Descrevemos um protocolo simples para remover o estatocisto e tecidos associados no ctenóforo Mnemiopsis leidyi, que é passível de imagens ao vivo.
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Artigo de método
Remoção Cirúrgica de um Órgão Sensorial Complexo em Ctenóforos Altamente Regenerativos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O ctenóforo Mnemiopsis leidyi é um modelo animal clássico de regeneração de corpo inteiro. O aumento da tratabilidade de muitas técnicas laboratoriais e sua colocação filogenética como o provável grupo irmão dos Metazoa restantes levou a uma recente renovação do interesse científico em trabalhar com ctenóforos. Eles podem regenerar qualquer órgão ou tipo de célula ausente, incluindo a regeneração completa de todo o corpo a partir de um fragmento tão pequeno quanto ~ 15% do corpo, ao longo de alguns dias. Como a maioria dos ctenóforos, M. leidyi tem um órgão sensor de gravidade localizado aboralmente que liga a entrada sensorial à saída motora para controlar a posição e orientação do corpo. Este protocolo demonstra a remoção cirúrgica do complexo do órgão aboral (AO) e estruturas associadas em M. leidyi , juntamente com métodos de cultura, manuseio e montagem apropriados para visualizar os processos de cicatrização e regeneração de feridas que ocorrem nas próximas horas a dias. Essas técnicas diretas são amplamente adaptáveis a diferentes paradigmas experimentais e contextos de laboratório.
Introdução
Os ctenóforos, também conhecidos como águas-vivas-de-pente, são cosmopolitas para os ambientes marinhos da Terra e podem ser os principais atores nos ecossistemas, particularmente como parte da cadeia alimentar. O ctenóforo Mnemiopsis leidyi é um modelo animal historiado e cada vez mais popular de regeneração de corpo inteiro 1,2. Sua capacidade de regenerar qualquer órgão ou tipo de célula ausente surge no final da embriogênese e persiste ao longo de sua vida pós-embrionária 3,4 (~ 0,1 a >1.000 mm de tamanho corporal). Eles também são transparentes ao longo de sua vida útil e são passíveis de diversas técnicas de imagem ao vivo e fixas. O ancestral comum mais recente de todos os ctenóforos tinha muitos tipos de células e órgãos complexos; a maioria dos ctenóforos existentes possui a maioria deles durante pelo menos um estágio da vida: um órgão aboral sensível à gravidade (historicamente chamado de órgão apical e aqui chamado de órgão aboral, AO), estruturas locomotoras especializadas compostas de macrocílios altamente organizados que batem de maneira coordenada (fileiras de pentes), tentáculos de alimentação retráteis e fotócitos que bioluminescem em resposta a estímulos nocivos (Figura 1).
Apesar de seus numerosos tipos de células e comportamentos complexos e dependentes do contexto, um corpo robusto de dados genômicos apóia a colocação dos ctenóforos como o provável grupo irmão de todos os outros animais vivos 5,6,7,8. Grandes diferenças na base celular e funcional do sistema nervoso do ctenóforo de outros animais que possuem um sistema nervoso (bilaterianos e cnidários) sugeriram a hipótese de que o sistema nervoso do ctenóforo representa uma origem independente; no entanto, isso permanece incerto 9,10,11,12.
O complexo de órgãos sensoriais aboral inclui o estatocisto, que inclui muitos tipos de células, incluindo vários tipos de células neurossensoriais putativas 13,14,15,16,17,18, e está sob constante manutenção em ctenóforos não manipulados. As células mecanossensoriais possuem grandes feixes ciliares, que são desviados por um estatolita composto de células biomineralizadas (chamadas litócitos) para detectar a gravidade. Dois "campos polares", que contêm estruturas sensoriais putativas de função desconhecida14 e prováveis células fotossensoriais16, são adjacentes ao estatocisto.
A investigação experimental da capacidade regenerativa de M. leidyi abrangeu os menores animais na transição embrião para filhote (~ 100 μm) para os adultos macroscópicos de vida livre (>2 cm). M. leidyi de ~ 1 mm de diâmetro corporal são grandes o suficiente para permitir a manipulação cirúrgica manual sem instrumentos especiais, como micromanipuladores, mas são pequenos o suficiente para serem montados em uma lâmina de microscópio padrão para imagens com objetivas de alta potência. Este protocolo demonstra a remoção cirúrgica do órgão sensorial aboral e estruturas associadas, juntamente com métodos de cultura e imagem apropriados para documentar os processos de cicatrização e regeneração de feridas que ocorrem nas próximas horas a dias.
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Protocolo
1. Prepare ferramentas e suprimentos
- Usando um bico de Bunsen padrão, puxe manualmente as agulhas de dissecção de vidro de micropipetas capilares de vidro. Para animais com mais de 1 mm, use micropipetas calibradas de vidro sodo-cálcico destinadas ao manuseio de líquidos.
NOTA: O tamanho de 100 μl funciona bem na faixa focal de 0,5-3 mm.- Estabeleça um cone azul afiado de chama no bico de Bunsen.
- Segure o ponto central da pipeta de vidro na chama até que esteja amolecido o suficiente para se mover sob uma leve pressão.
- Retire a pipeta da chama e separe imediatamente os dois lados para criar uma agulha curta e forte.
NOTA: O bordado de vidro pode ser derretido novamente se um resultado satisfatório não for obtido na primeira tentativa, e agulhas quebradas podem ser salvas e puxadas novamente. Consulte a Figura 2 para obter exemplos de agulhas utilizáveis e inutilizáveis puxadas por esse método.
ALTERNATIVA: Agulhas de 26 G de 1/2 polegada também funcionam bem, especialmente na extremidade maior da faixa de tamanho focal.
- Prepare água do mar estéril passando água do mar natural ou artificial por um filtro de 0,22 μm.
- Crie pipetas de medição.
- Usando uma tesoura afiada ou uma lâmina de barbear, corte uma pipeta de transferência de plástico para produzir uma abertura com o diâmetro interno do tamanho preferido. Mantenha pronta pelo menos uma pipeta para o topo da faixa desejada e outra para a parte inferior da faixa desejada. Consulte a Figura 3 para obter um exemplo de conjunto de pipetas de medição.
NOTA: Essas pipetas funcionam bem até ~8 mm. Também é possível estimar o tamanho com um micrômetro ou ferramentas de medição a partir de fotografias.
- Usando uma tesoura afiada ou uma lâmina de barbear, corte uma pipeta de transferência de plástico para produzir uma abertura com o diâmetro interno do tamanho preferido. Mantenha pronta pelo menos uma pipeta para o topo da faixa desejada e outra para a parte inferior da faixa desejada. Consulte a Figura 3 para obter um exemplo de conjunto de pipetas de medição.
2. Preparar os animais para a experiência
- Selecione indivíduos morfologicamente normais do tamanho e estágio desejados.
NOTA: Achamos que animais de ~0,5-3 mm de diâmetro são ideais para montagem em slides. Verifique se os animais não cabem na pipeta de tamanho inferior, mas se encaixam confortavelmente na pipeta de tamanho superior. - Matar animais experimentais de fome por 8-16 h.
NOTA: Embora M. leidyi seja opticamente transparente e não altamente autofluorescente, os alimentos que circulam pelo sistema digestivo são geralmente opacos e muitas vezes autofluorescentes.
3. Execute cortes
- Utilizar uma pipeta de transferência mais larga do que o tamanho do corpo do animal experimental para o transferir para uma placa de poliestireno de 35 mm contendo água do mar estéril.
- Visualize a amostra usando o microscópio de dissecação. Role um animal para o lado adesofágico (Figura 1). Esta visão dá o acesso mais fácil para remover o órgão aboral. Concentre-se no órgão aboral.
NOTA: A ampliação mais útil pode variar de acordo com o tamanho do animal e a preferência do usuário. Geralmente, a ampliação de 12-20x funciona bem. - Segure suavemente o animal no lugar com uma agulha de vidro usando a mão não dominante.
- Usando a mão dominante, insira a ponta de uma agulha ligeiramente abaixo do órgão aboral. Entre obliquamente para fazer um corte de uma borda visível do órgão aboral até abaixo de sua base. Retire a agulha e faça um segundo corte para remover um pedaço de tecido em forma de cunha contendo todas as estruturas do órgão abdominal (ver Figura 4, painel superior). Examinar cuidadosamente o animal e o tecido excisado para garantir que a operação foi bem sucedida.
- Use a mesma pipeta de transferência para mover o animal recém-cortado para um prato fresco contendo água do mar estéril.
NOTA: A ferida fechará rapidamente, portanto, dependendo dos objetivos experimentais (como para várias amostras de regeneração síncrona ou para visualizar os estágios iniciais de cicatrização e regeneração), deve-se mover rapidamente para gerar várias amostras. Use um cronômetro para limitar o tempo cirúrgico para manter as coortes de animais em regeneração mais próximas.
4. Verifique se os cortes estão corretos
NOTA: Mesmo verificando cuidadosamente ao microscópio de dissecação, ocasionalmente é possível perder erros cirúrgicos.
- Siga as etapas de montagem abaixo para montar temporariamente cada indivíduo pós-cirúrgico em uma lâmina de vidro para verificar sob um microscópio composto com DIC se todas as estruturas pretendidas foram removidas corretamente. Realize esta verificação mesmo que não esteja realizando mais imagens neste momento.
NOTA: As excelentes habilidades de cura dos ctenóforos os emprestam bem para experimentos de enxerto; sempre removemos os órgãos aborais excisados do vaso de cultura para evitar a possibilidade de que os lados cortados de um AO removido e o resto do animal do qual ele foi removido possam grudar e se fundir.
Se não prosseguir diretamente para a imagem de longo prazo, não sele a lâmina. Isso facilitará a rápida recuperação e retorno à cultura deste animal experimental. Recomenda-se verificar a precisão cirúrgica sob alta ampliação. Em particular, o estatolito pode ser retirado da cúpula sem completar a cirurgia.
5. Imagens ao vivo
- Montagem
- Trate uma lâmina de microscópio de vidro padrão com um agente de silanização, como um repelente de água para tratamento de vidro, e deixe secar completamente.
- Transfira um animal pós-cirúrgico para uma lâmina preparada com uma pipeta de transferência. Confirme se a água escorre com o animal dentro.
- Coloque uma pequena quantidade de massa de modelar (~ 1,5 mg) em cada canto de uma lamínula para formar "pés" que servirão como espaçador para levantar a lamínula do animal.
- Coloque delicadamente a lamínula, com argila para baixo, em cima do animal. Segurando cada canto da lamínula, role o animal para a posição de imagem. Pressione para baixo para comprimir ligeiramente o animal, segurando-o no lugar. Reposicione a amostra o quanto for necessário para obter uma visão satisfatória.
- Para imagens por mais de ~30 min, aplique uma fina camada de vaselina em cada borda da lamínula para evitar o ressecamento da amostra.
NOTA: M. leidyi montado desta forma pode ser recuperado facilmente para cultura posterior ou outros ensaios. No entanto, os animais geralmente se soltam e se reposicionam dentro de 1-2 h, portanto, uma captura contínua de lapso de tempo por mais de 2 h exigiria uma abordagem de imagem diferente.
6. Cultura
- Condições de cultura cidípida
- Animais manipulados cirurgicamente e controles em água do mar natural ou artificial filtrada perto da temperatura ambiente. Use uma incubadora ajustada para 20-22 °C para garantir resultados consistentes.
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Resultados
M. leidyi em estágio cidipídeo normalmente completa o fechamento da ferida dentro de ~ 20 minutos após a lesão (Figura 4 e Figura 5), enquanto a regeneração completa do órgão pode levar de 1 a 3 dias. Esse tempo tem alguma variabilidade biológica, mas é quase invariavelmente concluído em 72 h após a cirurgia (Figura 6).
A remoção cirúrgica de células e mesogleia do complexo de órgãos aborais e te...
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Discussão
Experimentos semelhantes podem ser realizados em qualquer tamanho de M. leidyi desejado; A morfogênese do órgão é concluída concomitantemente com o início da capacidade regenerativa4. Os animais podem ser coletados na natureza19 ou criados em laboratório20,21. Se um determinado tamanho corporal for desejado, os animais podem ser autorizados a desovar e a prole aumentada até...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Jovita Joseph.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,2 μ m Filtro de seringa SFCA | Thermo/Nalgene | 723-2520 | Crie água do mar estéril |
| Placa de Petri de poliestireno de 35 mm | Falcão / Corning | 351008 | realizar cortes; cultura pequenos animais |
| Seringa descartável de 60 mL luer-lock | BH Suprimentos | BH60LL | Crie água do mar estéril |
| Pipetas de vidro calibradas, 100 μ L | Drummond | 2-000-100 | realizar cortes |
| Óculos de cobertura, #1.5, 18 mm quadrados | VWR | 16004-326 | montagem para imagem |
| Ctenóforos | Espécimes do Golfo | animais vivos | |
| Corrediças de depressão de vidro de cavidade dupla, 1,3 mm | VWR | 470200-930 | montagem para imagem |
| lâminas de microscópio de vidro | VWR | 16004-398 | montagem para imagem |
| Sal marinho oceano instantâneo | Oceano instantâneo | Meio de cultura animal | |
| mini régua | Ted Pella | 13623 | pipetas de plástico de medição |
| massa de modelar (plasticina) | Pepy Plastilina | montagem para imagem | |
| geléia de petroelum | Vaselina | montagem para imagem | |
| pipetas de transferência de plástico (tamanhos variados) | Cole-Parmer | 06226-13, 06226-12, 06226-01 | Mova pequenos animais |
| Tratamento de vidro Rain-X | Chuva-X | lâminas de microscópio silanize | |
| régua | Westcott | 10564 | pipetas de plástico de medição |
| tesoura | OXO | pipetas de plástico cortadas |
Referências
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