Aqui, descrevemos uma técnica para a coleta de órgãos-alvo vestibulares humanos sob condições fisiológicas durante a labirintectomia e sua análise usando imunocoloração.
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Artigo de método
Colheita de órgãos-alvo vestibulares sob condições fisiológicas durante a labirintectomia
Neste artigo
Resumo
Resumo
O ouvido interno humano vivo é difícil de estudar porque está envolto em um osso denso da cápsula ótica que limita o acesso ao tecido biológico. Os métodos tradicionais de histopatologia do osso temporal dependem de protocolos de descalcificação longos e caros que levam de 9 a 10 meses e reduzem os tipos de análise de tecido possíveis devido à degradação do RNA. Há uma necessidade crítica de desenvolver métodos para acessar o tecido fresco do ouvido interno humano para entender melhor as doenças otológicas, como a doença de Ménière, em nível celular e molecular. Este artigo descreve uma técnica para a coleta de órgãos-alvo vestibulares humanos de um doador vivo em condições fisiológicas. Um indivíduo com doença de Ménière e 'ataques de gotas' refratários à injeção intratimpânica de gentamicina foi submetido à labirintectomia. Uma mastoidectomia tradicional foi realizada pela primeira vez, e os canais semicirculares horizontais e superiores (CEC) foram identificados. A cavidade mastóidea foi preenchida com uma solução salina balanceada para que o labirinto pudesse ser aberto em condições mais fisiológicas para preservar a integridade celular. Um endoscópio de zero grau com um sistema de irrigação por bainha de limpeza de lentes foi usado para visualizar a cavidade mastóidea submersa, e uma broca de diamante de 2 mm foi usada para esqueletizar e abrir os CCEs horizontais e superiores, seguidos pelo vestíbulo. As ampolas e a porção dos ductos do canal para os CECs superior e lateral foram colhidas. O utrículo foi colhido de forma semelhante. O tecido colhido foi imediatamente colocado em um tampão gelado e, em seguida, fixado por uma hora em paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS). O tecido foi enxaguado várias vezes em 1x PBS e armazenado por 48 h a 4 °C. As amostras de tecido foram submetidas à imunomarcação com uma combinação de anticorpos primários contra tenascina-C (cálice), oncomodulina (células ciliadas estreolares), calretinina (cálice e células ciliadas tipo II), proteína 2 da vesícula sináptica (fibras eferentes e botões), β-tubulina 1 (cálice e botões aferentes), seguida de incubação com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo. As amostras de tecido foram então enxaguadas e montadas para exame de microscopia confocal. As imagens revelaram a presença de células ciliadas ampulares e maculares e estruturas neurais. Este protocolo demonstra que é possível colher tecido da orelha interna humana intacto e de alta qualidade de doadores vivos e pode fornecer uma ferramenta importante para o estudo da doença otológica.
Introdução
O ouvido interno humano vivo é difícil de estudar devido à sua localização dentro do osso da cápsula ótica densa do osso temporal. Consequentemente, o acesso ao tecido interno humano tem sido limitado e os pesquisadores confiaram principalmente na colheita de tecido post-mortem. A histopatologia post-mortem do osso temporal (TBH) tem sido uma ferramenta crítica para a compreensão da doença otológica humana há mais de 100 anos 1,2,3. O tecido para TBH é preparado pela colheita post-mortem do osso temporal, um longo processo de descalcificação e preparação do tecido (9-10 meses), seguido de coloração de hematoxilina e eosina. Embora o TBH continue sendo uma ferramenta essencial para revelar novas informações sobre o ouvido interno humano saudável e doente, longos tempos post-mortem e métodos longos e severos de processamento de tecidos limitam sua utilidade para certos fins, necessitando de métodos adjuvantes para estudar o tecido do ouvido interno humano. A ressonância magnética de alta resolução pode visualizar órgãos da orelha interna, mas não tem resolução suficiente para visualizar estruturas em nível celular ou molecular 4,5. Devido a esses desafios, muitas doenças do ouvido interno humano permanecem pouco compreendidas.
Uma abordagem alternativa é colher o tecido do ouvido interno durante a cirurgia. Durante a labirintectomia ou ressecção do schwannoma vestibular translabiríntico, os tecidos da orelha interna são intencionalmente sacrificados. Utrículos colhidos de pacientes durante a ressecção translabiríntica de schwannoma vestibular têm sido usados para caracterizar a morfologia das células ciliadas vestibulares 6,7,8 e estudar a regeneração das células ciliadas 9,10. Mais recentemente, foram desenvolvidas técnicas para captar órgãos da orelha interna de doadores de órgãos usando uma abordagem transcanal que pode ser usada para remover o utrículo e potencialmente outros órgãos terminais vestibulares através de uma janela oval alargada com trauma tecidual mínimo11,12. Utilizando essa técnica, foi possível caracterizar perfis transcriptômicos de célula única para o utrículo humano13. No entanto, essas técnicas expõem os órgãos da orelha interna a condições não fisiológicas durante a colheita. Especificamente, os órgãos do ouvido interno podem ser expostos à ausência de líquido perilinfático e submersão na irrigação normal com soro fisiológico, que tem uma composição iônica substancialmente diferente do líquido perilinfático. Além disso, o labirinto membranoso desidratado é difícil de visualizar, mesmo com ampliação máxima do microscópio cirúrgico, o que torna a dissecção cirúrgica atraumática desafiadora. O trauma mecânico pode danificar ainda mais o tecido, e nossa experiência anedótica sugere que o tecido cirúrgico é frequentemente de qualidade insuficiente de imunocoloração devido a danos mecânicos e degeneração celular. Há necessidade de novas técnicas para coletar atraumaticamente o tecido da orelha interna humana para estudos biológicos que possam elucidar doenças da orelha interna humana mal compreendidas. Aqui descrevemos uma técnica subaquática para a colheita de órgãos-alvo vestibulares humanos sob condições mais fisiológicas durante a labirintectomia e sua análise usando imunocoloração.
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Protocolo
Este protocolo foi desenvolvido com a aprovação do conselho de revisão institucional (IRB) da Escola de Medicina da Universidade Johns Hopkins (IRB00203441) e de acordo com as políticas institucionais para o uso de tecido humano e material potencialmente infeccioso. A coleta de tecido foi realizada durante a labirintectomia, que faz parte do tratamento clínico padrão para a doença de Ménière recalcitrante com ataques de queda.
1. Labirintectomia e colheita de tecidos
- Obtenha a aprovação do conselho do conselho de revisão institucional local (IRB), revise as políticas institucionais para o uso de material humano e infeccioso e obtenha consentimento para doação de tecidos antes de utilizar este protocolo. Realize a coleta de tecido durante a labirintectomia cirúrgica ou abordagem translabiríntica do canal auditivo interno, que faz parte do tratamento clínico padrão.
- Prepare o paciente.
- Antes da indução da anestesia, discuta com a equipe de anestesia como evitar paralisia de ação prolongada para que o nervo facial possa ser monitorado.
- Uma vez induzida a anestesia geral, intubar o paciente e girar a mesa cirúrgica 180°. Coloque os eletrodos de monitoramento do nervo facial e certifique-se de que a profilaxia antibiótica pré-operatória seja administrada.
- Injetar lidocaína a 1% com epinefrina 1:100.000 no conduto auditivo externo e na área pós-auricular. Prepare a orelha da maneira padrão usando betadine.
- Use uma lâmina #15 para criar uma incisão curvilínea pós-auricular padrão (5-6 cm) 1 cm posterior à prega pós-auricular.
- Levante o tecido mole pós-auricular.
- Identifique a fáscia temporal superiormente e eleve o retalho cutâneo pós-auricular anteriormente em direção ao canal auditivo.
- Crie uma incisão periosteal padrão em forma de 7 e eleve o periósteo anteriormente até que a coluna de Henle e o canal auditivo ósseo sejam identificados. Coloque afastadores de auto-retreinamento.
- Realize a mastoidectomia.
- Realize uma mastoidectomia completa, identificando o tegmen superiormente, o seio sigmóide posteriormente e afinando o conduto auditivo externo anteriormente.
- Identifique o canal semicircular horizontal e o processo curto da bigorna.
NOTA: A mastóide não deve ser saucerizada para garantir que continue sendo um recipiente capaz de reter líquido para coleta de tecido subaquático.
- Identifique os canais semicirculares (SC).
- Sob o microscópio cirúrgico (ampliação de 2-4x), use uma broca de diamante grossa de 3 mm para remover as células de ar perilabirínticas laterais ao SC superior, as células de ar subarqueadas e as células de ar retrolabirínticas atrás do SC posterior, estendendo-se superiormente à cruz comum.
- Mergulhe o labirinto.
- Mergulhe a cavidade mastóidea em uma solução salina balanceada (BSS) e visualize o labirinto usando um endoscópio de zero grau com um sistema de irrigação por bainha de limpeza de lentes.
- Use o sistema de irrigação da bainha de limpeza de lentes para irrigar a cavidade mastóidea com BSS, lavando o sangue e permitindo uma melhor visualização do labirinto.
- SCs de linha azul.
- Enquanto mantém um nível adequado de BSS na cavidade mastóidea e usa o endoscópio para visualização, use uma broca de diamante de 3 mm para 'linha azul' todos os três canais semicirculares, perfurando cuidadosamente o osso da cápsula ótica até que o canal semicircular apareça como uma linha azulada quando visto com o endoscópio.
- Irrigue intermitentemente com solução BSS usando o sistema de irrigação para lavar o sangue e obter uma visualização adequada, conforme ilustrado na Figura 1.
- Colha ampolas SC.
- Sob BSS, entre na cúpula do canal semicircular lateral e siga-a anteriormente até que suas ampolas sejam identificadas. Entre no SC superior e siga-o medialmente em direção às suas ampolas, que podem ser colhidas com as ampolas do SC superior. Corte o ducto SC lateral bruscamente para facilitar a remoção.
- Eleve as ampolas SC horizontais e superiores da crista usando uma agulha de Rosen e separe as fibras aferentes do epitélio e do labirinto membranoso. Em seguida, remova essas estruturas.
- Passe a cúpula do SC posterior e siga-a inferior e anteriormente às suas ampolas. Da mesma forma, colha as ampolas SC posteriores e coloque todo o tecido da BSS no gelo.
- Colha mácula.
- Remova o osso entre as ampolas SC horizontal e posterior para expor o vestíbulo. As paredes membranosas do utrículo terão sido rasgadas com a remoção das ampolas. Enquanto um nível de fluido for mantido, as máculas permanecerão presas anteriormente; eleve-o e remova-o.
- O sáculo fica dentro do recesso esférico; eleve bruscamente e remova-o do recesso. Da mesma forma, coloque as amostras de tecido em BSS no gelo.
- Transporte amostras de tecido em gelo da sala de cirurgia para o laboratório para fixação dentro de 1 h após a colheita.
2. Imuno-histoquímica e imagem
- Corrija a amostra.
- Coloque a amostra de tecido em paraformaldeído (PFA) a 4% em solução salina tamponada com fosfato 1x (1x PBS) à temperatura ambiente (RT) com balanço suave ou agitação orbital (100 rpm) por 1 h.
NOTA: Solução de PFA a 4% (para 5 mL no total): 625 mL de solução estoque de PFA a 32% + 500 mL de 10xPBS + 3875 mL de ddH2O.
- Coloque a amostra de tecido em paraformaldeído (PFA) a 4% em solução salina tamponada com fosfato 1x (1x PBS) à temperatura ambiente (RT) com balanço suave ou agitação orbital (100 rpm) por 1 h.
- Transfira amostras de tecido para 1x solução PBS e enxágue 3x 15 min (ou mais, se necessário) em RT com balanço suave ou agitação orbital.
- Remova o excesso de tecido conjuntivo sob o microscópio de dissecação em 1x PBS na RT.
- Descalcifique a amostra.
- Transfira amostras de tecido para ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 5% em 1x solução de PBS para limpar o epitélio sensorial de detritos ósseos finos e otocônias. Execute a incubação por 15-30 min em RT, com balanço suave ou agitação orbital.
- Novamente, transfira amostras de tecido para 1x solução PBS e enxágue 3x 15 min (ou mais, se necessário) em RT com balanço suave ou agitação orbital.
- Aplique 125-200 mL de tampão de bloqueio 2x (2x BB) em cada amostra e incube por 1,5-5 h em RT ou durante a noite (ON) a 4 ° C. Execute a incubação sob constante agitação orbital.
NOTA: 2x Tampão bloqueador (2x BB): 1 g de albumina de soro bovino (BSA) dissolvido em até 5 mL de 1x PBS suplementado com 0,5% de Triton X-100. O BSA serve como agente de bloqueio para locais de ligação de antígenos não específicos. - Corar usando anticorpos primários.
- Aplique 120-150 mL de uma combinação de anticorpos primários dissolvidos em 1x BB na diluição desejada. Aplique anticorpos anti-tenascina-C de coelho na diluição de 1:200 (2,5 μg/mL), anticorpos anti-oncomodulina de cabra na diluição de 1:200 (2,5 μg/mL), anticalretinina de camundongo na diluição de 1:300 (2,2 μg/mL) e DAPI na diluição de 1:1000 (1 μg/mL). Em seguida, transferir a amostra (coberta) para 4 °C (frigorífico ou câmara frigorífica) sob agitação orbital suave para incubação ON.
NOTA: 1x BB: Misture o mesmo volume de 2x BB e 1x PBS suplementado com 0,5% de Triton X-100.
- Aplique 120-150 mL de uma combinação de anticorpos primários dissolvidos em 1x BB na diluição desejada. Aplique anticorpos anti-tenascina-C de coelho na diluição de 1:200 (2,5 μg/mL), anticorpos anti-oncomodulina de cabra na diluição de 1:200 (2,5 μg/mL), anticalretinina de camundongo na diluição de 1:300 (2,2 μg/mL) e DAPI na diluição de 1:1000 (1 μg/mL). Em seguida, transferir a amostra (coberta) para 4 °C (frigorífico ou câmara frigorífica) sob agitação orbital suave para incubação ON.
- Enxágue as amostras de tecido em 1x solução PBS, 3x 15 min (ou mais, se necessário), em RT com um balanço suave.
- Corar usando anticorpo secundário.
- Aplique 120-150 mL de uma combinação de anticorpos secundários conjugados com fluoróforo dissolvidos em 1x BB na diluição de 1:2000 (1 μg/mL). Aplique anticorpo secundário anti-coelho conjugado de 488 nm, anticorpo secundário anti-camundongo de 568 nm e anticorpo secundário anti-cabra de 647 nm.
- Em seguida, incubar a amostra (coberta) em RT sob agitação orbital suave por 1,5-2 h (ou ON a 4 °C).
- Enxágue as amostras de tecido em 1x solução PBS, 3x 15 min (ou mais, se necessário), em RT com um balanço suave.
- Realize a microdissecção e montagem.
- Sob o microscópio de dissecação, remova o excesso de tecido e membranas ao redor do epitélio vestibular sensorial. Use etanol a 70% para limpar a superfície de uma lâmina de histologia de vidro, seque ao ar e aplique uma gota de 55 mL do meio de montagem apropriado.
- Transfira as amostras de tecido sensorial para o meio de montagem. Use uma pinça fina para orientar suavemente as amostras com o feixe de cabelo voltado para cima no meio de montagem.
- Coloque suavemente uma lamínula de tamanho apropriado no meio de montagem que contém as amostras, tentando limitar as bolhas de ar. Certifique-se de que a lamínula seja do grau de espessura #1.5 necessário para microscopia confocal.
- Coloque as corrediças em uma área escura (por exemplo, uma gaveta de bancada) para deixar o meio de montagem endurecer. Sele a lamínula na lâmina com esmalte transparente e deixe secar em uma área escura antes de examiná-la com o microscópio confocal. Em seguida, guarde as lâminas seladas no escuro (caixa de lâminas da pasta de slides) a 4° até a geração de imagens.
- Use um microscópio confocal com ampliação de 40x-100x com canais de 488 nm e 657 nm para obter imagens da amostra.
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Resultados
Usando essa técnica, o utrículo humano e as ampolas do canal lateral e superior foram colhidos intactos com trauma mínimo (Figura 2). Como pode ser visto na Figura 2, as ampolas podem ser colhidas com uma porção substancial do ducto membranoso. A marcação imunofluorescente com antitenascina-C (proteína da matriz extracelular) e anti-oncomodulina (pequena proteína ligadora de cálcio da família das proteínas parvalbumina) mostrou células ciliadas vestibulares tipo...
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Discussão
Este artigo descreve uma nova técnica para a coleta subaquática de órgãos terminais vestibulares em BSS usando endoscópios e sua análise usando imagens imunofluorescentes. Aqui, demonstramos a colheita de órgãos-alvo vestibulares intactos com células ciliadas vestibulares intactas e qualidade de tecido suficiente para uma imunomarcação bem-sucedida. A densidade de células ciliadas em nosso espécime foi semelhante àquelas obtidas em outros estudos de doadores de órgãos vivos
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a Mohamed Lehar por sua ajuda neste projeto. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios da Comunicação (U24DC020850).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10x Estoque de Solução Salina Tamponada com Fosfato | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| 32% Solução de Estoque de Paraformaldeído | ThermoFisher Scientific | 50-980-495 | |
| Alexa Fluor 488 Anticorpo Secundário Anti-Coelho | Jackson Immunoresearch | 111545144 | |
| Alexa Fluor 568 Anticorpo Secundário Anti-Camundongo | Jackson Immunoresearch | 115575146 | |
| Alexa Fluor 647 Anti-Goat Anti-Goat Secondary | Balanceado 705607003 | de Imunopesquisa | |
| Jackson ThermoFisher Scientific | 14040117 | ||
| Albumina de Soro Bovino | Sigma-Aldrich | 10711454001 | |
| Microscópio Confocal | Nikon A1 | Vidro de cobertura A1 | |
| (18 mm x 18 mm, espessura #1.5 ) | Corning | 2850-18 | |
| Endo-Scrub 2 Bainha de limpeza de lentes | Medtronic | IPCES2SYSKIT | |
| Solução ácida de etilenodiaminotetracético (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008 | |
| Anticorpo anti-oncomodulina de cabra | R & D Systems | AF6345 | |
| Hopkins Telescópio de 0 Graus | Karl Storz | ||
| Mouse Anti-calretinina Anticorpo | BD Biosciences | 610908 | |
| ProLong Gold reagente anti-desbotamento | Invitrogen | P10144 | |
| Coelho Anti-tenascina C Anticorpo | Millipore | AB19013 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 |
Referências
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Reimpressões e permissões
