O isolamento de MSCsaltasde MFGE8BAMBI , um dos três principais subgrupos que constituem UC-MSCs humanas heterogêneas, é útil para entender completamente as características e funções desse subtipo para sua futura aplicação para melhorar a eficácia clínica em doenças específicas. Aqui, apresentamos um método para classificar BAMBIaltoMFGE8alto UC-MSCs.
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Artigo de método
Isolamento de células estromais mesenquimais derivadas do cordão umbilical alto BAMBIhumanoMFGE8alto
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células-tronco estromais/tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical (UC-MSCs) apresentam baixa imunogenicidade e potentes efeitos imunomoduladores para o tratamento de várias doenças. As UC-MSCs humanas são uma população heterogênea que consiste em três subpopulações principais com diferentes formas celulares, taxas de proliferação, habilidades de diferenciação e funções reguladoras imunológicas. Anteriormente, descobriu-se que as UC-MSCsBAMBI altasMFGE8, o primeiro subgrupo isolado com sucesso das UC-MSCs, não aliviavam a nefrite lúpica. Portanto, a função e o mecanismo subjacente desse subgrupo na terapia com MSC para doenças permanecem desconhecidos. É necessário isolar e investigar ainda mais as CTMsaltasde MFGE8em termos de fenótipo, metabolismo e função para entender completamente a natureza desse subgrupo de CTMs. Neste protocolo, descrevemos um método detalhado para isolar a subpopulação altadeMFGE8BAMBI de UC-MSCs humanas. A subpopulação de UC-MSCs é marcada com dois marcadores de superfície, BAMBI e MFGE8, por classificação por citometria de fluxo. As células isoladas são cultivadas e verificadas por análise de citometria de fluxo. Os genes específicos expressos nas CTMsde UC altasde MFGE8de BAMBI são identificados por RT-qPCR. Este protocolo resulta em uma classificação de células altamente eficiente e pura e descreve os perfis de marcadores das BAMBIhighMFGE8high UC-MSCs.
Introdução
As células-tronco estromais/tronco mesenquimais humanas (CTMs) são progenitores somáticos capazes de se diferenciar em osteócitos, adipócitos, condrócitos e outros tipos de células1. As CTMs foram isoladas pela primeira vez da medula óssea e são amplamente derivadas do cordão umbilical, tecido adiposo e outros tecidos2. Como as UC-MSCs são facilmente obtidas e exibem baixa imunogenicidade e efeitos imunossupressores, elas são amplamente aplicadas em ensaios clínicos para tratar várias doenças 3,4,5. Embora a terapia com CTM mostre potencial promissor para o tratamento de doenças, os efeitos terapêuticos são inconsistentes entre os indivíduos6. No entanto, a razão para a instabilidade da terapia com MSC ainda não está clara.
Flutuações moleculares, morfologia, capacidade de diferenciação e função terapêutica compreendem a heterogeneidade das CTMs. Alguns estudos também postularam que as MSCs constituem subpopulações com diferentes funções 7,8 e exploraram a heterogeneidade das MSC por meio do sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) 9 , 10 . Os resultados revelaram que as UC-MSCs humanas têm subpopulações distintas com características transcriptômicas específicas, enquanto poucos estudos isolaram com sucesso as chamadas subpopulações de MSC. Anteriormente, dissecamos UC-MSCs humanas em três subgrupos de acordo com suas assinaturas por meio de scRNA-seq e análise de bioinformática, nos quais a subpopulação BAMBIhighMFGE8high UC-MSC foi purificada e testada funcionalmente11. No entanto, esse subgrupo não conseguiu aliviar a nefrite lúpica. Assim, é necessário testar os efeitos terapêuticos das CTMsaltasde MFGE8de BAMBI em outros distúrbios para entender suas funções autênticas.
Este protocolo descreve métodos para isolar o subgrupo BAMBIaltoMFGE8alto de UC-MSCs humanas por meio de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) por citometria de fluxo e as características do subgrupoBAMBI altoMFGE8 alto.
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Protocolo
Este estudo foi conduzido de acordo com os princípios estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1989 e aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Drum Tower Afiliado da Faculdade de Medicina da Universidade de Nanjing (número de aprovação: 202019701). Os cordões umbilicais humanos foram obtidos de mães saudáveis no Hospital Afiliado Drum Tower da Faculdade de Medicina da Universidade de Nanjing após o parto natural, que deram seu consentimento informado para seu uso neste trabalho. As CTMs-UC primárias foram isoladas de cordões umbilicais humanos, conforme relatado anteriormente11.
1. Cultura e identificação de UC-MSC antes do isolamento
- Quando as MSCs atingirem 70-80% de confluência (P0), lave as células uma vez com PBS e adicione 1 mL de tripsina-EDTA a 0,25% por 2 min a 37 ° C. Em seguida, adicione 9 mL de meio completo para neutralizar a tripsina, transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugue a 300 × g por 5 min para coletar as células. Rejeitar o sobrenadante e adicionar o meio completo adequado para ressuspender as células. Transferir as células de cada placa para três frascos T75 (P1) e cultivar numa estufa de células a 37 °C e 5% de CO2.
- Depois de passar as UC-MSCs 2x por tripsinização, em P3, colha as células pelas mesmas etapas descritas na etapa 1.1. Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda as células no tampão de coloração FACS (1x PBS contendo 2% de FBS) e conte-as. Adicione o tampão de coloração FACS a uma concentração final de 5-10 × 106 células/mL e mantenha a suspensão celular no gelo.
- Distribua 100 μL por tubo desta suspensão celular em diferentes tubos de 1,5 mL. Adicione controles de isotipo e anticorpos FACS contra CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 e HLA-DR (todos a 1:200) às células a 4 ° C por 30 min.
- Lave as células 2x com o tampão de coloração FACS e centrifugue a 300 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os precipitados em 200 μL de tampão de coloração FACS para análise de citometria de fluxo para identificar marcadores MSC.
2. Isolamento de BAMBIalto MFGE8alto UC-MSCs por citometria de fluxo
- Cultive UC-MSC a uma densidade de aproximadamente 5-10 × 106 células ao isolar BAMBIaltoMFGE8alto UC-MSCs. Dissocie as células com EDTA 0,5 mM por 5 min até que comecem a ter uma morfologia redonda, adicione o meio completo para transferir as células para um tubo cônico de 15 mL e pipete a suspensão celular para cima e para baixo várias vezes para preparar uma suspensão unicelular. Use 10 μL da suspensão celular para contar as células e calcular o número total de células colhidas. Centrifugar o tubo cónico com a suspensão celular a 300 × g durante 5 min para recolher as células.
- Ressuspenda as células em 1 mL de meio completo até uma concentração final de 5-10 × 106 células / mL e mantenha a suspensão celular no gelo.
- Divida as células em quatro tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (somente células em branco; Células marcadas com BAMBI; Células marcadas com MFGE8; e células marcadas com BAMBI e MFGE8).
- Adicione anticorpos primários em concentrações apropriadas (MFGE8 e BAMBI, ambos a 1:100) aos tubos, misture e incube as células em temperatura ambiente por 15 min.
- Lave as células marcadas uma vez com 1x PBS e centrifugue a 300×g por 5 min. Descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células em 1 mL de meio completo, adicione anticorpos secundários fluorescentes conjugados (cabra anti-coelho IgG H & L Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647, todos a 1: 1.000) às células, misture e incube as células em temperatura ambiente por 15 minutos no escuro.
- Lave as células marcadas uma vez com 1x PBS, conforme descrito na etapa 2.5. Ressuspenda as células em 500 μL de meio completo, filtre através de um filtro de células de 70 μm para eliminar aglomerados e detritos e transfira o filtrado para um tubo de 15 mL para classificação por citometria de fluxo.
- Execute o tubo celular em branco sem adicionar um anticorpo (controle negativo) e ajuste a dispersão direta (FSC) e a dispersão lateral (SSC) para bloquear a escala da população negativa com coloração de anticorpos.
- Execute os tubos celulares marcados com anticorpos únicos (ou seja, MFGE8 + cabra anti-coelho IgG H & L Alexa Fluor 488, ou BAMBI + cabra anti-coelho IgG H & L Alexa Fluor 647) como um controle de gating para determinar onde a positividade começa na parcela.
- Execute o(s) tubo(s) de amostra experimental(is) para classificar e coletar a populaçãode células altas de altoMFGE8 do BAMBI.
- Coloque as MSCs BAMBIaltasMFGE8altas classificadas em uma placa de 24 poços e cultive as células em uma incubadora de células a 37 ° C e 5% de CO2.
- Quando as MSCsaltas deMFGE8 BAMBI classificadas crescerem por duas passagens para obter células suficientes, dissocie as células e execute uma análise pós-classificação para garantir a pureza das populações de células classificadas por citometria de fluxo, conforme descrito nas etapas 2.1-2.9. Alternativamente, examine a pureza das células classificadas com imunofluorescência convencional contra a expressão humana de BAMBI e MFGE8 se o número de células coletadas for muito pequeno.
3. Caracterização das CTMsaltas de MFGE8BAMBI
- Cultive as MSCsBAMBI altasMFGE8em uma placa de 12 poços, examine sua morfologia celular ao microscópio e compare-as com a de MSCs não classificadas.
NOTA: Em geral, as célulasaltas deMFGE8 BAMBI crescem mais rápido do que as UC-MSCs não classificadas. - Quando as células estiverem aproximadamente 90% confluentes na placa de 12 poços, aspire o meio de cultura celular, lave as células uma vez com 1x PBS e adicione 500 μL de reagente de extração de RNA às células. Agite o prato lentamente à temperatura ambiente (RT) por 5 min.
- Pipete a mistura e transfira-a para um tubo livre de RNase e DNase. Adicione 100 μL de clorofórmio, tampe o tubo e agite a mistura vigorosamente por vórtice por 15 s. Em seguida, deixe o tubo em repouso por 3 min.
- Centrifugar o tubo durante 15 min a 11.000 × g e 4 °C.
- Transferir cerca de 200 μL da camada aquosa superior para um novo tubo. Adicione o mesmo volume de isopropanol e pipete completamente para cima e para baixo várias vezes. Em seguida, deixe a mistura repousar em RT por 10 min.
- Centrifugue por 15 min a 11.000 × g e 4 °C. Descarte o sobrenadante.
- Adicione 500 μL de etanol a 75% ao pellet no tubo e inverta o tubo suavemente várias vezes.
- Centrifugue o tubo por 5 min a 6.000 × g e 4 °C. Descarte o sobrenadante. Repita a centrifugação uma vez por 10 s a 6.000 × g, aspire cuidadosamente o fluido restante com pipeta e seque o tubo em RT.
- Adicione 10 μL de água livre de RNase para dissolver o pellet de RNA e meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro.
- Siga as instruções do fabricante para sintetizar o cDNA de primeira fita de até 1 μg de RNA total.
- Use um kit qPCR para detectar e quantificar a expressão gênica, de acordo com as instruções do fabricante.
NOTA: As sequências dos primers de DNA usados estão listadas na Tabela 1.
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Resultados
A Figura 1 mostra os perfis de expressão de marcadores de superfície celular de UC-MSCs humanas. As MSCs cultivadas foram fortemente positivas para a expressão de CD44, CD73, CD90 e CD105 e negativas para a expressão de CD14, CD34, CD45, CD79 e HLA-DR. As MSCsaltasde MFGE8BAMBI foram classificadas de UC-MSCs humanas cultivadas, e sua expressão de BAMBI e MFGE8 foi reanalisada por citometria de fluxo após expansão por 3-4 passagens (Figura 2...
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Discussão
Este protocolo descreve como isolar e enriquecer a subpopulação altadeMFGE8BAMBI de UC-MSCs humanas. O método é importante para um estudo mais aprofundado da morfologia, crescimento e função deste subgrupo de MSC. Algumas etapas são vitais para o isolamento bem-sucedido e alto rendimento de célulasBAMBI altasMFGE8 altas.
Primeiro, o aspecto técnico mais crítico a ser considerado é o uso de uma solução de dissociação ...
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Divulgações
Os autores declaram não ter conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (concessão nº 82271843).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de microcentrífuga de 0,6 mL | Corning | Axygen MCT-060-A | |
| 1.5 mL Tecnologia | Labgica de Pequim | MCT-001-150 | |
| Placa de cultura de células de 100 mm | Tecnologia Labgica de Pequim | 12311 | |
| Placa de 12 poços | Tecnologia Labgica de Pequim | 11210 | |
| Tubo de centrífuga de 15 mL | Nanjing Vazyme | TCF00115 | |
| placa de 24 poços | Tecnologia Labgica de Pequim | 11310 | |
| Tubo de centrífuga de 50 mL Tecnologia de centrífuga | Nanjing Vazyme Material Technology | TCF00150 | |
| 5 mL Tubos de Fundo Redondo | Corning | FALCON 352003 | |
| 70 μ filtro de células m | Falcon | 352350 | Diluição: 1:1000 |
| APC anti-humano CD79a (Ig&alfa;) Anticorpo | BioLegend | 333505 | 581 Diluição: 1:200 |
| APC/Cyanine7 anti-CD73 humano (Ecto-5'-nucleotidase) Anticorpo | BioLegend | 344022 | G46-6 Diluição: 1:200 |
| APC-Cy7 Camundongo IgG1, κ Controle de | Isotipo BD Bioscience | 557873 | MOPC-31C (Controle de Isotipo) Diluição: 1:200 |
| BAMBI anticorpo | Bioss | bs-12418R | |
| Violeta Brilhante 510 anti-camundongo/humano CD44 Anticorpo BioLegend | 103044 | 5E10 Diluição: 1:200 | |
| Violeta Brilhante 510 Rato IgG2b, κ Anticorpo Isotype Ctrl | BioLegend | 400646 | MOPC-21 (Controle de Isotype) Diluição: 1:200 |
| CD105 (Endoglin) Anticorpo Monoclonal APC | eBioscience | 17-1057-42 | HM47 Diluição: 1:200 |
| Lâminas da Câmara de Contagem de Células | Shanghai QIUJING | XB-K-25 | |
| Centrífuga | Beijing BAIYANG | BY-320C | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| Clorofórmio | XILONG Scientific | 13700908 | |
| DMEM/F-12 (1:1) básico (1x) | Gibco | C11330500BT | |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, livre de Rnase | Invitrogen | AM9260G Diluição: 1:1000 | |
| Etanol | XILONG Scientific | 12803405 | |
| Fetal Soro Bovino (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| FITC Mouse Anti-Human CD34 | BD Bioscience | 555821 | IM7 Diluição: 1:200 |
| FITC Mouse Anti-Human CD45 | BD Bioscience | 555482 | AD2 Diluição: 1:200 |
| FITC Mouse Anti-Human HLA-DR | BD Bioscience | 555811 | SN6 Diluição: 1:200 |
| Citômetro de Fluxo | BD Bioscience | FACSAria™ III Cell SorterAria | |
| Flowjo | BD Bioscience | V10 | |
| Reagente de Dissociação Celular Suave | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| Cabra Anti-Rato IgG H& L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150113 | HI30 Diluição: 1:200 |
| IgG H& Anti-Coelho de Cabra L (AlexaFluor 594) | abcam | ab150080 | Diluição: 1:1000 |
| HiScript II Q RT SuperMix para qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | R223-01 | |
| Microscópios Invertidos | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| Álcool Isopropílico | XILONG Scientific 12802505 | ||
| MFGE8 anticorpo | Biorbyt | orb388429 | Diluição: 1:100 |
| Microcentrífuga | Thermo Fisher Scientific | FRESCO 21 | |
| Mouse IgG1 kappa Controle de Isotipo APC | eBioscience | 17-4714-42 | P3.6.2.8.1 (Controle de Isotipo) Diluição: 1:200 |
| Controle de Isotipo IgG1 kappa de Camundongo FITC | eBioscience | 11-4714-42 | eBMG2b (Controle de Isotipo) Diluição: 1:200 |
| Controle de Isotipo de IgG2b kappa de Camundongo FITC | eBioscience | 11-4732-42 | RTK4530 (Controle de Isotipo) Diluição: 1:200 |
| PBS (10x) | Sangon Biotech (Shanghai) | E607016-0500 | |
| PE-Cy5 Mouse Anti-Human CD90 | BD Bioscience | 555597 | P3.6.2.8.1 (Controle de Isotipo) Diluição: 1:200 |
| PE-Cy5 Camundongo IgG1 κ Controle de | Isotipo BD Bioscience | 550618 | |
| Penicilina-Estreptomicina 100x | Cytiva | SV30010 | Diluição: 1:100 |
| Sistema de PCR em Tempo Real | Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific | Q6 | |
| Água livre de RNase | QIAGEN | ||
| Espectrofotômetro | Thermo Fisher Scientific NanoDrop | One(840-317400) | |
| Pontas de micropipeta estéril | Labgica de Pequim | Diluição: frasco de cultura de células T75 1:100 | |
| Labgica de Pequim | 13212A | ||
| Termociclador | Aplicado Biosystems byThermo Fisher Scientific | Veriti | |
| Tri reagente | Sigma Aldrich | T9424 | |
| Typsin-EDTA Solução | Bio-Canal Biotecnologia | BC-CE-005 | |
| CO2 Incubadora | Thermo Fisher Scientific | 3111 |
Referências
- Liechty, K. W., et al. Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after in utero transplantation in sheep. Nat Med. 6 (11), 1282-1286 (2000).
- Zhou, T., et al. Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells. J Hematol Oncol. 14 (1), 24(2021).
- Xie, Z., et al. Tnf-alpha-mediated m(6)a modification of elmo1 triggers directional migration of mesenchymal stem cell in ankylosing spondylitis. Nat Commun. 12 (1), 5373(2021).
- Mcguire, J. J., et al. Mesenchymal stem cell-derived interleukin-28 drives the selection of apoptosis resistant bone metastatic prostate cancer. Nat Commun. 12 (1), 723(2021).
- Yuan, X., et al. Mesenchymal stem cell therapy induces flt3l and cd1c(+) dendritic cells in systemic lupus erythematosus patients. Nat Commun. 10 (1), 2498(2019).
- Wang, D., et al. Umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation in active and refractory systemic lupus erythematosus: A multicenter clinical study. Arthritis Res Ther. 16 (2), R79(2014).
- Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8407-8411 (2003).
- Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. J Cell Biochem. 113 (9), 2806-2812 (2012).
- Wang, Z., et al. Single-cell transcriptome atlas of human mesenchymal stem cells exploring cellular heterogeneity. Clin Transl Med. 11 (12), e650(2021).
- Chen, P., et al. Single-cell and spatial transcriptomics decodes wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells heterogeneity and a subpopulation with wound repair signatures. Adv Sci (Weinh). 10 (4), e2204786(2023).
- Chen, H., et al. Dissecting heterogeneity reveals a unique bambi(high) mfge8(high) subpopulation of human uc-mscs. Adv Sci (Weinh). 10 (1), e2202510(2022).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplant. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Lai, T. Y., et al. Different methods of detaching adherent cells and their effects on the cell surface expression of fas receptor and fas ligand. Sci Rep. 12 (1), 5713(2022).
- Avinash, K., Malaippan, S., Dooraiswamy, J. N. Methods of isolation and characterization of stem cells from different regions of oral cavity using markers: A systematic review. Int J Stem Cells. 10 (1), 12-20 (2017).
- Galvao, I., et al. Rock inhibition drives resolution of acute inflammation by enhancing neutrophil apoptosis. Cells. 8 (9), 964(2019).
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Reimpressões e permissões
