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Artigo de método

Preparação do filtrado de cultura de Mycobacterium tuberculosis para entender a patogênese da TB

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DOI:

10.3791/67540

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28 de março de 2025

 , 
1CSIR-Centre for Cellular and Molecular Biology (CSIR-CCMB), 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 3National Institute of Immunology

Neste artigo

Resumo

Aqui, demonstramos a preparação do filtrado de cultura Mtb (CF), que é o meio de crescimento bacteriano que consiste em proteínas secretadas pela bactéria. O Mtb secreta proteínas para modular a sinalização do hospedeiro e a resposta imune, que são cruciais para a patogênese. Os FCs preparados são analisados por espectrometria de massas para identificar todos os fatores secretores.

Resumo

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) secreta muitas proteínas no hospedeiro para modular vários processos celulares, como sinalização do hospedeiro, resposta imune, apoptose, etc., para aumentar a sobrevida. Embora a função de alguns fatores secretores tenha sido elucidada, muitos ainda não foram caracterizados. Portanto, investigar a proteína secretora Mtb é uma área essencial de pesquisa. O Mtb secreta proteínas no espaço extracitoplasmático com a ajuda de três sistemas de secreção diferentes: geral, arginina gêmea e sistema de secreção especializado do Tipo VII. É preciso preparar o secretoma para identificar novas moléculas secretoras e caracterizar funcionalmente os fatores conhecidos. Aqui, descrevemos o método para preparar o secretoma e a preparação da amostra para espectrometria de massa. A preparação do secretoma requer o máximo cuidado para evitar a contaminação de proteínas citosólicas, que podem ser monitoradas por sondagem com anticorpos contra proteínas de membrana, secretoras e citosólicas bem caracterizadas. O filtrado de cultura assim preparado pode ser usado para diferentes fins, que incluem a investigação das propriedades de imunomodulação do hospedeiro.

Introdução

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), um dos patógenos mais mortais em todo o mundo, infecta indivíduos saudáveis por meio de aerossóis transmitidos de uma pessoa infectada durante espirros ou tosse1. Uma vez que entra nos pulmões, é engolido pelos macrófagos alveolares, sequestrando o sistema imunológico do hospedeiro para sobreviver. Dentre os vários mecanismos modulatórios do hospedeiro que o Mtb possui para a sobrevivência, os fatores de virulência secretora são um deles. As proteínas secretadas nos meios de cultura pelos bacilos durante seu crescimento são denominadas proteínas do Filtrado de Cultura (CF)2. Essas proteínas filtradas de cultura ajudam as bactérias a sobreviver em condições adversas dentro das células hospedeiras. O Mtb está equipado com três tipos diferentes de sistemas de secreção: um sistema de secreção especializado do Tipo VII (T7SS), um sistema geral de secreção de Sec (sistema Sec) e um sistema de secreção de arginina dupla (sistema Tat). O T7SS é o sistema de secreção mais exclusivo em actinobactérias, ao contrário do tipo I-VI em bactérias Gram-negativas3. A secreção de proteína desdobrada através da membrana está principalmente envolvida no sistema Sec, e as proteínas são reconhecidas por uma sequência de sinal N-terminal 4,5. Proteínas dobradas ou parcialmente dobradas são transportadas através do sistema Tat, identificadas por uma sequência de sinal N-terminal com um motivo de arginina dupla 6,7. Como o sistema Sec e Tat regula a secreção de proteínas ainda não foi determinado.

Algumas proteínas filtradas de cultura conhecidas em Mtb que ajudam a resistir e sobreviver ao ataque oxidativo do hospedeiro após a infecção são enzimas como KatG e SodA 8,9, necessárias para degradar espécies reativas de oxigênio. Além disso, o CFP10-ESAT6, um complexo proteico heterodimérico, desempenha um papel vital na regulação das respostas de citocinas, escape bacteriano, produção de ROS, etc.10. O locus RD1 está envolvido na modulação do sistema de secreção do Tipo VII, que inclui a secreção de CFP10-ESAT6, e a deleção genética de cpf10-esat6 compromete a sobrevivência de bactérias em modelos de infecção ex vivo e in vivo. Mycobacterium bovis A cepa da vacina BCG não possui o locus RD1 responsável pela secreção de fatores de virulência e, portanto, pode ser usada como vacina viva atenuada11. Diferentes processos celulares inexplorados regulam rigidamente o processo de secreção. As proteínas do filtrado de cultura contêm fatores promotores de ressuscitação (RpFs) que ajudam as bactérias a crescer novamente do estado latente. Os fatores promotores de ressuscitação (Rpfs) são enzimas hidrolisadoras de peptidoglicano que são conhecidas por desempenhar um papel na dormência. O Mtb codifica cinco genes semelhantes a rpf (rpf AE) que ajudam as bactérias a crescer novamente da dormência, sozinhas ou interagindo com outras proteínas12. Os Rpfs são encontrados no filtrado de cultura bacteriana e são conhecidos por estarem envolvidos na virulência do Mtb e na imunidade do hospedeiro13,14. Os genes rpfE e rpfB amplamente estudados apresentam imunidade protetora in vitro13 e aumentam as respostas imunes in vivo. Portanto, rpfE e rpfB podem ser usados como candidatos a vacinas Mtb.

A fosforilação reversível15 é uma modificação pós-traducional que altera vários processos celulares, homeostase celular, divisão celular, etc. Por exemplo, a fosforilação de CFP10 desempenha um papel regulatório importante, onde os mutantes fosfoablativos e miméticos de CFP10 falham em restaurar o fenótipo observado na cepa de deleção CFP10-ESAT6 16. SecA2, por outro lado, é uma proteína secretora envolvida no dano ao DNA da célula hospedeira17. O secretoma do mutante SecA2 é suficiente para alterar a resposta imune do hospedeiro e a cascata de sinalização18,19. Assim, é essencial e emocionante investigar o secretoma de H37Rv e os mutantes Mtb, onde os genes das proteínas secretoras são excluídos (dados não publicados), para obter informações sobre como eles afetam a imunomodulação e a sobrevivência do hospedeiro.

Este relatório se concentra em três aspectos: as etapas envolvidas na preparação do filtrado de cultura de MTB , o processamento das amostras para espectrometria de massa e a realização de experimentos ex vivo com filtrados de cultura para examinar as funções imunomoduladoras. Estudos anteriores mostraram a identificação de proteínas filtradas de cultura por eletroforese em gel 2D seguida de análise espectrométrica de massa8. Proteínas filtradas de cultura de cepas sensíveis e resistentes a medicamentos foram identificadas usando espectrometria de massa para obter informações sobre as alterações do secretoma e identificar fatores de virulência que podem desempenhar um papel na resistência aos medicamentos20. Investigamos anteriormente o secretoma e o fosfossecretoma de Mtb com a ajuda da espectrometria de massa16. Técnicas como eletroforese em gel 2D são de baixo rendimento e não são usadas para investigar mudanças globais no proteoma ou secretoma. As proteínas filtradas de cultura variam de cepas bacterianas, estágios das células em crescimento e até mesmo em várias condições de estresse. Dependendo de diferentes situações, a mudança nos pools de proteínas secretoras dentro das células ofereceria a exploração holística de todo o secretoma e forneceria mais informações sobre o sistema de secreção bacteriana para intervenções terapêuticas. Seria ainda mais atraente olhar para o secretoma nos nocautes ou cepas de depleção dos sistemas secretores para obter mais informações sobre as vias e alvos de cada via secretora. O tratamento de células com proteínas filtradas de cultura em vez de bactérias altera os níveis de citocinas e outros fatores imunomoduladores17. Com a ajuda do estudo do secretoma, pode-se identificar novos fatores de virulência e seu papel na virulência.

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Protocolo

NOTA: Aqui, usamos a cepa de laboratório patogênica H37Rv de Mtb. Deve-se realizar as etapas necessárias para cultivar a cultura bacteriana e isolar o sobrenadante da cultura no nível 3 do Laboratório de Biossegurança (BSL-3). Desde o renascimento da cultura até a preparação do filtrado, a instalação BSL-3 é usada.

1. Inoculação da cultura de Mtb

  1. Preparação da área de trabalho em BSL-3
    1. Ligue a luz UV do gabinete de biossegurança por 10 minutos antes de usar. Limpe o gabinete de biossegurança com etanol 75% antes e depois do uso. Descarte os materiais usados em lixeiras apropriadas seguindo as diretrizes de biossegurança.
  2. Preparação de culturas primárias e secundárias de Mtb H37Rv
    1. Pegue o caldo de glicerol a -80 °C e descongele o caldo à temperatura ambiente. Use quatro estoques independentes para quadrigêmeos biológicos.
    2. Tome 10 mL de meio 7H9 (Tabela 1) contendo 10% de ADC (9 mL de meio 7H9 e 1 mL de ADC) em um frasco cônico autoclavado de 100 mL com tampa de rosca.
      NOTA: 7H9 + ADC: 7H9 é um meio rico em nutrientes obtido comercialmente, ao qual adicionamos ADC (ADC: Albumina, Dextrose e Catalase; Tabela 2). Tanto o ADC quanto o OADC podem ser usados para cultivar a cultura. Frascos cônicos proporcionam mais aeração à cultura; no entanto, também se pode usar um frasco de cultura de tecidos para cultivar as células bacterianas.
    3. Inocule todo o estoque de glicerol no meio para reviver a cultura, que se torna a cultura primária. Pegue uma cultura de Mtb crescentede 600 ~ 0,8 para fazer estoques de glicerol. Misture 15% de glicerol e a cultura crescente de Mtb em um criopó e armazene a -80 °C.
    4. Incubar os frascos de cultura a 37 °C num agitador de incubadora durante 3-4 dias a 100 rpm.
    5. No5.o dia, medir a absorvância a 600 nm (A600). Quando as culturas atingirem A600 ~ 0,8-1, use a cultura para inocular a cultura secundária em A600 ~ 0,2 em 100 mL de meio 7H9 + 10% ADC em um frasco de 500 mL. Execute as mesmas etapas para as replicações.
      1. Meça o A600 da cultura primária. Se o A600 for ~ 0,8, desça a cultura por centrifugação a 2100 x g por 10 min. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 5 mL de 7H9 + 10% de ADC e meça o A600. Calcule quanto inóculo será adicionado em 100 mL de cultura secundária de A600 ~ 0,2. Por exemplo, se o A600 ~ 4 for usado, 5 mL dessa cultura precisam ser adicionados a 100 mL de cultura secundária fresca de 7H9 + 10% de ADC de A600 ~ 0,2.
    6. Cultive-os a 37 °C em uma incubadora a 100 rpm por 2-3 dias até OD A600 ~ 0,8.
    7. Retire 10 μL usando uma pipeta com uma ponta de filtro e coloque a cultura em uma placa de ágar LB que não contenha antibióticos na capa bacteriana. Incubar a placa a 37 °C durante 12-16 h para visualizar a contaminação bacteriana (se existir). Descarte as culturas e reviva as novas culturas do experimento se alguma contaminação bacteriana for detectada.
  3. Crescimento bacteriano no meio de Sauton
    1. No A600 ~ 0,8, inocule as bactérias em A600 ~ 0,2 em 100 mL do meio de Sauton em um frasco de 500 mL (Tabela 3) e cresça por 3-4 dias após o OD atingir ~ 0,8.
    2. Use culturas cultivadas até A600 ~ 0,8 no meio de Sauton (cultura primária de Sauton) para inoculação de culturas a serem usadas para preparação de filtrado de cultura.
      NOTA: 7H9 + ADC é um meio rico em nutrientes que contém albumina. A albumina não pode ser usada na análise do secretoma, pois a albumina pode mascarar as proteínas do filtrado da cultura. Portanto, o meio de Sauton é usado para preparar o filtrado de cultura. A mídia de Sauton é preparada reconstituindo os componentes mencionados na Tabela 3.

2. Preparação de proteínas filtradas de cultura Mtb

  1. Centrifugação para sobrenadante de cultura
    1. Use a cultura primária de Sauton para inocular 300 mL da cultura secundária de Sauton a A600 ~ 0,2. Cultive culturas até que OD A600 seja ~ 0,4-0,5. Use culturas de fase logarítmica inicial de crescimento ativo para evitar a contaminação de células mortas.
      1. Meça a DO da cultura secundária. Se o OD atingir A600 ~ 0,8, desça a cultura por centrifugação a 2.100 x g por 10 min. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 10 mL de meio de Sauton e retome o OD. Calcule quanto inóculo será adicionado em uma cultura de 300 mL de 0,2 OD a partir da DO medida. Por exemplo, se a DO for 8, 7,5 mL dessa cultura devem ser adicionados a 300 mL de meio fresco de Sauton de 0,2 OD.
        NOTA: Atenha-se ao OD mencionado para reduzir a lise celular e a contaminação por GroEL. GroEL é um acompanhante e é constitutivamente expresso nas células bacterianas. Parte da literatura mostrou a presença de GroEL em filtrados de cultura devido ao estresse durante o crescimento. Aqui, estamos usando o meio de Sauton para a preparação do filtrado de cultura, que fornece estresse leve às células; portanto, o GroEL pode se apresentar no filtrado da cultura. Além disso, se o OD da cultura for maior que 1, ocorrerá lise celular, levando à contaminação por GroEL no filtrado da cultura.
    2. Derrube 300 mL de culturas em crescimento em tubos de 6,50 mL a 2.100 x g por 10 min a 4 ° C (Figura 1A).
    3. Retirar 45 ml de sobrenadante, deixando o pellet intocado, com uma pipeta serológica de 25 ml para um novo tubo em cada caso. Mantenha o pellet de lado para a preparação do lisado de células inteiras (WCL).
    4. Repetir a centrifugação a 2.100 x g durante 10 min a 4 °C. Retirar 40 ml de sobrenadante (deixando 5 ml de cultura intocados) com uma pipeta serológica de 25 ml para um novo tubo e repetir o passo de centrifugação.
    5. Retirar 35 ml do sobrenadante para um tubo novo e filtrar o sobrenadante de cultura utilizando um filtro de seringa de 0,2 μm. Filtre em um tubo novo para eliminar a contaminação bacteriana patogênica. De 300 mL de cultura, 210 mL de filtrado de cultura por repetição são recuperados.
      NOTA: O filtro que foi usado aqui para filtrar o filtrado de cultura é um filtro de seringa estéril de 0.22 μm (tipo SY25PL-S).
    6. Após filtração do filtrado de cultura, inocular 1 ml de alíquota do filtrado de cultura filtrado para uma placa de ágar e incubar na incubadora a 37 °C durante 4 semanas para garantir a presença de outras contaminações bacterianas patogénicas no filtrado de cultura. Tome 1 mL de alíquota do lisado de células inteiras (WCL) e siga as mesmas medidas de segurança.
    7. Limpe os tubos de amostra com etanol a 75% e retire-os do BSL-3 através de uma caixa de passagem.
  2. Preparação de lisado de células inteiras (WCL)
    1. Ressuspenda o pellet em 1 mL de 1x PBSG contendo fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), 1x coquetel inibidor de protease e transfira o lisado para tubos de 2 mL contendo 1/3do volume de esferas de zircônia de 0,1 mm.
      NOTA: O 1x PBSG é composto por 1x PBS + 5% de glicerol. Pegue a proporção de peso do pellet para o tampão de 1:3.
    2. Lise as amostras batendo-as em um mini batedor de contas: 1 min de batida de contas seguido de 2 min de incubação no gelo. Repita isso 8x.
    3. Centrifugue os tubos a 18.000 x g por 15 min a 4 °C. Recolha o sobrenadante num novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e mantenha-o no gelo.
    4. Repita a etapa de centrifugação. Passe o sobrenadante por um filtro de seringa de 0,2 μm para eliminar a contaminação bacteriana patogênica.
      NOTA: O filtro usado aqui para filtrar o filtrado de cultura é um filtro de seringa estéril de 0.22 mm (tipo SY25PL-S).
    5. Limpe as amostras com etanol 75% e retire-as do BSL-3 através de uma caixa de passagem. Verifique as concentrações de lisados usando o kit de ensaio BCA, conforme mencionado abaixo. Armazenar os lisados a -80 °C.
  3. Concentre as proteínas do filtrado de cultura usando unidades de filtro centrífugo.
    1. Concentrar 210 ml de proteínas filtradas de cultura de Mtb com a ajuda de unidades de filtro centrífugo. Use tubos de unidade de filtro centrífugo de 3 kDa 15 mL (centrícones) para concentrar o filtrado de cultura em ~ 1 mL (Figura 1A). Os tubos da unidade de filtro centrífugo de 3 kDa retêm proteínas do mesmo tamanho ou maiores que 3 kDa.
    2. Adicionar cerca de 15 ml de cada réplica do filtrado de cultura num tubo centrícono e centrifugar a 2.100 x g durante 1 h a 4 °C.
    3. Descarte o fluxo de acordo com as normas e repita a etapa 2.3.2 para 15x–16x até 210 mL do concentrado de filtrado de cultura para ~ 1 mL.
    4. Alíquota de 100 μL das proteínas filtradas de cultura concentradas em dez tubos de microcentrífuga de baixa ligação às proteínas e estimar a concentração de proteínas usando um kit de BCA.
  4. Estimativa de proteínas concentradas
    1. Estime a concentração de proteína em relação à BSA como padrão. Use 1 μg, 2 μg, 3 μg e 4 μg de BSA em volume de 25 μL em duplicatas. Se a amostra não foi diluída, use uma amostra diluída 5x (em PBS) em volume de 25 μL em duplicatas para a estimativa. As estimativas são realizadas em placas de 96 poços. Use um controle sem amostra (em branco) contendo 25 μL de PBS.
    2. Adicione 175 μL de reagente misto de acordo com as instruções do fabricante. Misturar as amostras com a ajuda de uma pipeta multicanal e incubar a 37 °C durante 1 h. Meça as leituras a 562 nm usando um leitor ELISA. Deduza os valores dos valores em branco para obter valores para BSA e as amostras.
    3. Ajuste a curva padrão à curva de regressão linear e estime as amostras em relação ao padrão. Siga o kit BCA para o manual de estimativa de proteínas.

3. Confirmação de proteínas filtradas de cultura usando diferentes marcadores

  1. Detecção de proteínas pela coloração de Coomassie
    1. Para confirmar a presença das proteínas no filtrado de cultura, pegue 30 μg de proteína e resolva em eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio a 10% (SDS-PAGE; Tabela 4).
      NOTA: Siga a descrição da tabela para fazer os tampões SDS-PAGE, coloração de Coomassie e soluções de descoloração.
    2. Adicione 20 mL de solução de coloração Coomassie (Tabela 5) ao gel e incube por 30 min em balancins em temperatura ambiente. Descarte a solução de coloração.
    3. Adicione 30 mL de solução de descoloração (Tabela 6) ao gel e incube por 30 min em um balancim à temperatura ambiente. Descarte a solução de descoloração e adicione uma nova solução de descoloração. Repita até que o gel seja desmanchado adequadamente.
    4. Verifique a faixa de proteína no iluminador trans (Figura 1B). Como a proteína filtrada da cultura contém várias proteínas, uma faixa de bandas de proteína pode ser vista no gel após a descoloração (Figura 1B).
  2. Confirmação de Western blot para marcador de proteína secretada
    1. Use o anticorpo da proteína secretada para verificar a presença da proteína secretada no filtrado de cultura. Ag85B (ab43019) é uma proteína secretada por Mtb bem conhecida no filtrado de cultura e está presente no citosol; o anticorpo Ag85B (concentração de 5 mg/mL) (diluição de 1:5000 em 5% de BSA) é usado como controle positivo para a proteína secretada.
    2. Carregue um WCL com as proteínas filtradas de cultura para diferenciar entre as frações citosólicas/de membrana e as frações de proteínas secretadas. Ag85B é citosólico e secretado, então isso deve estar presente em ambas as frações; por outro lado, sabe-se que o PknB está localizado na membrana e não está presente no filtrado da cultura.
    3. Determine a concentração de proteínas no WCL/filtrado de cultura com a ajuda de um kit de BCA. Misture 30 μg de WCL / filtrado de cultura com tampão 2x-lamelli em um volume de 30 mL (Tabela 7). Resolva as amostras em 10% de SDS-PAGE para PknB e 12% de SDS-PAGE para Ag85B até que a frente do corante atinja o fundo usando o tampão de execução de gel SDS (Tabela 8). Não deixe o corante escorrer do gel.
      NOTA: O tamanho do Ag85B é ~35 kDa, portanto, 12% SDS-PAGE é usado.
    4. Corte a membrana de nitrocelulose de 9 cm x 6 cm 0,2 μm para a transferência (Tabela 9) da proteína do gel para a membrana. Configure a transferência usando um de transferência, embebendo os, almofadas de espuma, papel mata-borrão, gel e membrana em 1x tampão de transferência gelado.
    5. Coloque a almofada de espuma em um lado do, coloque um mata-borrão, coloque o gel, coloque a membrana de nitrocelulose em cima do gel, coloque um papel mata-borrão novamente e, por último, coloque outra almofada de espuma e feche o porta-. Coloque o porta-no tanque de transferência de forma que o lado da membrana fique voltado para o ânodo e o lado do gel voltado para o cátodo.
    6. Conecte o cátodo e o cabo do ânodo ao tanque para fechar a configuração e defina-a em corrente de 120 mA por 120 min. Comece a executar a transferência em uma câmara fria.
    7. Coloque a membrana em uma pequena caixa de plástico após o término da transferência. Bloqueie a membrana usando 10 mL de solução BSA a 5% feita em 1x PBST20 para reduzir a ligação não específica por 1 h à temperatura ambiente no balancim.
    8. Remova a solução de bloqueio, adicione 5-10 mL de anticorpo primário, que é anticorpo anti-camundongo Ag85B (diluições 1:5.000 em solução BSA a 5%) e incube a 4 ° C durante a noite em um balancim. Armazene o anticorpo a -20 °C e reutilize até 3x.
    9. Remova o anticorpo primário, adicione 5-10 mL de 1x PBST20 e lave a membrana por 8 min em temperatura ambiente agitando vigorosamente. Remova a primeira lavagem, adicione 5-10 mL de 1x PBST20 novamente e lave. Repita isso 2x.
    10. Adicione 5-10 mL de 1x PBST20 contendo anticorpo secundário, que é anticorpo conjugado anti-peroxidase redox de cavalo (HRP) de camundongo (diluição 1:10.000) e incube por 2 h em temperatura ambiente em um balancim.
    11. Lavar a membrana após o anticorpo secundário seguindo o passo 3.2.9. Adicione uma quantidade igual de substrato HRP e intensificador para desenvolver a membrana sob um quimioluminômetro ( Figura 1C ).
      NOTA: Para confirmar a ausência de contaminação por proteína citosólica, sondamos o Western blot com um anticorpo anti-PknB (Figura 1C). O anticorpo foi criado no Instituto Nacional de Imunologia, uma instalação animal, contra o domínio extracitoplasmático purificado de PknB. Pode-se observar a banda PknB no WCL, não nos filtrados de cultura, e PknB é apenas citosólico e ligado à membrana e não deve estar presente no filtrado de cultura.

4. Preparação de amostras para espectrometria de massa

  1. Realize a digestão de proteínas em solução por tripsina.
    1. Pegue 100 μg de proteína filtrada de cultura, adicione 6x o volume de acetona gelada e mantenha-o a -20 ° C durante a noite.
      NOTA: Use utensílios de vidro para preparar todos os reagentes para a amostra de espectrometria de massa. Use tubos de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas e pontas de baixa ligação a proteínas. Não use material plástico para evitar a contaminação do polímero na análise de espectrometria de massa.
    2. Precipitar as proteínas por centrifugação a 18.000 x g a 4 °C durante 30 min. Descarte o sobrenadante.
    3. Lave o pellet com 500 μL de acetona, pellet a 18.000 x g por 10 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante. Remova a acetona residual com a ajuda de um concentrador de vácuo.
    4. Adicionar 20 μL de ureia 8 M dissolvida em bicarbonato de amónio 25 mM (caldo 2 M preparado em água de qualidade MS). Vortex as amostras e incubar por 30 min em temperatura ambiente.
    5. Ad 60 μL de bicarbonato de amônio 25 mM para diluir 8 M de uréia em 2 M. Incubar à temperatura ambiente por 1 h. Adicione 4 μL de TCEP (concentração final de 10 mM feita em bicarbonato de amônio 25 mM) e incube em temperatura ambiente por 30 min, agitando a 1.800 x g.
    6. Adicione 4 μL de IAA (concentração final de 25 mM feita em 25 mM de bicarbonato de amônio) e incube em temperatura ambiente por 30 min, agitando a 1.800 x g no escuro. Adicionar 110 μL de bicarbonato de amónio a 25 mM.
    7. Adicione tripsina (1:20; Tripsina: proteína em μg) à solução e mantê-la a 37 °C, agitando a 300 rpm, para digestão durante a noite (Figura 2). Pare a reação de digestão adicionando 10% de TFA (ácido trifluoroacético). Velocidade de vácuo as amostras completamente para secar.
  2. Dessalinização da amostra
    1. Adicione 100 μL de ACN a 5% + TFA a 0,1% aos peptídeos digeridos. Vórtice por 30 min a 1.500 rpm em temperatura ambiente.
    2. Centrifugue a 18.000 x g por 10 min em temperatura ambiente. Pegue o sobrenadante (peptídeo) sem tocar no pellet em tubos de microcentrífuga novos e prossiga com a dessalinização. Faça todas as soluções de lavagem e eluição antes da etapa de dessalinização.
    3. Equilibre a ponta da coluna C-18 com 100 μL de 100% ACN + 0,1% TFA pipetando a solução e repetindo o processo 5x.
    4. Adicione 100 μL de 50% ACN + 0,1% TFA e repita o processo 5x. Adicione 100 μL de ACN a 5% + TFA a 0,1% e repita o processo 5x.
    5. Permita que a ligação do peptídeo ocorra na ponta da coluna C-18 pipetando 30x. Manter a solução a -20 °C até que a amostra seja processada para espectrometria de massa. Agora, o peptídeo está ligado à coluna C-18.
    6. Lave a coluna C-18 com 100 μL de água de grau MS + 0,1% de TFA pipetando e repita o processo 5x.
    7. Lave a coluna C-18 com 100 μL de ACN a 5% + TFA a 0,1% pipetagem e repita o processo 5x. Eluir os peptídeos da coluna C-18 em 100 μL de 50% ACN + 0,1% TFA pipetando 30x (Figura 2).
      NOTA: Após a eluição, a ponta da coluna C-18 pode ser armazenada a 4 °C até que a espectrometria de massa seja feita.
    8. Aspire totalmente o peptídeo eluído e armazene-o a -20 °C até que a amostra seja fornecida para espectrometria de massa.
  3. Injeção das amostras de peptídeos em uma espectrometria de massa.
    1. Adicione 20 μL de solução A (fornecida pela instalação de espectrometria de massa) às amostras de peptídeos secos. Vortex as amostras por 30 min e centrifugue por 90 min a 4 ° C.
    2. Injete 20 μL da amostra na máquina de espectrometria de massa para uma corrida de gradiente de 90 minutos.

5. Análise de dados para proteínas secretadas presentes no filtrado de cultura

  1. Identificação de proteínas
    1. Analise amostras proteômicas usando o espectrômetro de massa Quadrupole. Consulte os espectros obtidos no banco de dados Mtb H37Rv UniprotKB.
    2. Defina as tolerâncias de massa do precursor e do fragmento em 10 ppm e 0,5 Da. Defina a enzima para tripsina com um valor máximo de clivagem perdida de dois.
    3. Use o software de proteoma com Sequest como algoritmo de busca com a carbamidometilação da cisteína como uma modificação fixa.
    4. Identifique todas as correspondências de espectro de peptídeos (PSM) a uma taxa de descoberta falsa de 1%. Aplique as configurações padrão para todos os outros parâmetros.
    5. Mapeie os arquivos brutos de espectrometria de massa da sequência peptídica com o UniProt ID das respectivas proteínas Mtb. Liste todas as proteínas Mtb, seus IDs Uniprot e classificação funcional usando o banco de dados Mycobrowser.
    6. Para análise posterior, mapeie os IDs UniProt das proteínas identificadas para seus respectivos números Rv . Deposite os dados do secretoma de espectrometria de massa no Consórcio ProteomeXchange por meio do parceiro PRIDE.

6. Tratamento de H37Rv com proteína filtrada de cultura para verificar a mudança na sinalização do hospedeiro

  1. Isolamento de macrófagos peritoneais de camundongos.
    NOTA: Siga a referência21 para isolamento de macrófagos peritoneais, semeadura das células e infecção.
    1. Injete camundongos Balb/c (4-6 semanas de idade) com 1 mL de tioglicolato a 4% e isole os macrófagos peritoneais do peritônio do camundongo no4º dia de infecção21 (Figura 3).
    2. Colete as células dos macrófagos injetando 1x PBS no peritônio do camundongo. Centrifugue as células a 1.800 x g por 5 min, descarte o sobrenadante e adicione 5 mL de meio 1640-RPMI suplementado com 10% de FBS (soro fetal bovino; meio completo) e 1x pen-strep (antibióticos).
    3. Semear 3 x 105 células por alvéolo em placas de 24 poços e incubar as placas numa incubadora a 37 °C durante a noite. No dia seguinte, troque o meio por meio fresco e completo, e as células estarão prontas para infecção ou tratamento com proteínas filtradas de cultura.
  2. Tratamento de macrófagos peritoneais com proteínas filtradas de cultura
    1. Leve as células de macrófagos para BSL-3 e mantenha-as na incubadora. Trate as células com 1 mg / mL de proteínas filtradas de cultura (Figura 3). Colha as células em diferentes pontos de tempo de 4 h, 24 h e 48 h de tratamento filtrado pós-cultura.
      1. Semeie as células de macrófagos isoladas em placas de 24 poços em triplicados em cada ponto de tempo. Trate as células com 1 mg/ml de proteínas filtradas para cultura e incube a 37 °C na presença de CO2. Colha as células em três momentos, 4 h, 24 h e 48 h após o tratamento.
      2. Trate as células com i) tampão de 2x-lamela para fazer os lisados de células de macrófagos e verifique se há diferentes marcadores de células hospedeiras realizando Western blotting, e ii) diferentes tampões para os ensaios imunológicos fornecidos pelos fabricantes junto com os kits.
    2. Prepare lisados celulares do hospedeiro e verifique se há diferentes marcadores, perfil de citocinas das células hospedeiras e várias expressões de proteínas da via de sinalização em células de macrófagos tratadas com filtrado de cultura.
      NOTA: Se um laboratório tiver um mutante de substituição de gene da proteína da via secretora, os filtrados de cultura preparados a partir de Mtb H37Rv e do mutante Mtb podem ser usados para avaliar seu impacto nos parâmetros imunomoduladores do hospedeiro.

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Resultados

Neste protocolo, demonstramos o isolamento de proteínas filtradas de cultura de micobactérias (Figura 1A). As proteínas do filtrado de cultura foram então verificadas quanto aos diferentes marcadores para confirmar o isolamento do filtrado de cultura. Conforme mencionado no protocolo, foi realizada uma coloração de Coomassie para verificar a carga proteica. Pode-se observar uma banda de proteína listrada na fração WCL (na última pista Figura 1B), enquan...

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Discussão

Uma das áreas críticas de pesquisa diz respeito à compreensão da patogênese do Mtb e ao desenvolvimento de diagnósticos e vacinas eficazes22,23. O isolamento de proteínas filtradas de cultura de meios de cultura Mtb é um processo que permite a identificação dos fatores de virulência secretados pelo patógeno. Investigar o papel das proteínas secretoras na modulação da patogênese do Mtb produz insights me...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,2 µ m Filtros de seringamdiSYPL0601MNXX204
0.2µ m Membrana de nitroceluloseAmersham10600001
37% HClMerckH1758
AcetonaEMPLURA MERCKSL9F690866
AcetonytrileSigma-Aldrich34851-2L
AcrilamidaBIORAD1610107
AlbuminaBio Basic CanadáCat No: AD0023
Amicon Ultra-15Merck, MilliporeUFC900396
Biocarbonato de amônioSigma-Aldrich09830-500G
Persulpahte de amônioSigma-AldrichA3678-100G
anti-Ag85BAbcamAB43019
anticorpo secundário conjugado HRP anti-camundongoThermo Fischer62-6520
AsparaginaSigma-AldrichA0884-500G
bis-acrilamidaSIGMA146072-500G
BSAMerckMB083-500G
C-18 colunaThermo FischerSEM SS18V
Catalase Sigma-AldrichC1345
Ácido CítricoSigma-AldrichC0759-500G
DextroseSigma-AldrichG7021-1KG
Difco Meio brook 7H9 caldo   Fisher Scientific271310
Citrato de amônio férrico (III)Sigma-AldrichF5879-100G
Ácido fórmico 98-100%MerckZ0823704246
Ácido acético glacial 100%MerckCD0C700160
GlicinaSigma-AldrichG8898-1KG
GlicinaSIGMAG8898-1KG
GycerolSigma-AldrichG5516
Immobilion Western Substrato de HRP quimioluminescenteMerckWBKLS0500
IodoacetamidaAmershamRPN6302V
Sulpahte de magnésioSigma-AldrichM7506-500G
micobroswer
SigmaCat No: O1008
Kit de ensaio de proteína Pierce BCAThermo Fischer23225
Pierce Tripsina ProtaseThermo Fischer90058
Proteome Discoverer 2.0Thermo Fischer Scientific
Q-Exactive HF (Thermo Scientific) (experimentos proteômicos - sequenciamento de peptídeos, identificação e quantificação de proteínas)Thermo Fischer Scientific
Cloreto de sódioSigmaCat No: S3014
Cloreto de sódioSigma-AldrichS7773-1KG
Sulfato de dodecil de sódioSigma-AldrichL3771-1KG
TCEPSigma-AldrichC4706-25
TemedSigma-AldrichT9281-100ML
Tris BaseBioRad161-0719
Tris-HClAMRESCO0234-500G
Tween 80Sigma-AldrichP1754
Base de
UreiaMP Bio194857
Ácido oleico dados de proteínas UniProt

Referências

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  3. Burts, M. L., Williams, W. A., DeBord, K., Missiakas, D. M. EsxA and EsxB are secreted by an ESAT-6-like system that is required for the pathogenesis of Staphylococcus aureus infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (4), 1169-1174 (2005).
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  8. Braunstein, M., Espinosa, B. J., Chan, J., Belisle, J. T., Jacobs, W. R. Jr SecA2 functions in the secretion of superoxide dismutase A and in the virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 48 (2), 453-464 (2003).
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  18. Kurtz, S., McKinnon, K. P., Runge, M. S., Ting, J. P., Braunstein, M. The SecA2 secretion factor of Mycobacterium tuberculosis promotes growth in macrophages and inhibits the host immune response. Infect Immun. 74 (12), 6855-6864 (2006).
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