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Artigo de método

Mapeamento mecânico de esferoides usando espectroscopia de Brillouin

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DOI:

10.3791/67538

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12 de dezembro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for the Cellular Microenvironment, Advanced Research Centre, 11 Chapel Lane, University of Glasgow, 2LightMachinery Inc.

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve um protocolo para caracterização mecânica de esferoides vivos dentro de uma matriz 3D usando a microespectroscopia de Brillouin. Esse método totalmente óptico permite a visualização de esferoides com resolução em microescala e propriedades mecânicas quantitativas. Essa abordagem tem implicações para a fenotipagem mecânica; por exemplo, determinar estados patológicos de esferoides tumorais em um microambiente 3D.

Resumo

A espectroscopia de Brillouin, uma técnica emergente que ganha grande interesse na ciência biomédica, permite que pesquisadores coletem informações relacionadas à mecânica e à estrutura ao questionar as propriedades viscoelásticas e arquitetônicas dos espasmes de maneira não destrutiva e sem contato. Essa abordagem avalia as propriedades mecânicas das amostras 3D medindo a interação da luz visível com ondas/fônons acústicos induzidos termicamente. As informações que a espectroscopia de Brillouin fornece têm potencial para avaliação in vivo da biofísica e possível diagnóstico de patologias de doenças. Uma vantagem significativa da espectroscopia Brillouin é a capacidade de avaliar a mecânica em microescala dentro de uma amostra biológica; outras técnicas convencionais que podem alcançar essa resolução, como a microscopia de força atômica, só podem sondar amostras em 2D, pois requerem contato direto. Este trabalho descreve a aplicação da microespectroscopia de Brillouin para investigar a biomecânica de esferoides vivos embutidos em uma matriz hidrogel 3D. O encapsulamento de esferoides celulares em um microambiente 3D estabelece um sistema esferoide que recapitula de perto a interface entre as células e a matriz extracelular in vivo. Em nosso protocolo, descrevemos a preparação de amostras esferoides e as medições dos espectros de Brillouin com imagens sequenciais de fluorescência. Além disso, discutimos procedimentos para análise de dados espectrais e detalhes técnicos sobre o sistema óptico.

Introdução

Cultivar células em modelos 3D é vantajoso em comparação com os métodos típicos de cultura celular 2D, pois recapitula melhor estruturas tecituais e interações célula-célula encontradas in vivo. Esferoides são agregados celulares 3D que facilitam interações complexas célula-célula; Essas interações são comprometidas em células cultivadas como uma monocamada em plástico de cultura tecidual. Esferoides podem ser cultivados dentro de um andaime que imita o microambiente de onde a célula se originou. Por exemplo, hidrogéis são um biomaterial popular usado para cultivar células/esferoides, pois permitem o controle preciso de parâmetros como rigidez, degradabilidade, tamanho dos poros e a incorporação de fatores decrescimento 1 (Figura 1A). Sinais mecânicos frequentemente precedem mudanças bioquímicas em patologias de doenças, como câncer efibrose 2,3, portanto, adquirir a assinatura biomecânica em modelos 3D clinicamente relevantes de doenças é fundamental para desenvolver intervenções diagnósticas que informem a prática terapêutica e compreendem a fisiopatologiasubjacente 4.

A Microscopia de Brillouin (BM) é uma técnica de imagem que permite medir as propriedades mecânicas de materiais biológicos em planos2D 5,6,7. A BM possui algumas vantagens importantes em relação a outros métodos mais comumente utilizados, como a microscopia de força atômica (AFM) e a elastografia. Está bem documentado que a AFM pode alcançar alta resolução mecânica espaço-temporal e que a elastografia pode sondar a mecânica dentro de amostras 8,9. A BM não requer contato direto com o material em investigação, tornando-a uma técnica ideal em relação à AFM para amostras/células de difícil acesso, como esferoides dentro de hidrogéis. Outra vantagem importante do BM é que não exige rotulagem das amostras e pode fornecer resolução em microescala dentro de amostras biológicas, o que métodos de elastografia comumente usados não conseguemalcançar 7; Técnicas mais avançadas de elastografia óptica podem operar em resoluçãomicroescala 10. Deve-se notar que a resolução efetiva precisa na imagem de Brillouin de amostras biológicas heterogêneas não é trivial de definir. Primeiramente, para um dado comprimento de onda de iluminação, depende das propriedades ópticas que descrevem o tamanho do ponto focal (abertura numérica, NA, da lente objetiva e opacidade da amostra). Além disso, a precisão com que as propriedades mecânicas da amostra podem ser investigadas, assim como a forma do espectro de Brillouin, é influenciada pelas características acústicas do material (comprimento de onda dos fônons e comprimento de propagação)11,12. O fenômeno subjacente à espectroscopia de Brillouin é o espalhamento de Brillouin, onde a luz laser monocromática incidente interage com fônons acústicos espontâneos e termicamente induzidos dentro do meio biológico. Isso resulta em espalhamento inelástico da luz e (deslocamento de frequência de Brillouin, BFS) na Figura 1B e tipicamente na ordem de vários GHz e, dependendo se o fóton perde ou ganha energia, os picos de Brillouin Stokes e anti-Stokes são detectados, respectivamente, no espectro da luz espalhada. Por sua dependência da velocidade sonora local no meio, o BFS está relacionado ao módulo longitudinal elástico, que por sua vez está empiricamente correlacionado com o módulo de Young 7,13; no entanto, é preciso ter cuidado ao fazer comparações entre esses módulos, pois (i) eles não estão diretamente relacionados entre si, (ii) o módulo de Young geralmente está na faixa Pa-kPa para amostras biológicas e matéria mole, enquanto o módulo longitudinal obtido de Brillouin está na faixa GPa, e (iii) parâmetros como mudanças no índice de refração e densidade do material devem ser levados emconta 7. A largura de linha de Brillouin (na Figura 1B) é outra medida obtida a partir do BM. Está relacionado ao módulo de perda longitudinal, fornecendo insights sobre a viscosidade da amostra; Essas propriedades podem ser correlacionadas com a viscoelasticidade14. Assim, a BM permite a avaliação das propriedades viscoelásticas, onde um BFS maior implica um material mais rígido, e uma largura de linha maior implica um material mais viscoso (Figura 1B). Deve-se notar que o espalhamento elástico (de Rayleigh), onde os fótons não sofrem um deslocamento de frequência, tem uma probabilidade significativamente maior de ocorrer em comparação com o espalhamento de Brillouin. Portanto, espectrômetros de Brillouin devem estar equipados para suprimir o sinal de Rayleigh.

A BM tem sido usada para caracterizar as propriedades mecânicas de diversos tecidos, biomateriais e modelos de cultura celular 3D. Por exemplo, a BM foi utilizada para diferenciar entre melanoma e o tecido saudável ao redor, mostrando que o tecido não cancerígeno era significativamente mais macio que omelanoma 15. Rad et al. mostraram que o aumento da concentração polimérica dos hidrogéis resultava em aumento do BFS e da largura da linha. Nas menores concentrações de polímeros, hidrogéis com células apresentaram diminuições maiores nas variações de frequência de Brillouin ao longo de sete dias em comparação com hidrogéis vazios, o que foi proposto como resultado da remodelação celular do hidrogel. Isso não foi observado em 10% de concentração de polímero, o que ressaltou uma possível falta de viabilidade celular encontrada nesseshidrogéis 16.

De maior relevância para o presente estudo, o BM tem sido usado para investigar as propriedades mecânicas dosesferoides 17,18,19,20. Em particular, o efeito do microambiente local na mecânica esferoide pode ser detectado usando o BM20. Comparados aos esferoides tumorais cultivados em hidrogéis complacentes, os esferoides cultivados em hidrogéis rígidos apresentaram um BFS mais alto, o que indica um aumento do móduloelástico 20. Variações espaciais das propriedades mecânicas dentro de um esferoide também podem ser caracterizadas com BM. Por exemplo, foi constatado que o BFS dos esferoides tumorais aumenta em direção ao núcleo esferoide20,21. Além disso, uma diminuição do BFS correlaciona-se com o aumento da invasividade dos esferoidestumorais 20. A BM tem sido usada para investigar as alterações mecânicas dos esferoides tumorais em resposta ao choqueosmótico 22. No estudo, o crescimento dos esferoides foi monitorado ao longo de 5 dias, descobrindo que as diferenças mecânicas iniciais entre câncer e esferoides saudáveis observadas com a evacuação foram perdidas com o tempo. Outro estudo encontrou um aumento na BFS do esferoide após 7 dias, atribuído ao aumento do tamanho do esferoide e do número decélulas 16.

Além disso, investigações multimodais, empregando microscopia de Brillouin juntamente com AFM e reologia, foram realizadas para investigar as propriedades mecânicas de células ehidrogéis 16,23,24. Rad et al. usaram reologia para contextualizar as tendências medidas com BM, estabelecendo uma forte correlação positiva entre o módulo longitudinal e o módulo de cisalhamento de armazenamento em relação à concentração polimérica doshidrogéis 16. Microscopia de Brillouin e micro-reologia óptica com pinça foram usadas para medir a mecânica das células cancerígenas cultivadas em hidrogéis3D 23. Neste estudo, foi encontrada uma diminuição da heterogeneidade mecânica entre células em esferoides em comparação com células individuais cultivadas em suspenso em hidrogéis.

Neste trabalho, é detalhado um protocolo para investigar as propriedades mecânicas de esferoides vivos embutidos em hidrogéis com um microscópio Brillouin comercial (Figura 1). Berghaus et al. descreveram um protocolo detalhando os passos para construir um espectrômetro Brillouin de alta resolução e um método para calibrá-lo com materiaisde referência 25. Além disso, um protocolo de Shi et al. descreve o uso da microscopia de Brillouin para monitorar as mudanças nas propriedades mecânicas do tecidoembrionário 26. Utilizamos esferóides de células-tronco mesenquimatosas (MSCs) em hidrogéis de polietileno glicol (PEG)-maleimida para imitar o nicho da medula óssea e investigar as propriedades mecânicas desse ambiente. Esse modelo 3D tem potencial para revelar a assinatura mecânica de doenças da medula óssea, incluindo leucemia, mieloma múltiplo e câncer ósseo secundário. Portanto, o protocolo é diretamente transferível para modelos 3D de outras doenças onde a mecanobiologia interrompida pode ter um papel importante na patologia. As técnicas de preparação esferoide e hidrogel, imagem por fluorescência e microscopia Brillouin são detalhadas. Os procedimentos recomendados, possíveis desvantagens e possíveis melhorias na técnica são discutidos. A descrição detalhada do setup experimental é apresentada na Figura S1 e na seção de Materiais e Métodos Suplementares relacionados ao setup experimental.

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Protocolo

1. Cultura celular 2D

NOTA: Sempre que possível, certifique-se de que todo o trabalho de cultura celular seja realizado em um ambiente estéril usando um capela padrão de fluxo laminar para cultura de tecidos para evitar contaminação. MSCs foram usados no protocolo atual, mas outros tipos celulares podem ser utilizados para criar esferoides, dependendo dos objetivos específicos do estudo.

  1. Cultive MSCs em meio de cultura celular Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco, com volume suficiente para cobrir as células, contendo 4,5 g/L de D-Glicose, + L-Glutamina suplementada com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 μM de piruvato de sódio, 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA), 1% de penicilina e estreptomicina. Incubar células a 37 °C e 5% de CO2.
  2. Células de passagem em confluência de 70-80%, incubando com ácido etilenediaminênico (EDTA) a 0,05% de tripsina (o volume de tripsina adicionado deve ser 1/3 do volume do DMEM) por 3 minutos a 37 °C e 5% deCO-2 para desprender as células da placa. Para interromper a reação, adicione um meio de cultura contendo FBS (pelo menos igualando o volume de tripsina adicionada). Conte células usando um hemocitômetro.

2. Preparação dos esferoides

NOTA: Sempre que possível, certifique-se de que todo o trabalho de cultura celular seja realizado em um ambiente estéril usando um capela padrão de fluxo laminar para cultura de tecidos para evitar contaminação. Neste estudo, placas de micropoços foram usadas para criar esferoides MSC. Essas placas são compostas por 24 poços, e cada poço contém 1200 micropoços, com 400 μm de diâmetro. Isso permite a preparação de um grande número de esferoides (Figura 2).

  1. Para preparar a placa do micropoço, pré-trate os poços adicionando 500 μL de solução antiaderente de enxágue a cada poço. Placa da centrífuga a 1.300 g por 5 minutos em temperatura ambiente. Sob um microscópio com ampliação 20x, verifique se há bolhas de ar presentes. Se houver, repita a etapa da centrifugação. Remova a solução antiaderente.
  2. Para lavar a placa, adicione 1 mL de soro salino tamponado com fosfato (PBS) e aspire. Faça isso duas vezes para garantir que a solução de enxágue tenha sido completamente removida.
  3. Determine o número de células por esferoide e o número de esferoides por gel. Isso vai depender das perguntas individuais de pesquisa. Por exemplo, usamos 100 células por esferoide e 100 esferoides por gel. Portanto, para esse protocolo, apenas um poço da placa do micropoço era necessário, pois isso cria 1200 esferoides no total. Para calcular o número de células necessárias para um poço, fizemos o seguinte cálculo: 1200 x 100 = 1,2 x 105. Calcule o volume da suspensão de células contendo 1,2 x 105 células. Centrifuge a suspensão da célula a 300 g por 5 minutos em temperatura ambiente e remova o sobrenadante.
  4. Resuspenda as células em 1 mL de DMEM (+4,5 g/L D-Glicose, + L-Glutamina) suplementado com 100 μM de piruvato de sódio, 1% de NEAA, 1% de penicilina e estreptomicina. Adicione 1 mL de suspensão celular a um poço da placa do micropoço e pipeteie suavemente para cima e para baixo para dispersar as células uniformemente por todo o poço. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar. Centrifuge a placa a 100 g por 3 minutos em temperatura ambiente.
    NOTA: Neste momento, não adicionamos FBS à mídia. Isso serve para evitar que as células se atenham ao plástico da cultura tecidual.
  5. Observe a placa sob o microscópio para garantir que as células estejam distribuídas uniformemente e tenham afundado no fundo dos micropoços. Incubar células a 37 °C e 5% de CO2. Observe a formação esferoide 24 horas depois.
    NOTA: Esferoides podem ser deixados na placa por até 48 horas, dependendo do tipo de célula e da compacidade desejada do esferoide.
  6. Para colher os esferoides da placa, primeiro remova lentamente e suavemente o meio cultural, com o objetivo de não perturbar os esferoides. Para evitar que os esferoides grudem em plásticos, cubra as pontas e tubos das pipetas usando PBS com 1% de FBS. Para evitar que os esferoides fiquem presos nas pontas da pipeta, corte a ponta para alargar a abertura. Ponteiras de recuperação máxima podem ser usadas durante essas etapas como uma medida extra para evitar a perda dos esferoides. Adicione 500 μL de PBS a cada poço da placa do micropoço e pipete para cima e para baixo para desalojar esferoides. Colete o PBS com esferoides suspensos em um tubo (Figura 2).
  7. Observe a placa ao microscópio com ampliação 20x e repita essa etapa até que a maioria dos esferoides tenha sido removida com sucesso.
  8. Para contar o número de esferoides na suspensão, transfere-se 50 μL da suspensão para um poço de uma placa de 96 poços. Conte o número de esferoides nos 50 μL. Para facilitar a contagem, uma cruz pode ser desenhada no fundo do poço usando um marcador permanente. Calcule o número de esferoides usando a equação (1):
    figure-protocol-1

3. Preparação de hidrogéis PEG

NOTA: Sempre que possível, certifique-se de que todo o trabalho de cultura celular seja realizado em um ambiente estéril usando um capela padrão de fluxo laminar para cultura de tecidos para evitar contaminação. Neste estudo, hidrogéis PEG-maleimida foram utilizados, mas outros tipos também podem ser utilizados. Hidrogéis PEG-maleimida foram formados usando a reação de adição tiol-Michael27. Os reticuladores utilizados eram uma mistura de PEG-ditiol e peptídeo degradável por protease, ladeados por dois resíduos de cisteína (peptídeo VPM, GCRDVPMSMRGGDRCG). Os géis do presente estudo usaram 70% de PEG-ditiol e 30% de peptídeo VPM degradável.

  1. Prepare uma solução de 200 mg/mL de peptídeo VPM e adicione 2,4 μL de peptídeo por gel. Faça uma solução de estoque de 200 mg/mL de PEG-ditiol e adicione 5,6 μL por gel.
  2. Resuspenda os esferoides em PBS antes de misturar com os reticuladores (Figura 2). Misture a suspensão esferoide com o PEG-ditiol (5,6 μL por gel) e o VPM (2,4 μL por gel). Essa solução é chamada de Solução B.
    NOTA: Neste protocolo, 100 esferoides foram adicionados por gel.
  3. Faça uma solução de estoque de 250 mg/mL de PEG-Maleimida. Adicione 50 μg de fibronectina por gel. Misture a solução de PEG-Maleimida e fibronectina; isso é chamado de Solução A. Solução de Pipeta A (40,3 μL para géis de 100 μL) no fundo de uma placa de cultura de tecido com 12 poços. Adicione a Solução B (59,7 μL para géis de 100 μL) com uma razão molar de 1:1 maleimida:tiol para garantir a reticularidade total; Certifique-se de que a gelificação ocorra instantaneamente. O volume final dos hidrogéis é de 100 μL.
  4. Incube os géis por 30 minutos a 37 °C e 5% de CO2 para permitir a gelificação. Adicione meio de cultivo completo (DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 μM de piruvato de sódio, 1% de NEAA e 1% de penicilina e estreptomicina) ao poço, garantindo que o gel fique totalmente submerso (Figura 2). Incube o gel a 37 °C e 5% deCO2 até estar pronto para fazer medições no microscópio Brillouin.
    NOTA: A duração da cultura esferoide nos hidrogéis antes das medições de Brillouin dependerá do tipo celular e da questão da pesquisa. Por exemplo, neste estudo, os esferoides são tipicamente cultivados dentro de hidrogéis por até 7 dias, durante os quais são monitorados por microscopia Brillouin. As propriedades viscoelásticas dos hidrogéis com ou sem encapsulamento esferoide foram caracterizadas e não mostraram impacto significativo dos esferoides na mecânica dos gels (Figura S2).

4. Coloração por fluorescência e imagem de esferóides em hidrogéis

NOTA: Neste estudo, núcleos celulares e filamentos de actina que compõem o citoesqueleto foram corados fluorescentemente e imagens antes das medições de Brillouin.

  1. Para colorir a actina, adicione a coloração de actina viva ao meio de cultivo com diluição de 1 em 500, 3 horas antes da imagem. Mantenha a amostra fora da luz envolvendo em papel alumínio. Incube o gel a 37 °C e 5% de CO2.
  2. Para colorir os núcleos, adicione 2 gotas/mL de coloração nuclear viva ao meio de cultura ao redor do gel 40 minutos antes da imagem. Devolva as amostras para a incubadora.
  3. Adquira imagens de fluorescência o mais rápido possível após o tempo de incubação da coloração estar concluído. Verifique se o caminho óptico apropriado (expor a câmera do microscópio) e a posição correta da roda do filtro foram selecionados. Diminua as luzes do quarto e capture o fundo. Ligue a fonte de luz de diodo emissor de luz (LED) e escolha o comprimento de onda dependendo do protocolo de coloração (aqui, 385 nm foi usado para núcleos e 621 nm para imagem de actina). Adquira imagens fluorescentes de esferoides com ampliação de 20x com o software preferido. Desligue a fonte de LED quando terminar.

5. Microscopia de Brillouin de esferoides

  1. Ligar os dispositivos e emissão a laser
    1. Ligue os dispositivos: computador, espectrômetro, câmeras do microscópio, microscópio, o ventilador de resfriamento a laser e a emissão de laser ligando a chave do controlador. Certifique-se de que isso seja feito 15 minutos antes da otimização do espectrômetro para garantir que o laser tenha se termalizado. Verifique se a potência do laser emitida está conforme o esperado com um medidor de potência (100 mW em nosso experimento).
  2. Ligue a aplicação de controle de temperatura (veja Tabela de Materiais) e verifique se a temperatura do etalon está otimizada medindo a potência do feixe após o etalon. Se for significativamente menor do que o esperado (considerando o filtro de densidade óptica (OD) utilizado), altere a temperatura alvo em 1 °C e observe se há aumento de potência com o tempo. Se houver uma diminuição, inverta a direção da mudança. Quando a potência estiver próxima do esperado, ajuste em pequenos incrementos (0,1 °C) até atingir o máximo.
  3. Posicionando o ponto focal da lente objetiva dentro do cubo de acrílico
    NOTA: A supressão do espalhamento elástico e do acoplamento do "bombeador" ao espectrômetro é otimizada com uma amostra de material de referência rígido e homogêneo antes de cada experimento. Neste estudo, é utilizado um cubo de acrílico.
  4. Abra o software SpectraLok e espere até que todos os dispositivos sejam detectados. No lado esquerdo da janela principal (Figura 3), selecione a câmera do espectrômetro.
    1. Instale o cubo de acrílico no suporte da amostra do microscópio com o lado transparente voltado para a lente objetiva. Abaixe a lente objetiva o máximo possível e centralize o cubo sob ela. Certifique-se de que o caminho óptico no microscópio seja escolhido para que a câmera do espectrômetro seja exposta (ajuste o seletor de porta rotativa para L).
      NOTA: Em nosso setup, a porta L está conectada ao circulador confocal, enquanto a R está conectada à porta da câmera do microscópio.
    2. Na janela da Câmera SpectraLok, defina o tempo de exposição do sensor para 500 ms e o ganho de software para 100. A configuração de ganho do software só melhora o contraste para fins de visualização.
  5. Destrave o obturador do laser.
    NOTA: Enquanto a emissão do laser está ativada, tome cuidado para nunca colocar cabeça/olhos no caminho do feixe do laser.
    1. Pressione captura e mova a lente objetiva para cima. Haverá um aumento significativo na intensidade do sinal, e um padrão saturado (Figura 4A) aparecerá. Isso é causado por uma forte reflexão da luz laser na interface ar-cubo acrílico. Ao mover a lente mais para cima, a intensidade do sinal diminuirá e os picos de Brillouin se tornarão aparentes. Continue reposicionando a lente objetiva até que a intensidade dos picos de Brillouin seja constante (Figura 4B). Isso corresponde ao ponto focal localizado inteiramente dentro do cubo de acrílico.
  6. Otimização da pressão do etalon para minimizar a luz residual espalhada elasticamente
    NOTA: O objetivo dos passos a seguir é suprimir o sinal de Rayleigh espalhado elasticamente para que apenas a luz de Brillouin deslocada em frequência alcance a câmera do espectrômetro.
  7. No software SpectraLok, abra a janela de controle Pump Killer (PK) (Figura 5).
  8. Aproxime-se de uma das ordens Brillouin mais brilhantes e ajuste a posição do atuador de pressão em incrementos de 100 μm clicando em mover rel para minimizar a intensidade máxima de Rayleigh. Se o sinal de Rayleigh estiver aumentando, inverta a direção da mudança clicando em reverter. Subsequentemente, ajuste finamente a pressão do etalon em incrementos de 10 μm.
    NOTA: No cubo de acrílico, a luz Rayleigh pode ser completamente suprimida; isso pode não ser o caso em uma amostra biológica heterogênea.
  9. Otimização da sobreposição de faixas para "desembrulhar" dados espectrais
    NOTA: O procedimento a seguir garante que as coordenadas de pixels (x, y) do sensor da câmera sejam devidamente mapeadas para o comprimento de onda por meio da aplicação da tabela de consulta LUT.
  10. Na janela da câmera , dê um zoom em um dos pedidos Brillouin.
  11. Pressione s para visualizar as faixas sobre as quais a LUT é aplicada na imagem da câmera (Figura 6A). Abra a janela de Configurações e pressione calibrar rápido para recalcular o deslocamento horizontal ideal das faixas. Se o sensor estiver saturado, reduza o tempo de exposição antes dessa etapa.
    1. Na janela da câmera , verifique se as listras roxas estão bem sobrepostas à região central dos picos de Brillouin (Figura 6B).
  12. Otimizando o acoplamento do espectrômetro PK
  13. O ajuste dos eixos da lente do colimador permite maximizar a eficiência do acoplamento da luz do PK ao espectrômetro.
  14. Abra a janela do espectro e clique em desdobrar para recuperar o espectro (Figura 7).
  15. Abra a janela de controle do PK . Com incrementos de 0,0005°, ajuste iterativamente os eixos do colimador 1 e 2 para maximizar o sinal de Brillouin. Se necessário, o controle de pressão do etalon pode ser ainda mais otimizado. Em um cubo acrílico homogêneo, o sinal de Rayleigh pode ser completamente suprimido (Figura 7A). Embora medições precisas de Brillouin com algum sinal residual de Rayleigh sejam viáveis (Figura 7B), em casos de supressão ruim (Figura 7C), a luz dispersa elasticamente obscurece o sinal de Brillouin.
  16. Verifique se o sinal de Brillouin alcançado é comparável à amplitude de referência. Por exemplo, em nosso sistema, com exposição de 500 ms e com OD 0,3, a amplitude máxima da intensidade de Brillouin é de aproximadamente 3000 contagens. Para salvar as alterações dos parâmetros PK no arquivo de configuração, na janela PK, clique em atualizar tudo e salvar tudo. Além disso, na janela principal, pressione salvar na seção de I/O de arquivo .
  17. Mudando para software de varredura e verificando se os parâmetros ainda estão otimizados
  18. Feche o SpectraLok e abra o software de varredura. No protocolo atual, foi utilizado software baseado em LabVIEW, descrito com mais detalhes na Figura S3. Para definir a geometria da varredura, essa interface proprietária (UI) é usada para controlar a etapa de tradução Prior XY-Z; no entanto, outros métodos podem ser empregados.
    1. Instale a placa de Petri com fundo de vidro com a amostra de hidrogel-esferoide em vez do cubo de acrílico (Figura 8). Para evitar a desidratação do gel, a incubadora é ajustada a 37 °C e 95% de umidade relativa. Remova a tampa da placa de Petri e adicione substrato para submergir o gel. Adicione uma capa de cobertura no topo do gel para evitar o movimento do gel.
    2. Localize o esferoide. Com o feixe de laser bloqueado, mude o caminho óptico do microscópio para a ocular. Ligue a luz branca. Usando o joystick, controle manualmente o estágio de amostra, localize e foque no esferoide.
    3. Adquira uma imagem de campo claro do esferoide. Ajuste o brilho da iluminação girando a roda de controle. Defina o caminho óptico para R, expondo assim a câmera do microscópio. O tempo de exposição pode ser ajustado conforme necessário para obter uma imagem de alto contraste (ou seja, 50 ms).
    4. Verifique se o espectrômetro e os parâmetros de desembrulhar ainda estão otimizados. Ajuste a porta do microscópio para L e capture o fundo com o laser bloqueado. Desbloqueie o laser girando a roda para disparar. Com base na relação sinal-ruído desejada, selecione o tempo de exposição. O tempo de exposição típico dessas medições é de 200-500 ms.
    5. Se algum tempo se passou (ou seja, várias horas) desde a calibração inicial ou houve uma perturbação mecânica do sistema, a configuração de pressão do etalon ou o acoplamento do espectrômetro PK podem não ser mais ideais. Repita os passos 5.3-5.5 para reotimizar o mencionado anteriormente, se necessário.
    6. Do espectro não embrulhado, selecione a linha de ajuste Brillouin peak. Ajuste o valor limiar para cerca de metade da intensidade dos picos de Brillouin. Desconsidere os picos de Brillouin com amplitude abaixo desse limiar. Corrija o comprimento de onda do laser de acordo com todos os pares de picos de Brillouin identificados.
  19. Configuração da geometria de varredura multidimensional
  20. Escolha a geometria de varredura raster ajustando a largura da região de varredura e o tamanho do passo.
    NOTA: Para esferoides de tamanho aproximadamente 70 μm, para varredura de baixa resolução, normalmente usamos uma área de varredura de 150 μm × 150 μm e um passo de 10 μm. Isso resulta em um mapa 2D de baixa resolução em aproximadamente 3,4 min.
    1. Comece a varredura.
  21. Desligando o sistema Brillouin
    1. Feche o software e desligue o computador. Desligue a emissão do laser usando a chave do controle. Deixe a roda do obturador na posição bloqueada . Desligue o resfriamento do ventilador do laser. Desligue as câmeras do microscópio e do espectrômetro. Por fim, desligue o microscópio.

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Resultados

Arquivos obtidos após uma varredura incluem espectros, parâmetros de ajuste de varredura (.csv), parâmetros e análises de varredura, mapas BFS e de largura de linha, imagem de campo claro com a região de varredura de interesse identificada e uma captura de tela da janela da interface. Para cada ponto da varredura de Brillouin multidimensional, obtém-se um valor BFS. Na Figura 9, um exemplo de varredura de alta resolução é exibido junto com a imagem do campo ...

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Discussão

Estabelecemos um protocolo para usar microscopia Brillouin para imagens biomecânicas de esferoides embutidos em hidrogéis com resolução em microescala. O hidrogel pode ser distinguido do esferoide vivo pelas diferenças nos valores de BFS obtidos. Nos resultados representativos, usamos esferoides MSC e hidrogéis PEG-maleimida; no entanto, esse protocolo é amplamente aplicável a outros tipos celulares (por exemplo, linhas celulares cancerígenas). As células deste estudo foram imagens vivas...

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Divulgações

Os autores observam que T. Allen e G. Wardle são funcionários da LightMachinery, que fabrica e vende o espectrômetro Brillouin usado neste estudo. A empresa pode se beneficiar da publicação desta obra. Todos os outros autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

Os autores reconhecem o financiamento obtido da bolsa MechanoMeds Fase 2, UKRI/EPSRC, número EP/X033554/1 para apoiar o desenvolvimento deste método.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PEG-Maleimida de 4 braços (20 kDa)Criativos PEGWorksPSB-455https://creativepegworks.com/product/4-arm-peg-mal-mw-20k
Placas AggreWell 400Tecnologias STEMCELL34411http://stemcell.com/products/aggrewell400.html
Etalon espaçado no arLightMachineryHF-16074-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-spectroscopy-excitation-laser-optimization/
Solução antiaderente de enxágueTecnologias STEMCELL7010https://www.stemcell.com/products/aggrewell-rinsing-solution.html
Incubadora de Estágio Superior Bold LineOkolabH301-NIKON-NZ100/200/500-Nhttps://www.oko-lab.com/live-cell-imaging/stage-top-digital-gas/chamber/nikon/h301-nikon-nz100-200-500-n
Cobolt Flamenco-100 laser 660 nmHuebner0660-05-01-0100-700https://hubner-photonics.com/products/lasers/single-frequency-lasers/05-01-series/
Circulador confocalLightMachineryHF-13311N/A
Sistema de iluminação de fluorescência D-LEDi  NikonMBF83000https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/light-sources/d-ledi
Módulo EPI-FLNikonTi2-LA-FL-3https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/intermediate-modules
Fibronectina (humana)YoProteínas663https://www.yoproteins.com/fibronectin-human-5-mg-663.html
Gibco Dulbecco' s Eagle Medium Modificado (DMEM)ThermoFisher11965092https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965092
Espectrômetro HyperFine BrillouinLightMachineryHF-8999-PK-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-hyperfine-spectrometer/
Cubo de filtro quádruplo de banda LED-DA/FI/TR/Cy5-BNikonMXR00753https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/fluorescent-filter-cubes
Células-tronco mesenquimatosas (MSCs)PromoCellC-12974https://promocell.com/us_en/human-mesenchymal-stem-cells-hmsc.html
Estágio de tradução motorizada  Prior ScientificH117E2NNhttps://www.prior.com/imaging-components/motorized-stages?filter=MicroscopeBrand-33
NucBlue & trade; ReadyProbes e troca ao vivo; reagente (Hoechst 33342)ThermoFisherR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605
Objetivo, S Plan Fluor 20X NA 0,45, arNikonMRH08230https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/selector/comparison/-1708
Câmera CMOS ORCA-FusionHamamatsuC14440-20UPhttps://www.hamamatsu.com/eu/en/product/cameras/cmos-cameras/C14440-20UP.html
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TemperatureAppSoftware de controle de temperatura
Peptídeo VPM, GCRDVPMSMRGGDRCGGenScriptN/AN/A
Microscópio Eclipse Ti-2ANikonEclipse Ti-2Ahttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series 

Referências

  1. Caleb, J., Yong, T. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  2. Walker, M., Gourdon, D., Cantini, M. Beyond static models: mechanically dynamic matrices reveal new insights into cancer and fibrosis progression. Curr Opin Biomed Eng. 33, 100570(2025).
  3. Walker, M., Morton, J. P. Hydrogel models of pancreatic adenocarcinoma to study cell mechanosensing. Biophys Rev. 16 (6), 851-870 (2024).
  4. Ryu, S., Martino, N., Kwok, S. J. J., Bernstein, L., Yun, S. H. Label-free histological imaging of tissues using Brillouin light scattering contrast. Biomed Opt Express. 12 (3), 1437-1448 (2021).
  5. Zhang, J., Scarcelli, G. Mapping mechanical properties of biological materials via an add-on Brillouin module to confocal microscopes. Nat Protoc. 16 (2), 1251-1275 (2021).
  6. Kabakova, I., et al. Brillouin microscopy. Nat Rev Methods Primers. 4, 8(2024).
  7. Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: an emerging tool for mechanobiology. Nat Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
  8. Czajkowsky, D. M., Iwamoto, H., Shao, Z. Atomic force microscopy in structural biology: from the subcellular to the submolecular. J Electron Microsc. 49 (3), 395-406 (2000).
  9. Glaser, K. J., Manduca, A., Ehman, R. L. Review of MR elastography applications and recent developments. J Magn Reson Imaging. 36 (4), 757-774 (2012).
  10. Jordan, J., et al. Rapid stiffness mapping in soft biologic tissues with micrometer resolution using optical multifrequency time-harmonic elastography. Adv Sci. 12 (8), e2410473(2025).
  11. Mattarelli, M., Vassalli, M., Caponi, S. Relevant length scales in Brillouin imaging of biomaterials: the interplay between phonons propagation and light focalization. ACS Photonics. 7 (9), 2319-2328 (2020).
  12. Caponi, S., Fioretto, D., Mattarelli, M. On the actual spatial resolution of Brillouin imaging. Opt Lett. 45 (5), 1063-1066 (2020).
  13. Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nat Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
  14. Rodríguez-López, R., et al. Network viscoelasticity from Brillouin spectroscopy. Biomacromolecules. 25 (2), 955-963 (2024).
  15. Troyanova-Wood, M., Meng, Z., Yakovlev, V. V. Differentiating melanoma and healthy tissues based on elasticity-specific Brillouin microspectroscopy. Biomed Opt Express. 10 (4), 1774-1781 (2019).
  16. Rad, M. A., et al. Micromechanical characterisation of 3D bioprinted neural cell models using Brillouin microspectroscopy. Bioprinting. 25, e00179(2022).
  17. Conrad, C., Gray, K. M., Stroka, K. M., Rizvi, I., Scarcelli, G. Mechanical characterization of 3D ovarian cancer nodules using Brillouin confocal microscopy. Cell Mol Bioeng. 12 (3), 215-226 (2019).
  18. Yan, G., Monnier, S., Mouelhi, M., Dehoux, T. Probing molecular crowding in compressed tissues with Brillouin light scattering. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (4), e2113614119(2022).
  19. Hilai, K., et al. Mechanical evolution of metastatic cancer cells in 3D microenvironment. Small. 21, 2403242(2025).
  20. Mahajan, V., et al. Mapping tumor spheroid mechanics in dependence of 3D microenvironment stiffness and degradability by Brillouin microscopy. Cancers. 13 (21), 5549(2021).
  21. Margueritat, J., et al. High-frequency mechanical properties of tumors measured by Brillouin light scattering. Phys Rev Lett. 122 (1), 018101(2019).
  22. Zhang, J., Nikolic, M., Tanner, K., Scarcelli, G. Rapid biomechanical imaging at low irradiation level via dual line-scanning Brillouin microscopy. Nat Methods. 20 (5), 677-681 (2023).
  23. Nikolić, M., Scarcelli, G., Tanner, K. Multimodal microscale mechanical mapping of cancer cells in complex microenvironments. Biophys J. 121 (19), 3586-3599 (2022).
  24. Scarcelli, G., et al. Noncontact three-dimensional mapping of intracellular hydromechanical properties by Brillouin microscopy. Nat Methods. 12 (12), 1132-1134 (2015).
  25. Berghaus, K. V., Yun, S. H., Scarcelli, G. High speed sub-GHz spectrometer for Brillouin scattering analysis. J Vis Exp. (106), e53468(2015).
  26. Shi, C., et al. Monitoring the mechanical evolution of tissue during neural tube closure of chick embryo. J Vis Exp. (201), e66117(2023).
  27. Trujillo, S., et al. Engineered 3D hydrogels with full-length fibronectin that sequester and present growth factors. Biomaterials. 252, 120104(2020).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Chiu, C. L., Clack, N. Napari: a Python multi-dimensional image viewer platform for the research community. Microsc Microanal. 28 (S1), 1576-1577 (2022).
  30. Passeri, A. A., et al. Brillouin spectroscopy for accurate assessment of morphological and mechanical characteristics in micro-structured samples. J Phys Photonics. 6 (3), 035016(2024).
  31. Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt Express. 20 (8), 9197(2012).
  32. Pollard, T. D., Cooper, J. A. Actin, a central player in cell shape and movement. Science. 326, 1208-1212 (2009).
  33. Antonacci, G., Braakman, S. Biomechanics of subcellular structures by non-invasive Brillouin microscopy. Sci Rep. 6 (1), 37217(2016).
  34. Coker, Z. N., et al. Brillouin microscopy monitors rapid responses in subcellular compartments. PhotoniX. 5 (1), 9(2024).
  35. Yang, F., et al. Pulsed stimulated Brillouin microscopy enables high-sensitivity mechanical imaging of live and fragile biological specimens. Nat Methods. 20 (12), 1971-1979 (2023).
  36. Antonacci, G., et al. Recent progress and current opinions in Brillouin microscopy for life science applications. Biophys Rev. 12 (3), 615-624 (2020).
  37. Savitzky, A., Golay, M. Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures. Anal Chem. 36, 1627-1639 (1964).
  38. Yan, G., et al. Evaluation of commercial virtually imaged phase array and Fabry-Pérot based Brillouin spectrometers for applications to biology. Biomed Opt Express. 11 (12), 6933-6944 (2020).
  39. Elsayad, K. Spectral phasor analysis for Brillouin microspectroscopy. Front Phys. 7 (62), 1-8 (2019).
  40. Mahmodi, H., et al. Principal component analysis in application to Brillouin microscopy data. J Phys Photonics. 6 (2), 025009(2024).
  41. Antonacci, G., Foreman, M. R., Paterson, C., Török, P. Spectral broadening in Brillouin imaging. Appl Phys Lett. 103 (22), 221105(2013).

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