Artigo de método

Capturando quebras de local frágeis comuns por γH2A nativo. X ChIP

DOI:

10.3791/67535

⸱

24 de janeiro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention, Hunan Provincial Maternal and Child Health Care Hospital

Neste artigo

Resumo

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Apresentamos um método rápido e eficiente para detectar quebras comuns de locais frágeis por meio da imunoprecipitação nativa da cromatina γH2A.X (ChIP). Essa abordagem reduz significativamente o tempo e a mão de obra associados aos ensaios tradicionais de γH2A.X ChIP, mantendo alta reprodutibilidade e confiabilidade dos resultados.

Resumo

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O estresse de replicação induzido pela exposição a agentes extrínsecos pode levar a quebras de DNA em locais frágeis comuns, que são regiões do genoma conhecidas por serem propensas à instabilidade estrutural. O ensaio de imunoprecipitação da cromatina γH2A.X (ChIP) serve como uma ferramenta poderosa em estudos de genotoxicidade, pois a fosforilação de γH2A.X é um marcador bem estabelecido para quebras de fita dupla de DNA. Os ensaios tradicionais de γH2A.X ChIP, no entanto, costumam ser trabalhosos e envolvem várias etapas demoradas. Neste estudo, apresentamos um método simplificado, mas eficaz, que combina fracionamento subcelular com ChIP nativo para isolar complexos associados a γH2A.X. Essa abordagem é particularmente adequada para analisar as interações γH2A.X-cromatina com especificidade e eficiência aprimoradas. Usando o fracionamento subcelular, os materiais não ligados à cromatina são efetivamente removidos, resultando em uma fração de cromatina purificada. A digestão subsequente da nuclease microcócica (MNase) em condições amenas permite a fragmentação da cromatina, preservando as interações fisiológicas entre γH2A.X e seus complexos proteicos associados. Essa preservação é essencial para estudar parceiros de interação nativos envolvidos nas vias de resposta a danos no DNA. Este protocolo ChIP nativo otimizado reduz substancialmente o tempo e a mão de obra associados aos ensaios convencionais de ChIP γH2A.X. O procedimento simplificado não apenas simplifica o fluxo de trabalho, mas também produz resultados altamente reprodutíveis, tornando-o particularmente vantajoso em ambientes onde é necessário o processamento de alto rendimento de várias amostras. Este método tem ampla aplicabilidade em estudos focados na estabilidade do genoma, reparo do DNA e biologia da cromatina, onde a detecção precisa e eficiente de locais de dano ao DNA é crítica. Ao empregar protocolos otimizados e etapas simplificadas, esse método permite a detecção de danos ao DNA em locais frágeis com sensibilidade aprimorada e manuseio mínimo de amostras, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos sobre estabilidade do genoma e resposta a danos no DNA.

Introdução

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Locais frágeis comuns (CFSs) são grandes regiões cromossômicas encontradas em todos os cromossomos humanos propensos a quebrar durante a metáfase. Sob estresse de replicação, a replicação nessas regiões é significativamente atrasada, impedindo sua duplicação completa antes da entrada mitótica1, o que acaba resultando em lacunas e quebras específicas do local. Os CFSs são pontos críticos para instabilidade cromossômica e são uma das principais causas de rearranjos cromossômicos durante o desenvolvimento inicial do câncer. O estresse de replicação, que geralmente está presente em condições tumorigênicas, pode levar à perda de genes supressores de tumor e amplificação de oncogenes - coletivamente chamados de variação do número de cópias (CNV) 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Além disso, os CFSs são altamente propensos à integração viral, promovendo ainda mais o desenvolvimento do câncer 7,8,9,10. Múltiplas deleções homozigóticas de genes supressores de tumor foram detectadas em regiões da SFC durante análises pan-câncer de tumores primários. Os SFCs mais comumente afetados no câncer incluem FRA2F, FRA3B, FRA4F, FRA5H e FRA16D11. Os SFCs são particularmente vulneráveis à quebra na presença de agentes carcinogênicos extrínsecos12. Para avaliar os efeitos carcinogênicos prejudiciais dos contaminantes ambientais, é necessário um método rápido e confiável para quantificar a ocorrência de quebra de SFC.

Fosforilação de H2A. X no resíduo de serina 139 (γH2A.X) por Ataxia Telangiectasia e Proteína Relacionada a Rad3 (ATR) ou Ataxia Telangiectasia Mutada (ATM) é um evento chave na sinalização de travamento do garfode replicação 13. γH2A.X serve como um indicador de garfos de replicação paralisados antes da formação de quebra de fita dupla (DSB)13, criando um ambiente de cromatina favorável para facilitar o recrutamento eficiente de proteínas de reparo para locais paralisados. Além disso, γH2A.X pode ser recrutado para locais de quebra após o colapso do garfo14,15, consistente com seu papel principal no reparo de DSB. Como as quebras da SFC estão intimamente associadas a aberrações cromossômicas que impulsionam a progressão do câncer, a detecção dessas quebras pode ser fundamental para entender os estágios iniciais da tumorigênese. A presença de γH2A.X em CFSs pode ser usada como um biomarcador para detectar eventos precoces de instabilidade genômica. Essas informações podem ajudar a identificar potenciais carcinógenos e avaliar o risco associado à exposição a vários agentes extrínsecos. Ao medir quebras de DNA em CFSs induzidas por agentes extrínsecos, a cromatina IP γH2A.X (ChIP) pode fornecer informações sobre como esses agentes contribuem para os mecanismos subjacentes à tumorigênese.

No ChIP convencional (ou seja, ChIP reticulado, X-ChIP), a associação de γH2A.X com suas sequências de DNA alvo é estabilizada por reticulação reversível de formaldeído. A cromatina é subsequentemente cortada em fragmentos de aproximadamente 500 pares de bases (pb) por meio de sonicação, e a solução resultante é limpa de detritos por sedimentação 16,17,18. Um anticorpo γH2A.X de grau ChIP é então adicionado à fração de cromatina eliminada, seguido pela adição de grânulos de agarose de proteína A / G para enriquecer as regiões de cromatina ligadas a γH2A.X 16,17,18. Os complexos imunes (ou seja, complexo de DNA direcionado a grânulos-anticorpo-γH2A.X) são lavados várias vezes com tampões de lavagem rigorosos para remover fragmentos de DNA ligados não especificamente 16,17,18. Após a lavagem, o DNA especificamente ligado é eluído dos complexos imunes. As ligações cruzadas do formaldeído são então revertidas, seguidas pela digestão de proteínas usando proteinase K, após a qual o DNA enriquecido é purificado e concentrado 16,17,18. Para avaliar as regiões associadas ao γH2A.X, utiliza-se PCR, PCR quantitativo (qPCR) ou sequenciamento direto 16,17,18. A ocupação de γH2A.X em regiões específicas, como CFS, é determinada pela intensidade do sinal de PCR ou qPCR, que é proporcional à quantidade de γH2A.X ligada naquele local, fornecendo informações sobre danos ao DNA específicos do local e eventos de reparo 16,17,18.

Apesar de ser uma abordagem experimental poderosa, o X-ChIP tem várias limitações significativas: (i) requer um grande número de células, tipicamente na faixa de 1 x 107 a 5 x 107, devido à ineficiência da precipitação de anticorpos associada à fixação, o que aumenta o custo geral do experimento19; (ii) o processo de reversão das ligações cruzadas do formaldeído e subsequente purificação do DNA é demorado e trabalhoso, dificultando a manutenção da consistência e confiabilidade dos resultados; e (iii) interações γH2A.X-DNA com menor significado funcional não podem ser distinguidas daquelas com maior significado porque a etapa de reticulação pode estabilizar interações transitórias, levando à detecção de interações que podem não ser biologicamente relevantes19.

A imunoprecipitação da cromatina nativa (ChIP nativo ou N-ChIP) é uma técnica bioquímica essencial usada para estudar as interações proteína-DNA dentro de seu contexto de cromatina nativa sob condições fisiológicas de sal. Tem sido fundamental para elucidar a organização espacial e temporal da cromatina, ligação do fator de transcrição e modificações de histonas. O Native ChIP tem um papel de longa data no campo mais amplo da biologia e epigenética da cromatina, oferecendo vantagens e limitações únicas em comparação com o X-ChIP. Esse método, introduzido no final da década de 198020, envolve o isolamento da cromatina das células por métodos que preservam sua estrutura nativa, como a digestão com nuclease microcócica (MNase)21. Isso preserva os contatos proteína-DNA e histona-DNA inerentes, o que torna o ChIP nativo particularmente adequado para estudar modificações de histonas e posicionamento de nucleossomos em sua configuração natural de cromatina22. Estudos de ChIP nativo de alta resolução demonstraram o uso da digestão da MNase para reduzir a cromatina a nucleossomos individuais, o que facilita o mapeamento de modificações de histonas com maior precisão23. Além disso, como nenhuma reticulação química está envolvida, o risco de introduzir vieses ou artefatos que possam deturpar as interações proteína-DNA é minimizado24.

Em contraste com o X-ChIP, onde o formaldeído ou outros agentes de reticulação são usados para corrigir as interações proteína-DNA, o Native ChIP fornece uma visão mais realista da cromatina, evitando possíveis artefatos de reticulação. No entanto, enquanto o X-ChIP é geralmente mais adequado para detectar interações transitórias ou dinâmicas entre DNA e proteínas reguladoras25, o ChIP nativo é ideal para interações proteína-DNA estáveis, como histonas ou outras proteínas ligadas à cromatina26 , 27 . Uma das limitações observadas para o ChIP nativo é a incapacidade de capturar eventos de ligação transitórios ou de baixa afinidade, que geralmente são estabilizados por meio de reticulação no X-ChIP25.

Um corpo significativo de trabalho em epigenética alavancou o ChIP nativo para descobrir modificações de histonas em diversos ambientes biológicos28. Esses esforços têm sido cruciais na definição do código das histonas - o padrão de modificações das histonas que regulam a expressão gênica e a dinâmica da cromatina29. Embora H2A. X é uma histona ligante menos fortemente associada, a H2A nativa. O método X ChIP foi aplicado com sucesso em células-tronco embrionárias30. Neste estudo, otimizamos um procedimento de extração de cromatina para realizar ChIP nativo de γH2A.X em células 293T humanas (Figura 1). A hidroxiureia e a afidicolina são amplamente utilizadas em pesquisas para investigar o estresse, danos e instabilidade genômica da replicação do DNA31. Neste estudo, esses agentes foram aplicados às células para induzir o estresse de replicação e gerar quebras de DNA na SFC.

Usando material de partida de aproximadamente 1 x 106 a 5 x 106 células, este método pode ser dividido em quatro estágios principais: (i) fracionamento subcelular para isolar a cromatina, (ii) digestão da nuclease microcócica (MNase) para fragmentar a cromatina, (iii) imunoprecipitação e eluição e (iv) análise de DNA por PCR quantitativo (qPCR). A realização de ChIP após o fracionamento subcelular oferece vários benefícios e foi bem documentada em vários estudos 32,33,34,35. Essa abordagem permite a remoção de proteínas não ligadas à cromatina e outros detritos celulares, resultando em uma fração de cromatina altamente purificada. Ao isolar a cromatina antes da imunoprecipitação, o fracionamento subcelular ajuda a manter as interações nativas da cromatina e reduz o ruído de fundo de proteínas não associadas à cromatina, o que leva a resultados mais específicos e confiáveis, pois apenas os complexos ligados à cromatina são retidos para análise. Além disso, o fracionamento subcelular permite condições mais brandas para a digestão da cromatina, preservando assim as interações fisiológicas proteína-DNA e oferecendo uma representação mais precisa da dinâmica da cromatina no ambiente celular nativo.

O uso de ChIP nativo de γH2AX para medir o impacto de agentes extrínsecos na quebra de locais frágeis comuns tem um potencial significativo para a pesquisa do câncer. Essa técnica permite a detecção de danos ao DNA induzidos pela exposição a agentes cancerígenos ambientais, fornecendo informações sobre os mecanismos moleculares pelos quais os poluentes contribuem para a instabilidade genômica e o desenvolvimento do câncer. Ao preservar o contexto da cromatina nativa, este método facilita a avaliação precisa dos padrões de danos ao DNA associados à exposição carcinogênica, auxiliando na avaliação de riscos ambientais e no estudo da tumorigênese causada pela poluição.

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Protocolo

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1. Colheita de células

  1. Semeie cerca de 5 x 105 células HEK 293T em cada uma das quatro placas de 6 cm, cada uma contendo 4 mL de meio DMEM completo.
  2. Após 24 h, trate uma placa com 2 μL de solução estoque de afidicolina 1 mM (consulte a Tabela de Materiais) (concentração final de 0,5 μM) e outra placa com 20 μL de solução estoque de hidroxiureia 1 M (consulte a Tabela de Materiais) (concentração final de 5 mM) para induzir o estresse de replicação. Adicione DMSO aos dois pratos restantes para servir como controles.
  3. Após 24 h de tratamento, descarte os meios de cultura. Uma placa de 6 cm normalmente produz aproximadamente 2 x 106 células a 60% -70% de confluência.
  4. Lave cada prato 2x com 5 mL de 1x PBS gelado. Use raspadores de células para separar as células e transferir a suspensão celular para quatro tubos individuais de 1,5 mL. Pipete suavemente para cima e para baixo com uma pipeta P1000 para dissociar quaisquer aglomerados de células.
  5. Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C e, em seguida, rejeitar o sobrenadante. Coloque as células no gelo.

2. Fracionamento subcelular

  1. Ressuspenda o pellet celular em 500 μL de tampão A frio recém-preparado (consulte a Tabela 1), garantindo a dissociação completa dos aglomerados de células por pipetagem suave.
  2. Incube os lisados no gelo por 5-10 min. Verifique a progressão da lise ao microscópio para garantir a lise celular completa.
    1. Pegue uma pequena alíquota do lisado (cerca de 5 - 10 μL) e coloque-a em uma lâmina de microscópio limpa. Cubra-o com uma lamínula para evitar contaminação.
    2. Use um microscópio óptico com uma ampliação apropriada (por exemplo, 20x - 40x) para visualizar células ou detritos. Compare com uma amostra de controle não lisada para diferenciar entre células intactas e material lisado.
      NOTA: Uma amostra devidamente lisada não terá contornos celulares distintos, apenas cromatina difusa ou material celular. Ajuste o foco para observar claramente o lisado. Se necessário, aplique força mecânica durante a etapa de lise, como usar um homogeneizador Dounce, ao trabalhar com certos tipos de células.
  3. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C, uma vez que as células estejam completamente lisadas. Descarte cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda o pellet de núcleos em 500 μL de tampão A frio usando pontas de pipeta de orifício largo.
    NOTA: As pontas de orifício largo ajudam a minimizar as forças de cisalhamento e protegem amostras delicadas como a cromatina. Faça pontas largas cortando a extremidade das pontas padrão com uma lâmina afiada.
  4. Centrifugue a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte cuidadosamente o sobrenadante.
  5. Pré-aqueça uma incubadora a 37 °C e prepare um tampão de parada (100 mM EDTA, pH 8,0; Tabela 1).
  6. Otimize as concentrações de nuclease microcócica (MNase, consulte a Tabela de materiais) e os tempos de incubação com antecedência.
    1. Divida 40 μL de amostra de cromatina de teste em várias alíquotas iguais para testar diferentes concentrações de MNase e tempos de incubação.
    2. Use uma variedade de concentrações de MNase (por exemplo, 0,0625 U, 0,125 U, 0,25 U, 0,5 U, 1 U, 2 U, 4 U, 8 U por reação) e teste vários tempos de incubação (por exemplo, 2, 5, 10 e 15 min).
    3. Adicione o tampão MNase (consulte a Tabela 1) contendo várias concentrações de MNase às alíquotas da cromatina e incube as amostras a 37 ° C pelos tempos especificados.
    4. Termine a reação adicionando 1/4 do volume de tampão de parada (concentração final: 20 mM EDTA) imediatamente após o tempo de incubação desejado.
    5. Isole o ADN das amostras de cromatina digeridas utilizando um método de extracção por fenol/clorofórmio/álcool isoamílico.
    6. Execute o DNA extraído em um gel de agarose a 1,5% para visualizar os padrões de digestão: A subdigestão mostrará bandas de alto peso molecular (Figura 2, pista 1-4); a digestão excessiva resultará em um esfregaço ou fragmentos muito curtos (Figura 2, pista 6-8), e a digestão ideal produzirá um padrão claro de escada nucleossômica (Figura 2, pista 5, por exemplo, mono, di, trinucleossomos).
    7. Identifique as condições que produzem a resolução nucleossômica desejada sem digestão excessiva.
      NOTA: CaCl2 atua como um cofator para a atividade da MNase. Otimize a digestão ajustando a concentração de CaCl2 entre 1 mM e 5 mM.
  7. Ressuspenda suavemente os núcleos intactos com 100 μL de tampão MNase pipetando 5 a 10 vezes com pontas de orifício largo. Adicione imediatamente a quantidade pré-determinada de MNase às amostras (1,25 U MNase/100 μL de tampão MNase).
    NOTA: Ao trabalhar com várias amostras, digerir cada uma individualmente para evitar a digestão excessiva.
  8. Coloque os tubos em um rotador e incube por 5 min a 37 °C. Retorne imediatamente os tubos ao gelo e termine a digestão da MNase adicionando EDTA a uma concentração final de 20 mM e misture por vórtice.
  9. Adicione 500 μL de tampão B (consulte a Tabela 1) a cada amostra e misture bem pipetando para cima e para baixo 5x - 10x. Solubilize as proteínas incubando no gelo por 5 min.
    NOTA: O sal e o detergente no tampão B ajudam a dissociar as proteínas fracas ligadas à cromatina e expor os epítopos para imunoprecipitação.
  10. Granular o material insolúvel centrifugando à velocidade máxima durante 5 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante transparente para novos tubos de 1,5 mL rotulados como a fração nativa da cromatina. As amostras podem ser armazenadas a -80 °C ou usadas para validar a eficiência da fragmentação da cromatina.
    NOTA: Evite ciclos frequentes de congelamento e descongelamento, pois eles podem interromper as interações proteína-DNA de interesse. Minimize os ciclos de congelamento e descongelamento sempre que possível.

3. Verificação da fragmentação da cromatina

  1. Alíquota de 10 μL do sobrenadante de cada amostra em um novo tubo de 1,5 mL. Misture com 20 μL de água destilada e 30 μL de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1).
  2. Feche bem os tubos e vortex vigorosamente por 15-30 s. Centrifugue a 20.000 x g (ou a velocidade máxima da centrífuga) por 10 min a 4 °C. Após a centrifugação, três camadas distintas serão observadas: uma camada superior clara, uma camada intermediária branca e uma camada inferior amarela.
  3. Transferir cuidadosamente 20 μL da fase aquosa superior (contendo ADN) para um tubo novo. Separe o DNA purificado em gel de agarose a 1,5% por 30 min a 100 V e visualize os padrões de digestão. Certifique-se de que o tamanho dos fragmentos de cromatina esteja principalmente entre 200 e 1000 pares de bases.
    NOTA: Os tamanhos adequados dos fragmentos de cromatina são cruciais para o sucesso do ChIP nativo e dependem das condições de tratamento da MNase, incluindo unidades enzimáticas, tempo de incubação e concentração de CaCl2. A eficiência da digestão da MNase também pode variar de acordo com o tipo e o número de células. O padrão de fragmentação da cromatina mostrado na Figura 2 (pista 5) é recomendado para este ensaio ChIP.

4. Imunoprecipitação

  1. Alíquota de 20 μL de cromatina digerida de cada amostra em um tubo fresco de 1,5 mL e misture com 180 μL de tampão de eluição (consulte a Tabela 1). Rotule esses tubos como amostras de entrada e armazene a -20 °C.
  2. Transfira 400 μL de amostra de cromatina para outro tubo de 1,5 mL para ChIP.
  3. Adicione o anticorpo γH2A.X (consulte a Tabela de Material) a uma amostra tratada com DMSO, uma amostra tratada com afidicolina e uma amostra tratada com hidroxiureia. Adicione a mesma quantidade de IgG normal (consulte a Tabela de Materiais) a outra amostra tratada com DMSO como um controle negativo para o ensaio ChIP.
    NOTA: Aqui, 1 μg de anticorpo primário é normalmente usado para 400 μL de cromatina (ou seja, a concentração final do anticorpo é de 2,5 μg/mL). No entanto, a quantidade ideal deve ser determinada empiricamente para diferentes anticorpos γH2A.X.
  4. Colocar os tubos ChIP num rotador a 4 °C e incubar durante pelo menos 5 h, ou de preferência durante a noite.
  5. Enquanto isso, alíquota de 100 μL de grânulos magnéticos de proteína A/G de grau ChIP (consulte a Tabela de Material) em um novo tubo de 1,5 mL. Use pontas de orifício largo e pipete lentamente para garantir a medição precisa dos grânulos. Coloque o tubo em um suporte magnético por pelo menos 1 min e, em seguida, descarte cuidadosamente o líquido.
  6. Ressuspenda os grânulos em 1 mL de 1x PBS contendo 0,5% de BSA. Girar a 4 °C durante cerca de 4 h. Coloque o tubo em um suporte magnético por pelo menos 1 min e descarte o sobrenadante.
  7. Lave as esferas novamente com 1 mL de 1x PBS contendo 0.5% de BSA. Coloque o tubo no suporte magnético por 1 min para pellet as esferas magnéticas e, em seguida, descarte o sobrenadante.
    NOTA: As etapas 4.5 a 4.7 são o pré-revestimento de grânulos para reduzir a ligação não específica de anticorpos aos grânulos magnéticos.
  8. Ressuspenda os grânulos pré-revestidos em 100 μL de tampão B usando pontas de orifício largo. Adicione 25 μL da suspensão de esferas magnéticas pré-revestidas a cada tubo de amostra ChIP. Girar a 4 °C durante 2 h.
  9. Coloque os tubos ChIP no suporte magnético e espere até que as esferas estejam completamente presas à lateral do tubo e a solução fique transparente.
  10. Descarte o sobrenadante transparente sem perturbar as esferas magnéticas. Ressuspenda os grânulos com 1 mL de tampão de lavagem (consulte a Tabela 1) e gire a 4 ° C por 10 min.
  11. Coloque os tubos de volta no suporte magnético e espere até que a solução fique clara. Descarte o tampão de lavagem. Repita a lavagem para um total de quatro lavagens.
  12. Rejeitar o tampão de lavagem após a lavagem final e centrifugar brevemente os tubos a 400 x g durante 30 s a 4 °C para centrifugar qualquer líquido residual. Coloque os tubos de volta no suporte magnético e remova cuidadosamente qualquer líquido restante do fundo do tubo.

5. Eluição e precipitação de DNA

NOTA: A eficiência do anticorpo pode variar entre os diferentes lotes. É importante confirmar a afinidade de ligação de um novo anticorpo verificando as amostras imunoprecipitadas por meio da análise de Western blot.

  1. Verifique a eficiência de pulldown do anticorpo ChIP usando Western blot (WB) conforme descrito abaixo.
    1. Pegue uma pequena alíquota da amostra ChIP para análise (ou seja, geralmente 10% da amostra ChIP). Inclua cromatina de entrada (pré-imunoprecipitação) e controle negativo (por exemplo, IgG pull-down) para comparação.
    2. Eluir proteínas dos grânulos ligados a anticorpos aquecendo em 20 μL de tampão de carregamento 1x SDS-PAGE (consulte a Tabela de Material) a 95 ° C por 5 min.
    3. Carregue as amostras IP, entrada e controles em um gel SDS-PAGE de 15%. Execute o gel.
    4. Transfira as proteínas para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 μm (consulte a Tabela de Materiais) ou PVDF usando um sistema de transferência úmido ou semi-seco.
    5. Bloqueie a membrana com 5% de leite desnatado ou BSA em TBST (consulte a Tabela 1) por 1 h em temperatura ambiente para evitar ligação inespecífica.
    6. Incubar a membrana com o anticorpo primário contra o γH2A.X (consulte a Tabela de Materiais) diluído em tampão de bloqueio por 1-2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
    7. Lave a membrana 3x com TBST para remover anticorpos não ligados. Incubar a membrana com um anticorpo secundário conjugado com HRP (consulte a Tabela de Materiais) por 1 h à temperatura ambiente. Lave a membrana novamente para remover o excesso de anticorpos secundários.
    8. Desenvolva a membrana usando um substrato quimioluminescente e visualize o sinal com um gerador de imagens. Compare a intensidade do sinal entre as pistas IP, de entrada e de controle para avaliar a eficiência e a especificidade do pull-down.
      NOTA: Uma banda correspondente à proteína-alvo na faixa IP confirma o pull-down bem-sucedido do anticorpo. Essa abordagem garante que você possa avaliar a eficácia do anticorpo na captura da proteína-alvo durante o experimento ChIP.
  2. Adicione 50 μL de tampão de eluição (consulte a Tabela 1) a cada uma das amostras ChIP restantes. Coloque os tubos em um termomixer e agite por 15 min em temperatura ambiente.
  3. Coloque os tubos no suporte magnético por pelo menos 1 min. Colete o eluidor em novos tubos. Repita 1x e colete o eluidor nos mesmos tubos.
  4. Adicione 100 μL adicionais de tampão de eluição a cada amostra de eluição ChIP e 180 μL de tampão de eluição a cada amostra de entrada.
  5. Adicione 200 μL de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) a cada amostra e vortex vigorosamente. Centrifugue as amostras a 20.000 x g (ou velocidade máxima) por 10 min a 4 °C.
  6. Adicione 19 μL de acetato de sódio 3M (NaOAc, pH 5,2; consulte a Tabela 1) e 2 μL de solução de glicogênio (20 mg/mL, consulte a Tabela de Material) a cada novo tubo de centrífuga de 1,5 mL.
  7. Após centrifugação, transferir cuidadosamente a camada aquosa superior (cerca de 190 μl) para os tubos que contêm NaOAc e glicogénio e misturar por vórtice.
  8. Adicione 500 μL de etanol 100% e vórtice. Precipitar o ADN incubando as amostras a -20 °C durante, pelo menos, 2 h ou durante a noite.
  9. Centrifugue os tubos a 20.000 x g (ou velocidade máxima) por 10 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet branco. Ressuspenda o pellet em 1 mL de etanol a 70% e vortex completamente.
  10. Centrifugue os tubos a 20.000 x g (ou velocidade máxima) por 5 min a 4 °C. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Centrifugue brevemente os tubos novamente para girar qualquer etanol residual. Remova cuidadosamente o etanol usando uma pipeta P20. Seque ao ar os pellets de DNA por 2-3 min.
    NOTA: Evite secar demais o pellet, pois isso pode dificultar a redissolução do DNA.
  11. Para amostras de ChIP, ressuspenda o DNA em 400 μL de tampão TE (consulte a Tabela 1). Para DNA de entrada, ressuspenda em 1000 μL de tampão TE. As amostras eluídas agora podem ser armazenadas a -20°C.

6. Quantificação de qPCR

  1. Realize qPCR usando um kit comercial (consulte a Tabela de Material) com triplicados técnicos para cada amostra. Confirme a presença de um único produto específico de PCR realizando uma análise da curva de fusão para garantir a especificidade da amplificação36.
  2. Análise de dados
    NOTA: Na análise de quantificação relativa, a amostra de teste é expressa como uma mudança de dobra em relação a uma amostra de controle (imunoprecipitada usando IgG purificada normal ou IP simulado). Os loci de DNA conhecidos por não serem ocupados pela proteína imunoprecipitada (locus negativo) podem ser usados dessa maneira como um gene de referência em comparação com loci de DNA de controle positivo conhecidoe ocupado 36.
    1. Calcule a porcentagem de entrada para cada ChIP usando a fórmula abaixo
      %Entrada = 2(-ΔCt [ChIP normalizado])
    2. Normalize os valores de ΔCt do locus positivo para locus negativo (ΔΔCt) subtraindo o valor de ΔCt obtido para o locus positivo do valor de ΔCt para o locus negativo usando a fórmula abaixo
      (ΔΔCt = ΔCtpositivo - ΔCtnegativo)
    3. Calcule o enriquecimento de dobras da sequência do locus positivo no DNA do ChIP sobre o locus negativo usando a fórmula abaixo
      Enriquecimento de dobras =2ΔΔCt
      As sequências dos primers de qPCR usados para análise são fornecidas na Tabela 2. A organização genômica de FRA3B e FRA16D37é representada na Figura 3A,B.
  3. Análise estatística
    1. Analise os resultados estatisticamente usando o teste t pareado de Student. Um valor de p de ≤0,05 é considerado estatisticamente significativo, indicando que as diferenças observadas provavelmente não são devidas à variação aleatória38.

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Resultados

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O tamanho dos fragmentos de cromatina é crucial para o sucesso do Native ChIP, pois afeta diretamente a acessibilidade das regiões de DNA para ligação de anticorpos. Para determinar a concentração ideal de MNase para fragmentação da cromatina, preparamos uma série de tubos de microcentrífuga contendo concentrações variadas de MNase (ou seja, 0,0625 U, 0,125 U, 0,25 U, 0,5 U, 1 U, 2 U, 4 U, 8 U por reação) e 40 μL de núcleos isolados. Cada reação foi incubada a 37 ° C por 5 min para atingir uma variedade de tamanhos de fr...

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Discussão

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A poluição ambiental é um contribuinte significativo para o câncer humano. Muitos poluentes são cancerígenos, ou seja, podem causar danos genéticos que levam ao desenvolvimento de câncer40,41. No entanto, determinar se uma determinada substância é tumorigênica é uma tarefa desafiadora. Um método rápido, confiável e econômico para identificar o potencial cancerígeno capacitaria os cientistas a rastrear com eficiência os poluentes ...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo financiamento inicial da Universidade do Sul da China.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,2 µ membrana de nitrocelulose mAmersham10600011
Actina BProteinTech20536-1-AP
AfidicolinaMedChemExpressHY-N6733
Grânulos magnéticos de proteína A / G de grau ChIPThermoFisher26162
Substrato Clarity Western ECLBio-Rad#1705061
Glicogênio, grau de biologia molecularThermoFisherGato. Não.  R0561
Anticorpo secundário conjugado com HRP ProteinTechSA00001-2
hidroxiureia MedChemExpressHY-B0313
Nuclease Microcócica NEBM0247S
IgG normal Santa CruzSC-2025
Taq Universal SYBR Green Supermix BioRad1725120
&gama; H2A. anticorpo X  (para ChIP)Sigma-Aldrich05-636
&gama; H2A. X (para WB)Sinalização Celular#25955

Referências

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