina do microscópio (Figura 1F).
   1. Monte o poste de alongamento no microscópio.
   2. Aplique generosamente lubrificante (vaselina) em cima da área circular do poste (parte do meio, Figura 1D, F).
      NOTA: O uso do lubrificante é obrigatório para que o substrato PDMS supere os atritos e deslize no poste, sendo necessário refrescar o lubrificante entre cada amostra. A vaselina é usada como um lubrificante muito conveniente na configuração apresentada neste protocolo.
   3. Monte o anel de estiramento preparado na etapa 6.1 no poste de alongamento e aparafuse a tampa superior para vedar o conjunto.
   4. Conecte o controlador de vácuo à fonte de vácuo e ao poste de alongamento (Figura 3A).
      1. Conecte a parte traseira da caixa de controle de vácuo à fonte de vácuo (Figura 3A).
      2. Conecte a frente da caixa ao poste de estiramento (Figura 1B, D, F).
         NOTA: A fonte de vácuo pode ser a linha de vácuo disponível na infraestrutura do edifício. Um vácuo moderado é necessário para um alongamento suficiente, mas depende do diâmetro do anel de estiramento (uma tensão menor será obtida no mesmo nível de vácuo para um diâmetro menor). Alternativamente, as bombas de vácuo estão disponíveis comercialmente (Fluigent ou Elveflow fornecem bombas de vácuo autônomas); Neste caso, siga as instruções do fabricante para conexão à fonte de vácuo. Não use um suprimento de vácuo sem uma fonte controlada por vácuo (como a caixa de controle de vácuo feita sob medida apresentada neste protocolo ou os sistemas disponíveis comercialmente)
4. Calibração de deformação
   1. Escolha um campo de interesse que inclua uma alta densidade de esferas em todo o campo de visão e aglomerados de contas reconhecíveis para o usuário (consulte a Figura 3B).
   2. Adquira uma imagem "em repouso" do campo de visão escolhido (salve a posição).
   3. Aplique esticar em um nível de baixo vácuo (nesta configuração, -20 mbar). A amostra se moverá em todas as direções (X-Y-Z).
   4. Refoque primeiro no plano z.
   5. Mova o palco nas direções x-y para encontrar a mesma região de interesse fotografada em repouso, focalize a imagem das contas no estado esticado e adquira uma imagem.
      NOTA: Se a amostra estiver muito descentralizada, a região de interesse se moverá significativamente, dependendo da magnitude da deformação. O deslocamento será maior longe do centro, mas a magnitude da deformação é independente da localização da amostra no substrato. Grave imagens sem binning, com resolução de 2048x2048.
   6. Libere a tensão. Repita as etapas 6.4.3-6.4.5 com um nível de vácuo mais alto (-30 mbar, -40 mbar, etc.).
      NOTA: Para fins de calibração, sempre retorne ao estado de repouso antes de esticar novamente (consulte a Figura Suplementar 3A), pois o PDMS tem um comportamento de histerese após a deformação.
   7. Monte um segundo anel elástico e repita as etapas 6.4.1-6.4.6. Execute esta calibração para pelo menos 3 anéis elásticos diferentes.
   8. Armazene as imagens adquiridas em uma pasta organizada por amostra.
   9. Em cada pasta, nomeie a imagem do cordão de referência adquirida no reference_str1 de repouso e as imagens esticadas em stretched_str1 de vácuo crescente, stretched_str2, stretched_str3, etc.
      NOTA: Esta etapa constitui a calibração principal do sistema. Dependendo das necessidades do usuário, calibração adicional usando amostras de esferas semelhantes, mas usando outros protocolos de aplicação de vácuo, deve ser realizada. Aplique um protocolo de cepa semelhante à cepa aplicada à amostra biológica (consulte a seção de resultados representativos).
5. Use o código Matlab para quantificar a cepa²⁰.
   1. Baixe toda a pasta Matlab no seguinte link https://github.com/xt-prc-lab/Le_Roux_et_al_2024_JOVE
      NOTA: O código principal a ser executado é nomeado gel_strain e chama outros arquivos de código Matlab que devem ser mantidos conforme fornecidos, armazenados na mesma pasta que o código principal.
   2. Abra o Matlab e abra o código gel_strain.
   3. Defina os parâmetros (consulte a Tabela 3, Code_Parameter para configurações recomendadas).
   4. Defina os caminhos da pasta pai e experimento, conforme indicado no código.
      NOTA: Se a pasta não existir, o código mostrará um pop-up de aviso; Selecione Adicionar ao caminho e navegue até a pasta experimental onde as imagens são armazenadas.
   5. Execute o código gel_strain .
   6. Abra stretched_str1 conforme solicitado pelo código.
   7. Abra reference_str1 conforme solicitado pelo código.
      NOTA: É conveniente processar todas as imagens esticadas em diferentes níveis de vácuo de uma só vez, conforme indicado neste protocolo; Todos os arquivos devem ser armazenados na mesma pasta experimental, mas o código solicita apenas a abertura da primeira imagem esticada. Os nomes das imagens devem terminar com nomes strX, sendo X os números incrementais 1, 2, 3, etc., conforme indicado no ponto 6.4.9 deste capítulo.
   8. Verifique se a pasta de resultados aparece com as 4 subpastas: Croppeddata contendo os dados cortados e alinhados; Deslocamentos contendo o arquivo de deslocamento do cordão; Imagens contendo o gráfico dos deslocamentos radiais e deformação; Deformações contendo a planilha da matriz de deformação obtida para cada nível de vácuo.
      1. Calcule a mediana da matriz de deformação para cada nível de vácuo.
      2. Repita para cada amostra (mínimo de 3).
      3. Plote a matriz de deformação mediana versus o nível de vácuo para as 3 amostras para obter a curva de calibração (Figura 3C).
         NOTA: Alguns parâmetros podem ser modificados caso a imagem do cordão não seja processada corretamente a partir do código. Para fazer isso, abra o set_settings_stretch de arquivos no Matlab e modifique Settings.Resolution e Settings.Overlap de acordo com as recomendações nos comentários do código (consulte também a Tabela 3). Dependendo das necessidades experimentais, a cepa aplicada à amostra biológica pode ser variada (cepa cíclica, cepa maior, etc.): recomenda-se uma calibração dessas condições (veja exemplos na Figura Suplementar 2 e na Figura Suplementar 3).
6. Avaliação da resolução (seguir o protocolo de Cole et ^al.19)
   1. Monte o anel elástico preparado na etapa 6.2.
   2. Crie uma imagem de um campo de visão contendo pontos de contas únicos (imagine uma pilha com distância de passo Z relevante para a objetiva usada).
   3. Use o MetroloJ (plug-in Fiji), conforme indicado em Cole et al., para caracterizar a resolução XYZ da configuração de alongamento (Figura 3D e Figura Suplementar 4).

7. Semeadura e alongamento celular

1. Revestimento do PDMS com proteína de adesão celular
   1. Esterilize o anel PDMS expondo-o à luz ultravioleta por 15 min (Figura 4A). Execute todas as etapas subsequentes do protocolo sob o biohood para garantir a esterilidade.
   2. Enxágue o prato sob o capô com PBS estéril.
   3. Incubar uma proteína de adesão celular 11,14,15 depositando uma gota de 100-200 μL da solução no centro do anel (Figura 4A).
      NOTA: Comumente, uma solução de 10 μg/mL de fibronectina é apropriada¹¹. Outras proteínas de adesão de interesse podem ser usadas para revestir a PDMS (por exemplo, laminina, queratina¹⁵; tratamentos/protocolos específicos podem ser necessários). A incubação para revestimento de fibronectina é recomendada durante a noite a 4 °C; o método alternativo é de 1 h a 37 °C.
   4. Desenhe o perímetro da gota com um marcador permanente na parte inferior da membrana PDMS. Isso ajuda a localizar a amostra nas etapas a seguir.
2. Semeadura celular no anel PDMS (Figura 4A).
   1. Se necessário, transfecte as células de interesse com uma proteína fluorescente antes do experimento de alongamento (para transfecções transitórias, 1-3 dias antes do experimento, dependendo do método de transfecção e características) ou use protocolos específicos para visualizar os marcadores fluorescentes de interesse.
      NOTA: Para experimentos iniciais, é conveniente usar um marcador de membrana plasmática, como GFP-mem^11,12, para visualizar a resposta da membrana celular e possíveis rupturas. O marcador é fácil de transfectar e é aconselhável esticar as células transfectadas em níveis crescentes de deformação para avaliar o limiar de deformação que levará à ruptura da membrana plasmática. Veja o mapa de plasmídeo na Pasta Suplementar 5. Isso depende do tipo de célula e será menor em experimentos de célula única em comparação com monocamadas de células. Este marcador de membrana é compatível com o estiramento celular, ao contrário de alguns corantes de inserção de membrana que foram observados para levar à ruptura da membrana plasmática em baixos níveis de estiramento.
   2. No dia do experimento, aqueça o meio celular e prepare o meio independente de CO₂.
      NOTA: Se o microscópio tiver controle de CO₂ compatível com o sistema de estiramento, os experimentos podem ser realizados em meios de cultura de células regulares (esta seria uma configuração necessária para amostras delicadas que não podem sobreviver em meios independentes de CO₂). Recomenda-se a suplementação independente de CO₂ com um agente antibranqueador (por exemplo, para proteínas GFP, suplemento de rutina²¹ a 10 mg/mL).
   3. Tripsinize as células e conte-as.
   4. Semeie um número apropriado de células em um pequeno volume (20-50 μL) com meio celular padrão para promover a fixação celular e mantenha em uma incubadora com CO₂ com umidade controlada.
      NOTA: Para fibroblastos planos e grandes e experimentos de célula única, 5000 células; Os números dependem do tipo de célula e do próprio experimento.
   5. Após 20-30 min de incubação (verifique a fixação inicial da célula), adicione suavemente 500 μL de mídia no topo das células. Coloque de volta na incubadora para permitir uma maior disseminação celular.
      NOTA: O tempo de semeadura depende do tipo de célula e dos requisitos experimentais; A formação de uma monocamada com incubação durante a noite também é possível. O volume dos meios de cultura deve ser ajustado em conformidade. Coloração celular secundária: uma vez anexadas, as células podem ser coradas com um corante como o SpyDNA (ver Tabela de Materiais) para visualizar os núcleos (Figura Suplementar 5) ou outra coloração para visualizar qualquer estrutura de interesse. Sempre tome cuidado com o fato de que a coloração de células vivas ou a superexpressão de proteínas por transfecção podem afetar a resposta celular ao estiramento, especialmente no córtex celular, na membrana plasmática ou em proteínas/estruturas mecanossensíveis.
   6. Troque por meios independentes de CO₂ e use imediatamente no dispositivo de alongamento.
      NOTA: Agora, a amostra está pronta para um experimento de alongamento.
3. Experimento de estiramento celular: exemplo de um único ciclo de liberação de estiramento e imagem da membrana plasmática (PM) para capturar a remodelação dinâmica de PM de fibroblastos.
   1. Monte o anel elástico no microscópio stage como na seção 6, etapa 6.2.
   2. Encontre uma célula de interesse, registre sua posição e tire uma imagem da célula pré-esticada (Figura 4B).
   3. Aplique o vácuo desejado que, de acordo com a curva de calibração, corresponda à deformação do substrato desejada.
   4. Para encontrar a célula esticada, primeiro, refoque em Z e, em seguida, mova-se na direção XY para localizar e centralizar a célula de volta ao campo de visão.
   5. Grave imagens durante a duração desejada (Figura 4B).
      NOTA: Experimentos iniciais são comumente necessários para determinar a resposta da célula à deformação de tração, dependendo de seu tipo (em média). Estique as células em diferentes cepas de substrato para determinar a carga máxima de extensão que elas podem suportar. A ruptura da membrana plasmática ocorrerá, conforme visualizado através do marcador de membrana fluorescente da membrana plasmática, se a tensão for excessiva para a célula.
   6. Para liberação de células, volte para a posição da célula em repouso e ligue o modo de aquisição do microscópio para garantir que a aquisição possa começar assim que a amostra for refocada.
   7. Solte o alongamento e refoque rapidamente manualmente em Z.
   8. Registre imagens da célula liberada pelo tempo desejado (Figura 4B). Devido à natureza flexível da membrana PDMS, a amostra desfoca facilmente com o tempo. Portanto, ajuste manualmente o foco durante a aquisição da imagem.
      NOTA: Para refocar com sucesso durante a imagem após a liberação, as imagens devem ser visualizadas com frequência suficiente; Uma imagem de vídeo de 3-5 minutos a cada 3 s é razoável. O substrato PDMS não é compatível com o sistema de foco perfeito do microscópio, portanto, geralmente é necessário um ajuste manual pelo usuário para aquisição rápida. O foco do software pode ser resolvido, mas cuidado com possíveis erros e grandes movimentos do palco que podem danificar a objetiva ao atingir uma parte do poste de alongamento. O usuário pode decidir realizar vários trechos da amostra, dependendo do experimento.
4. Pós-processamento: Alinhe as imagens usando Fiji
   1. Abra as imagens em repouso e estique.
   2. Use o modelo de plug-in Fiji correspondente e selecione uma região da célula para alinhar (Figura 4C).
      NOTA: Os deslocamentos relativos da imagem de deformação alinhada são renderizados por Fiji e as imagens são cortadas e alinhadas. Baixe o plugin template_matching neste link: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/template-matching-ij-plugin

8. Semeadura celular em substrato pré-estirado

1. Monte o anel esticado revestido com a proteína de adesão no dispositivo de alongamento.
2. Estique o substrato PDMS até o nível de deformação desejado.
3. Semeie as células como na seção 7.
   NOTA: Neste experimento, a semeadura não é realizada em condições estéreis, portanto, o protocolo pode não ser apropriado para todos os tipos de células.
4. Depois que as células aderirem, troque o meio por um meio independente de CO₂.
   NOTA: Escolha células de adesão rápida para minimizar o tempo de aderência.
5. Após um tempo de incubação desejado, solte o trecho e crie uma imagem de uma célula de interesse.
   NOTA: Nesta etapa, é difícil encontrar a mesma célula após a liberação do estiramento, pois a posição da célula em repouso é desconhecida e o movimento do substrato PDMS não é facilmente previsível.

9. Fixação de células esticadas ou relaxadas

1. Fixe as células em estados esticados (trabalhe sob capuz químico)
   NOTA: O paraformaldeído (PFA) é um agente de fixação padrão; use-o quente a 37 °C para garantir uma fixação rápida. Alternativamente, a solução de glioxal²² permite uma fixação rápida da amostra com boa preservação da amostra.
   1. Prepare o agente de fixação.
   2. Células de sementes nos anéis seguindo o passo 7.2.
   3. Monte o poste de alongamento e o controlador dentro de uma coifa química e conecte-o ao suprimento de vácuo.
   4. Coloque o anel com as células semeadas no poste de alongamento.
   5. Para corrigir o estado esticado, estique até a deformação desejada. Remova o meio de cultura celular e fixe adicionando a solução de PFA a 4% às células por 10 min a 37 ° C. Em seguida, lave com PBS, sempre segurando o alongamento. Solte lentamente o aspirador e lave com mais PBS.
      NOTA: Não se esqueça de preparar um estado de controle sem estiramento (para isso, um pequeno pedaço de PDMS pode ser cortado e seco com uma pequena quantidade de solução de etanol a 96% por baixo, em cima de uma lamínula de vidro). Para obter a imagem da amostra fixa, é recomendável esticar a amostra de volta para a mesma magnitude. Como o PFA é tóxico, devem ser tomadas as devidas precauções nesta etapa. É conveniente usar um pequeno forno que pode ser mantido sob o capô, consulte a Tabela de Materiais).
   6. Faça a imagem da amostra, de preferência aplicando o vácuo novamente, no mesmo nível usado na fixação, o que garante o "reachatamento" da amostra (Figura 4D).
2. Fixe a célula após a liberação por estiramento (trabalhe sob a capa química).
   1. Estique as células até a tensão e o tempo desejados. Pouco antes da liberação do estiramento, remova a maior parte do meio sem secar completamente a amostra e libere a tensão. Como alternativa, aplique um trecho cíclico de uma duração específica.
   2. Remova rapidamente a mídia e fixe imediatamente com a solução fixadora por 10 min. Lave com PBS e imagem.
      NOTA: A amostra também pode ser semeada em um substrato pré-estirado e, após um tempo de semeadura definido pelo usuário, corrigida após a liberação de estiramento como na etapa 9.2.2.
3. Imunofluorescência de amostra fixa: siga os protocolos padrão para imunofluorescência em estiramento ou liberação; o bloqueio com gelatina de peixe é preferível ao BSA¹⁷.
4. Visualize a amostra (Figura 4E).
5. Preservação da amostra
   1. Prepare a mídia de montagem para sample preservação (Mowiol ou Prolong).
   2. Remova o PBS e adicione uma gota (cerca de 75 μL) de mídia de montagem.
   3. Pegue uma lamínula com uma pinça e coloque-a delicadamente por cima (evite bolhas, que dificultariam a visualização).
   4. Secar durante pelo menos 48 h à temperatura ambiente (RT).
   5. Corte ao redor da amostra fixa PDMS e monte em outra lamínula de vidro para obter imagens posteriores.
      NOTA: Esta etapa não é compatível com a pós-imagem da amostra na membrana esticada, pois a montagem da membrana PDMS em uma lamínula com o meio de preservação envolve a preservação da membrana apenas em seu estado relaxado.

10. Fixação com a grade para obter imagens da mesma área de amostra em diferentes modos - imagem SEM como exemplo

NOTA: Este protocolo pode ser usado para obter imagens da mesma célula única em dois microscópios diferentes, microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica de varredura, conforme apresentado aqui. A imagem correlativa requer processamento de imagem avançado que não está no escopo deste protocolo. Outras aplicações úteis podem ser, por exemplo, a visualização da amostra em modo vivo, fixação adicional sob o capô e visualização da mesma célula após a imunocoloração (o protocolo usado para a Figura Suplementar 5).

1. Prepare um anel elástico usando as placas de PMMA padronizadas da seção 4.
2. Semeie as células como na etapa 7.2.
   NOTA: Cuidado com o fato de que a solução de revestimento deve ser aplicada com cuidado para garantir a cobertura completa do PDMS, mesmo nos pequenos orifícios da grade.
3. Fixe conforme descrito na seção 8, mas usando fixador apropriado e protocolo compatível com a amostra e a imagem de microscopia eletrônica.
   NOTA: Se estiver usando uma mistura de PFA + glutaraldeído (por exemplo, 2% -2.5%), tome cuidado com a autofluorescência proveniente da presença de reagente de glutaraldeído e, eventualmente, execute uma etapa de têmpera²³.
4. Visualize a amostra no modo de fluorescência e registre a posição da célula (imprima a grade e anote a posição com uma cruz, por exemplo).
5. Depois que todas as imagens forem tiradas, prepare a amostra para EM cortando primeiro o PDMS ao redor da amostra (removendo previamente o lubrificante).
6. Processe a membrana PDMS + amostra para microscopia eletrônica de varredura (que envolve o protocolo padrão de desidratação da amostra e pulverização catódica de metal)¹².
7. Ao fazer imagens no microscópio SEM, encontre as posições da grade e procure as células previamente visualizadas no modo fluorescente (Figura 4F, G).

Resultados

Calibração e radialidade
A caracterização adequada da cepa obtida é uma garantia de reprodutibilidade e controle dos experimentos. Embora esferas fluorescentes possam ser adicionadas a cada amostra para registrar com precisão a tensão, uma etapa de calibração anterior garante o planejamento adequado para o experimento, sabendo a magnitude da tensão que o experimentalista deseja aplicar à amostra antes do alongamento real. A deformação não dependerá apenas do vácuo aplicado, mas variará dependendo das ...

Discussão

Um grande número de dispositivos de alongamento tem sido usado para aplicar o alongamento mecânico em amostras biológicas, mimetizando as condições fisiológicas do corpo^24,25. Numerosos arranjos estão disponíveis na literatura, e a observação da resposta da amostra é geralmente realizada acoplando dispositivos de alongamento à força atômica²⁶ ou microscopia de fluorescência^{27 ,...}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Máscara de acetato	JD Fotodados
Acrilamida	Biorad	161-0140	Solução de acrilamida a 40%
APS	Sigma Aldrich	Resposta 3678	Persulfato de amônio para eletroforese, ≥ 98%
Aptes	Sigma Aldrich	281778	(3-aminopropil)trietoxissilano
Bomba microfluídica autônoma	Cobalto Elveflow	Cobalto Duplo	Cobalto Duplo
Bisacrilamida	Biorad	161-0142	Solução 2% Bis
Lâmina	Fisher Científico	11733919	Grupo Didático Hoja fez ctica X100 LAME BISTOURI ESTÉRIL N° 23  LAMD23
Clipes	Sprintis	AKXX000001	Bull Dog Clips, 32 mm, feito de metal, capacidade 10 mm, niquelado
Tratamento corona	Produtos eletrotécnicos	BD-20AC, SKU:12051A	TRATADOR CORONA DE LABORATÓRIO BD-20AC
Copos	VWR	611-1368	VWR, copos de copo, descartáveis, 250 mL
DAPI	Roche	10236276001	Coloração DAPI
Etanol 96%	Panreac Quí mica, SLU	131085-1212	Etanol 96% v/v para aná lisis, ACS- 2,5 L
Fibronectina	Sigma	F0895	Fibronectina, de plasma humano, líquido  0.1%
Microesferas Modificadas com Carboxilato FluoSpheres, 0.1 µ m	Tecnologia da Vida	F8801, F8803	Grânulos fluorescentes amarelos, verdes e vermelhos para avaliação de resolução
Microesferas Modificadas com Carboxilato FluoSpheres, 0.2 µ m	Fisher Científico	F8809, F8810	Grânulos fluorescentes amarelos, verdes e vermelhos para calibração de tensão
Glutaraldeído	Sigma Aldrich	G6403	Solução de glutaraldeído 50% em H2O
Interferômetro	Veeco	Wyko NT1100	Interferômetro para medir espessuras de membranas PDMS
Isopropanol	Panreac Quí mica, SLU	131090-1212	2-Propanol (Reag. Ph. Eur.) para um á lisis, ACS, ISO
Laiton pesa			Feito sob medida
Lenços de papel sem fiapos	Berkshire	DURX670, DR670090920	Toalhetes não tecidos
Lubrificante (vaselina)	Sigma	16415	Vaselina
Alinhador de máscara	Sü ss MicroTec	MJB4	Alinhador de máscara para fotolitografia em placas de PMMA
Mowiol	Calbiochem - Merck	475904	Reagente MOWIOL 4-88
Disco giratório para microscópio NIKON confocal	Nikon	Eclipse Ti-E/B	equipado com Nikon Ti-S-ER  palco
Microscópio NIKON Vertical	Nikon	Eclipse Ni-E	equipado com estágio Nikon NI-SH-E
Objetivo 60x	Nikon	CFI Apo NIR 60X W	NIR Apo 60X/1.0w DIC N2 WD 2.8
Solução PBS	Gibco	14200067	DPBS, 10x
PDMS	Dow Corning	2401673921	Sylgard - 184 Kit de Elastômero de Silicone DN 109
Tampa do anel da placa de Petri (grande)	Proquinorte	93060	Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177925 diametro 100
Tampa do anel da placa de Petri (pequena)	Proquinorte	93060	Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177924
Limpador de plasma	Harrick	PDC-002	Gerador de plasma de oxigênio
Placas e anéis de PMMA			Consulte a tabela de especificações do Excel em documentos suplementares
Prolongar	Invitrogen	Pág. 36930 / Pág. 36934	Reagente antidesbotamento ProLong Gold
Repelir-Silano	GE Saúde	17-1332-01	PlusOne Repelente-Silano ES
Anéis/anel de borracha	Tecnifil		Feito sob medida
Revestidor giratório	Loureiro	WS-650Sz	Revestidor giratório
SPY650-DNA	Espirocromo	SC 501	SPY650-DNA
Colher de direção	VWR	231-0416	Espátula descartável curta Eco, colher e colher duplas, aditivo PP e EcoPure
Resina SU8 2100	Microquímica	Y111075	SU8-2100
SU8-Desenvolvedor	Sigma-Aldrich	484431	Acetato de éter monometílico de propilenoglicol
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281-50ML	N, N, N ', N'-Tetrametiletilenodiamina, biorreagente adequado. Reagente para eletroforese
Tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano	Sigma Aldrich	448931	Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano
Pinças	IESMAT	T5039	Pinça Dumont HP 7 Aço Inoxidável. Ponta de 0,17 x 0,10 mm. (Ágar Científica Ltda)
Controlador de vácuo	GARCAP / Parker	990-005203-005	Controlador de vácuo
Controlador de vácuo fluigente	Fluigente	LU-FEZ-N800	Fluxo de linha EZ (n800mbar)
Papel de bancada branco	Raima	931.1001	Papel Raima 42 x 52