Artigo de método

Isolamento e captação de células dendríticas de pequenas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

DOI:

10.3791/67559

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28 de março de 2025

 ,  ,  , 
1IIPROSAM, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Mar del Plata (UNMdP), 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3IQUIBIM, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Mar del Plata (UNMdP)

Neste artigo

Resumo

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Aqui, descrevemos as condições de cultivo in vitro , isolamento e aumento da geração de vesículas extracelulares (EVs) de Echinococcus granulosus. Os pequenos EVs foram caracterizados por espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão. A captação por células dendríticas derivadas da medula óssea e sua modulação fenotípica foram estudadas por meio de microscopia confocal e citometria de fluxo.

Resumo

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A secreção de vesículas extracelulares por cestóides é crucial para permitir a comunicação celular não apenas entre parasitas, mas também com tecidos hospedeiros. Em particular, pequenas vesículas extracelulares (sEVs) atuam como nanocarreadores transferindo antígenos naturais, que são críticos na imunomodulação do hospedeiro e na sobrevivência do parasita. Este artigo apresenta um protocolo passo a passo para isolar sEVs de culturas em estágio larval de Echinococcus granulosus e analisa sua captação por células dendríticas obtidas da medula óssea murina, que adquirem capacidade de adesão e apresentação de antígenos durante sua maturação após uma semana de cultivo in vitro . Este artigo fornece informações abrangentes para gerar, purificar e quantificar sEVs usando ultracentrifugação, juntamente com análises paralelas de espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão. Além disso, um protocolo experimental detalhado é delineado para isolar e cultivar células da medula óssea de camundongos e conduzir sua diferenciação em células dendríticas usando Flt3L. Essas células dendríticas podem apresentar antígenos para células T virgens, modulando assim o tipo de resposta imune in vivo. Assim, protocolos alternativos, incluindo microscopia confocal e análise por citometria de fluxo, são propostos para verificar o fenótipo maturacional adquirido de células dendríticas previamente expostas a sEVs parasitas. Por fim, vale ressaltar que o protocolo descrito pode ser aplicado como um todo ou em partes individuais para realizar cultura parasitária in vitro , isolar vesículas extracelulares, gerar culturas de células dendríticas derivadas da medula óssea e realizar ensaios de captação com essas células.

Introdução

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Echinococcus granulosus é um helmintos parasita zoonótico responsável por uma infecção de longa duração conhecida como equinococose cística1. Em hospedeiros intermediários, como gado e humanos, a infecção por parasitas afeta principalmente o fígado e os pulmões, onde o estágio larval se desenvolve como cistos cheios de líquido ou metacestóides contendo protoscoleces (a própria larva). Como todos os cestóides, este parasita carece de sistemas digestivo e excretor e, portanto, desenvolveu processos celulares endocíticos e exocíticos ativos para regular a captação e excreção de metabólitos, bem como a liberação de vesículas extracelulares2,3. As vesículas extracelulares (EVs) são partículas lipídicas fechadas por aparentemente todos os tipos de células. Em particular, pequenas vesículas extracelulares (sEVs), definidas como EVs menores que 200 nm, independentemente de sua origem biogênica4, podem atuar como mediadores imunes intercelulares. Essa função é especialmente significativa em parasitas, que dependem da imunomodulação do hospedeiro para garantir sua sobrevivência3. A manipulação imunológica é alcançada através da captação de sEVs pelas células dendríticas do hospedeiro, as únicas células capazes de ativar células T virgens in vivo e iniciar uma resposta imune adaptativa que levará à infecção crônica por esses vermes parasitas. As células dendríticas, células apresentadoras de antígenos profissionais do sistema imune inato, processam e carregam peptídeos antigênicos no Complexo Principal de Histocompatibilidade Classe I e Classe II (MHC I e MHC II) e os exibem em suas membranas para priming exclusivo de células T virgens (células T CD8+ e CD4+ , respectivamente)5. As células dendríticas seguintes induzem sua maturação por indução da expressão dos marcadores co-estimulatórios CD80/CD86 e CD40 e MHC-II e migram dos tecidos periféricos para os órgãos linfóides secundários ao reconhecer antígenos estranhos, carregando-os para priming exclusivo de células T virgens6. Assim, o objetivo geral deste protocolo é estudar a comunicação helmintos parasito-hospedeiro de forma realista, analisando o empacotamento e a entrega de componentes parasitários na forma de sEVs, que, ao atingirem as células imunes do hospedeiro, influenciam o desenvolvimento da infecção e a progressão da doença parasitária crônica.

Abordar a análise da interface helminto-hospedeiro por meio do estudo de sEVs tem várias vantagens. Primeiro, o tegumento, a cobertura externa dos platelmintos, é uma estrutura de membrana dupla que constitui um importante ponto de cruzamento entre o parasita e seu hospedeiro, permitindo que os sEVs sejam prontamente gerados ou permeados a partir dessa estrutura7. Em segundo lugar, os sEVs são altamente carregados com antígenos proteicos de todos os estágios do ciclo de vida do parasita, representando a maneira natural pela qual o sistema imunológico do hospedeiro coleta amostras de antígenos durante a infecção por vermes 8,9. Devido à sua produção biológica, facilidade de purificação (sem a necessidade de ruptura tecidual ou fracionamento de proteínas) e interação direta com as células hospedeiras, os sEVs de helmintos permitem o desenvolvimento de experimentos in vitro para simular as condições in vivo de interação parasita-hospedeiro. Finalmente, os sEVs representam a possibilidade de ter estruturas parasitárias que podem ser fagocitadas ou internalizadas pelas células hospedeiras, superando a impossibilidade de fazê-lo com parasitas inteiros, particularmente nos casos de vermes encistados.

Considerando as vantagens mencionadas e o fato de que as helmintíases são prevalentes e tipicamente doenças crônicas nas quais os parasitas presumivelmente manipulam o sistema imunológico do hospedeiro como estratégia de sobrevivência, o isolamento de EVs derivados do parasita e seu estudo em interação com células dendríticas fornece uma estrutura valiosa para explorar essa imunomodulação10. Nesse sentido, foi descrito que a internalização de EVs de helmintos, incluindo nematóides e platelmintos, como Schistosoma mansoni, Fasciola hepatica, Brugia malayi e E. granulosus, induz a maturação e ativação de células dendríticas 9,11,12,13,14,15.

O isolamento de EVs derivados de helmintos não apenas permite o estudo de interações imunológicas, potencialmente levando ao desenvolvimento de vacinas protetoras ou agentes imunoterapêuticos para doenças alérgicas ou autoimunes, mas também facilita a exploração de outras interações e funções biológicas 8,16,17. Nesse contexto, os EVs, que desempenham um papel na história natural das infecções parasitárias, podem ser utilizados para investigar o desenvolvimento do parasita e as interações com células hospedeiras específicas. Além disso, podem ter aplicações potenciais como biomarcadores precoces ou diferenciais para o diagnóstico de doenças parasitárias, monitorando respostas terapêuticas e contribuindo para o controle e manejo de infecções parasitárias17,18.

Além disso, como demonstrado anteriormente, o estágio larval de E. granulosus é suscetível a alterações na concentração citosólica de cálcio, que, além de desempenhar um papel na viabilidade do parasita, também controla a taxa de exocitose19,20. Nesse contexto, e sabendo que a elevação do cálcio intracelular aumenta a liberação de EV, usar um intensificador de cálcio intracelular como a loperamida pode ser uma estratégia crucial para aumentar o número de EVs. Essa abordagem é particularmente interessante para sistemas celulares que requerem grandes populações para gerar uma quantidade adequada de EVs para carga e análise funcional 11,21,22. O protocolo atual (Figura 1) detalha os métodos para obtenção de culturas puras do estágio larval de E. granulosus e as condições que aumentam a produção de sEV. Também descreve o fluxo de trabalho para o isolamento e caracterização dessas vesículas, bem como sua captação pelas células dendríticas murinas, uma etapa essencial no estudo inicial da modulação do sistema imune do hospedeiro.

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Protocolo

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Todos os procedimentos envolvendo animais foram avaliados e aprovados pelo Comitê Experimental Animal da Faculdade de Ciências Exatas e Naturais de Mar del Plata (números de permissão: RD544-2020; RD624-625-2021; RD80-2022). Nesse protocolo, os camundongos foram eutanasiados, de acordo com o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" publicado pelo NIH e as diretrizes do Serviço Nacional de Saúde e Qualidade Alimentar (SENASA).

1. Cultivo em estágio larval de Echinococcus

NOTA: Todos os procedimentos foram realizados em condições assépticas.

  1. Obtenção de E. granulosus protoscoleces
    1. Aspire com uma agulha de 21 G e uma seringa de 10 mL parte do fluido hidático do pulmão ou fígado de bovinos infectados para reduzir o turgor do cisto (Figura 2A).
      NOTA: Os pulmões e fígados infectados vêm de bovinos apresentados para abate de rotina no matadouro. Devem ser mantidos a 4 °C e transformados nas 24 horas seguintes ao abate.
    2. Abra o cisto com uma tesoura e remova as camadas laminar e germinativa do cisto usando uma pinça. Coloque-os em uma placa de Petri estéril, junto com qualquer fluido hidático restante ( Figura 2B, C ).
      NOTA: Neste ponto, recomenda-se observar a placa de Petri sob um microscópio invertido para avaliar a qualidade dos protoscólices e cápsulas de cria. Evite agrupar o material biológico de cistos com mais de 50% dos protoscólices colapsados, que são identificados por seu soma contraído, cor mais escura e rostelo desorganizado com perda de ganchos.
    3. Lave as camadas com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) suplementada com antibióticos (100 μg / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina, 100 μg / mL de gentamicina 100 μg / mL) para remover os protoscoleces.
      NOTA: Todas as lavagens serão realizadas com PBS suplementado com antibióticos.
    4. Transferir a suspensão de protoscólex para um tubo de vidro Khan estéril utilizando uma pipeta Pasteur.
    5. Lavar os protoscólices com PBS suplementado a 4 °C com uma pipeta Pasteur para remover os parasitas mortos. Ressuspenda vigorosamente a suspensão para quebrar as cápsulas de cria, facilitando a liberação do protoescólex. Deixe os protoscólices assentarem por 1–2 min no fundo do tubo; Em seguida, descarte o sobrenadante contendo os protoscoleces mortos.
      NOTA: Devido a uma diferença de densidade, os protoscólices vivos se instalam mais rapidamente do que os parasitas mortos.
    6. Repita o processo de lavagem até que todos os protoscoleces mortos e flutuantes tenham sido removidos.
      NOTA: Os parasitas mortos são removidos quando todos se acomodam na mesma taxa.
    7. Determinar a viabilidade dos protoscólices utilizando o teste de exclusão do metileno.
      1. Ressuspenda os protoscoleces lavados com uma pipeta e coloque uma gota em uma lâmina. Adicione uma gota de 0,1 mg/mL de azul de metileno e cubra com uma lamínula. Aguarde 2–3 minutos e observe ao microscópio.
      2. Conte o número total de protoscólices vivos (não corados) e mortos (manchados de azul) e calcule a porcentagem de protoscólices viáveis (Figura 2D e inserção).
        NOTA: A viabilidade dos protoscoleces deve ser em torno de 98% antes de estabelecer as culturas. O tempo de coloração não deve exceder 10 min, pois durações mais longas podem resultar na coloração de parasitas vivos.
  2. Obtenção de metacestóides de E. granulosus
    1. Produza uma doença hidática secundária experimental infectando intraperitonealmente camundongos CF1 fêmeas (peso corporal de 25 ± 5 g) com 1500 protoscólices (equivalente a 10 μL do pellet protocolex) suspensos em 0,5 mL de PBS suplementado ( Figura 2E ).
      NOTA: Recomenda-se manter os protoscoleces em PBS suplementados com antibióticos a 4 ° C por 24 h ou em cultura por 3 a 5 dias antes da infecção.
    2. Os metacestóides se desenvolvem dentro de 4-6 meses após a infecção ( Figura 2F ). Durante este período, alojar os animais em condições controladas de laboratório (temperatura de 20 ± 1 °C, ciclo claro/escuro de 12 h e água e alimentos fornecidos ad libitum). Uma vez que os cistos tenham se desenvolvido, anestesiar os camundongos usando cetamina-xilazina (50 mg / kg / camundongo-5 mg / kg / camundongo) e sacrificá-los por luxação cervical.
    3. Limpe a superfície ventral do camundongo com álcool 70% e abra cirurgicamente a cavidade peritoneal para remover os metacestóides desenvolvidos usando tesoura e fórceps.
    4. Transferir as massas de metacestóides para uma placa de Petri estéril.
      NOTA: As massas metacestóides consistem em múltiplos cistos internos circundados por tecido conjuntivo.
    5. Libere os cistos das massas metacestóides removendo cuidadosamente o tecido conjuntivo que cobre os metacestóides usando uma pinça, se necessário.
      NOTA: Esta etapa garante que os parasitas estejam livres do tecido hospedeiro.
    6. Lave os metacestóides obtidos com PBS suplementado a 4 ° C ( Figura 2G ).
  3. Cultivo de protoscoleces e metacestóides de E. granulosus
    1. Prepare o meio de cultura da seguinte forma: Adicione 100 μg / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina, 100 μg / mL de gentamicina, 4 mg / mL de glicose, 50 mM de tampão Hepes pH 7,5 e meio 199 para atingir o volume final desejado e misture suavemente por inversão.
    2. Transfira 5 mL do meio de cultura preparado para cada tubo de Leighton (Figura 2H-I).
    3. Adicionar os parasitas ao meio de cultura e incubar a 37 °C durante 5 dias sem mudar o meio. Incube os tubos Leighton em um ângulo de 15° para garantir uma distribuição uniforme do material biológico na superfície plana. Isso maximiza a exposição do parasita ao meio de cultura, evitando o contato com a rolha de borracha.
      NOTA: Adicione 9.000–10.000 protoscólices ou 50 metacestóides (com diâmetros variando entre 5 mm e 15 mm distribuídos como 10 cistos por tubo).
    4. Opcionalmente, adicione 20 μM de loperamida (uma concentração subletal) dissolvida em dimetilsulfóxido por 16–24 h no meio de cultura do parasita para aumentar o nível citosólico de cálcio e aumentar a liberação de EV pelo estágio larval de E. granulosus.
      NOTA: Dado que um aumento nas concentrações intracelulares de cálcio aumenta a produção de EV, o tratamento do parasita com compostos que afetam a homeostase do cálcio aumentará a liberação de EV.

2. Purificação de vesículas extracelulares

  1. Coletar o meio de cultura do parasita de cada tubo de Leighton e transferi-lo para um tubo cônico de 15 mL.
    NOTA: O meio de cultura pode ser armazenado por 24 h antes da primeira centrifugação com impacto mínimo na concentração ou distribuição de tamanho das vesículas. Os protoscoleces podem ser lavados três vezes com tampão PBS, colhidos e armazenados a -20 °C em tubos de 1,5 mL.
  2. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C e transferir o sobrenadante para um novo tubo cónico de 15 ml com uma pipeta.
    NOTA: Esta etapa remove protoscoleces mortos. Após cada etapa de centrifugação, certifique-se de que pelo menos 0,5 cm de sobrenadante permaneça acima do pellet para evitar contaminação.
  3. Centrifugue o sobrenadante a 2.000 x g por 10 min a 4 ° C e transfira-o para novos tubos de 1,5 mL usando uma pipeta.
    NOTA: Esta etapa remove detritos de células maiores.
  4. Centrifugue a 10.000 x g por 30 min a 4 °C para remover detritos de células menores.
  5. Transferir o sobrenadante para um tubo adequado ao rotor da ultracentrífuga utilizando uma pipeta. Marque um lado de cada tubo com um marcador antes de colocá-lo no rotor da ultracentrífuga. Em seguida, coloque o tubo no rotor com o lado marcado voltado para cima.
    NOTA: A marca serve como ponto de referência para localizar o pellet após a ultracentrifugação. Os tubos devem estar três quartos cheios e precisamente equilibrados; portanto, se necessário, adicione PBS. Se o volume do sobrenadante exceder a capacidade de um único tubo, divida as amostras em vários tubos e combine-os durante a ressuspensão.
  6. Centrifugue a 100.000 x g por 1 h a 4 °C e despeje o sobrenadante em uma ação rápida. Deixe o tubo descansar de cabeça para baixo por 1 min. O pellet pode não ser visível nesta fase.
    NOTA: O fator k para o rotor usado é 103.
  7. Lave o pellet com pelo menos 3 mL de PBS para remover as proteínas contaminantes. Ressuspenda o pellet pipetando para cima e para baixo várias vezes do lado superior do tubo para o fundo em todas as faces do tubo, mas principalmente no lado marcado onde se espera que o pellet esteja.
    NOTA: Se aplicável, agrupe o pellet ressuspenso derivado do mesmo sobrenadante em um único tubo.
  8. Centrifugue a 100.000 x g por 1 h a 4 °C e despeje o sobrenadante em uma ação rápida. Deixe o tubo descansar de cabeça para baixo por 1 min.
    NOTA: O fator k para o rotor usado é 103.
  9. Ressuspenda o pellet em 30 μL de PBS seguindo o processo descrito na etapa 2.7.
    NOTA: Neste ponto, recomenda-se medir a concentração total de proteína no pellet ressuspenso para estimar a quantidade de sEVs secretados. A concentração de proteínas pode ser determinada medindo a absorbância a 280 nm usando um espectrofotômetro de microvolume.
  10. Transfira a amostra para um tubo de 1,5 mL. Congelar as vesículas extracelulares a -80 °C.
    NOTA: Para preservar a integridade da vesícula para aplicações a jusante, congele o pellet ressuspenso o mais rápido possível e evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.

3. Caracterização das vesículas isoladas

  1. Determinação do tamanho EV usando espalhamento dinâmico de luz (DLS)
    NOTA: O espalhamento dinâmico de luz é um método confiável e sensível para avaliar o tamanho (com base no raio hidrodinâmico, Rh) e a forma de nanopartículas em fluidos complexos, independentemente de seu tipo. As medições de DLS e potencial zeta foram realizadas usando um feixe de laser monocromático He-Ne a 633 nm. Se a análise não for possível no dia da amostragem, as amostras podem ser congeladas num tampão pré-filtrado antes do armazenamento.
    1. Descongele as amostras e mantenha-as no gelo até que as medições sejam feitas.
      NOTA: O congelamento das amostras pode afetar a distribuição de partículas e a integridade dos sEVs. Portanto, evite ciclos de congelamento e descongelamento, pois eles podem levar a uma diminuição no sinal LS com alturas de pico reduzidas.
    2. Filtre as amostras aquosas usadas para DLS através de um filtro de tamanho de poro de 0,2 μm.
      NOTA: Nos experimentos LS, é essencial filtrar todas as soluções, tampões e amostras aquosas para remover partículas grandes e poeira, que podem interferir nas medições.
    3. Diluir as amostras 1:10 a 1:50 em PBS pré-filtrado.
    4. Misture as amostras por inversão suave antes de cada medição para evitar sedimentação, pois a intensidade do LS pode diminuir devido ao maior tempo de processamento da amostra.
    5. Adicione 1 mL da amostra em uma cubeta limpa, posicionando o lado não fosco no caminho do laser à esquerda no instrumento. Feche a tampa e aguarde 2–3 min para o equilíbrio antes de medir a amostra.
    6. Meça o tamanho em termos do raio hidrodinâmico (Rh) antes de realizar a medição do potencial zeta. Registar as medições num único ângulo de dispersão (θ = 90° a 150°) a 25 °C ± 1 °C.
    7. Clique em Painel de Controle para verificar as leituras e iniciar a aquisição de dados.
      NOTA: Com base nos valores médios de Rh e nas distribuições de tamanho avaliadas para sEVs, um pico entre 30 nm e 200 nm deve ser observado (Figura 3). Picos abaixo de 15 nm em Rh são atribuídos a ácidos nucléicos e proteínas em suspensão. Normalmente, as distribuições de tamanho são calculadas a partir do raio hidrodinâmico médio. No entanto, a média Z (tamanho médio de partícula na amostra), o índice de polidispersidade (PDI, que determina a heterogeneidade de tamanho de uma amostra) e a dependência angular da intensidade da luz espalhada também podem ser relatados.
  2. Determinação da estrutura e tamanho de partícula por microscopia eletrônica de transmissão (MET)
    NOTA: Realize microscopia eletrônica de transmissão de coloração negativa para avaliar o tamanho, a estrutura e a pureza dos sEVs, usando um protocolo padrão que inclui fixação, desidratação, incorporação de resina e contraste para preparações de sEV de montagem inteira.
    1. Descongele as amostras concentradas de sEV da etapa 2.10 e mantenha-as no gelo.
    2. Fixe sEVs em tubos de 1,5 mL. Aplique cuidadosamente 5–10 μL de glutaraldeído a 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7) a ~5 μL do pellet de amostra sEV (concentração necessária de sEV ≈ 1 x 108–1 x 109 mL-1) e incube por 2 h a 4 °C.
      NOTA: os sEVs podem ser armazenados por até 1 semana a 4 ° C em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M antes do processamento posterior. Portanto, se forem necessários serviços técnicos externos para a análise de MET, envie as amostras fixas de sEV refrigeradas em tubos de 1,5 mL.
    3. Deposite 5 μL dos pellets ressuspensos nas grades de cobre EM revestidas com carbono Formvar de 300 malhas. Prepare duas ou três grades para cada amostra.
    4. Deixar a amostra adsorver durante 20 min num ambiente seco e remover o excesso de amostra da grelha com papel de filtro.
    5. Coloque gotas de 100 μL de PBS em uma folha de filme. Usando uma pinça limpa, transfira as grades (com o lado da amostra adsorvido para baixo) para as gotas de PBS para lavagem.
    6. Seque o lado oposto da amostra adsorvida, certificando-se de que o lado da amostra das grades não seque durante nenhuma das etapas a seguir.
      NOTA: Para todas as etapas subsequentes, coloque gotas de reagentes em um filme plano e transfira as grades para as gotas usando uma pinça.
    7. Transfira as grades para uma gota de 50 μL de glutaraldeído a 1% por 5 min.
    8. Lave as grelhas com uma gota de 100 μL de água destilada e deixe repousar durante 3 min. Repita nove vezes para um total de dez lavagens.
    9. Compare as grades de amostra com uma gota de 50 μL de solução de acetato de uranila a 1% p / v, pH 7, por 1 min.
    10. Contraste e incorpore as grades em uma mistura de 100 μL de acetato de uranila a 4% e 900 μL de metilcelulose a 2%.
    11. Seque as grades ao ar por 5 a 10 minutos enquanto elas permanecem no loop e observe-as com um microscópio eletrônico de 80 a 100 kV com resolução de 0,2 nm e ampliação de 100.000x.
    12. Armazene as grades em caixas de armazenamento seco para armazenamento de longo prazo.

4. Geração de células dendríticas derivadas da medula óssea

NOTA: Este procedimento deve ser realizado em camundongos jovens, que são caracterizados por sistemas hematopoiéticos robustos com capacidades ativas de proliferação e diferenciação. Em contraste, camundongos mais velhos exibem declínios na função hematopoiética, reservas reduzidas de células-tronco, interações de nicho alteradas e um reservatório de memória mais desenvolvido, que é crucial para imunidade de longo prazo e resposta a patógenos ou alterações relacionadas à idade, como imunossenescência.

  1. Eutanasiar um camundongo CF-1 fêmea de 5 a 8 semanas de idade de acordo com as diretrizes éticas institucionais, minimizando o sofrimento animal.
  2. Pulverize o camundongo com etanol antes de colocá-lo em uma capa de cultura de tecidos.
    NOTA: As etapas a seguir devem ser executadas em condições estéreis.
  3. Coloque o mouse em uma placa de dissecação na posição supina. Usando uma pinça e uma tesoura de dissecação, faça uma incisão vertical em "T" acima da uretra e estenda-a horizontalmente até o topo das extremidades inferiores, tomando cuidado para não romper o peritônio ou perfurar nenhum órgão, especialmente o intestino.
  4. Separe a pele ao longo de ambos os membros posteriores para expor os ossos e tecidos das pernas usando uma pinça. Com as mãos, retire a pele de cada perna empurrando do tornozelo em direção ao abdômen, puxando a pele para o lado oposto. Ambas as pernas ficarão livres de pele.
    NOTA: Descarte o corpo do camundongo no saco de resíduos de patógenos.
  5. Usando tesoura e fórceps, remova cuidadosamente o fêmur e a tíbia, evitando a quebra. Prenda a ponta de cada osso com uma pinça e corte os tendões para remover as fáscias musculares ao redor dos ossos. Limpeza completa do tecido muscular com guardanapos de papel.
  6. À medida que cada osso é removido, coloque-o em um tubo estéril de 50 mL contendo 2 mL de meio completo preparado com meio RPMI suplementado com 5% de FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 U / mL de estreptomicina e 10 μg / mL de gentamicina para remover os detritos. Em seguida, aspirar e descartar o meio de cultura e lavar os ossos duas vezes com etanol a 70% por 5 min.
  7. Transfira os ossos para uma placa de Petri estéril.
  8. Corte as duas epífises ósseas usando uma tesoura de dissecação afiada para acessar as células da medula óssea.
  9. Lave cuidadosamente as células da medula óssea de cada um dos quatro ossos em uma placa de Petri estéril usando uma agulha de 25 G conectada a uma seringa de 20 mL contendo meio completo. Os ossos ficarão mais transparentes à medida que a medula óssea for extraída.
    NOTA: Um volume de 20 mL do meio completo deve ser suficiente para eluir as células da medula óssea dos dois fêmures e tíbias.
  10. Homogeneizar suavemente o meio com a medula eluída pipetando para remover o tecido conjuntivo ósseo e os nódulos celulares. Em seguida, transfira a amostra para um tubo cônico estéril de 50 mL, passando as células por um filtro estéril de células de polipropileno de 70 μm para remover o tecido conjuntivo e os restos ósseos.
  11. Centrifugue as células a 450 x g durante 7 min a 4 °C. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante, garantindo que o pellet permaneça aderido à parede do tubo.
  12. Incube as células por 1 min em temperatura ambiente (RT) e, em seguida, ressuspenda-as em 500 μL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC). Neutralize o tampão de lise adicionando 3 mL de meio completo.
  13. Centrifugue as células a 450 x g durante 7 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 ml de meio completo.
  14. Passe a suspensão celular através de um filtro estéril de células de polipropileno de 70 μm para um tubo cônico estéril de 50 mL para remover os agregados celulares dos eritrócitos lisados.
  15. Conte as células usando um hemocitômetro.
  16. Adicione 300 ng/mL de ligante tirosina quinase 3 (Flt3L) referente murino recombinante relacionado a Fms ao meio de cultura.
  17. Coloque as células em uma concentração de 1 x 106 células/mL em uma placa multipoços.
  18. Incubar as células durante 7 dias a 37 °C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2.
    NOTA: Evite agitar as células enquanto elas se diferenciam e crescem para evitar a maturação espontânea.
  19. No dia 3, remova 1 mL de meio de cada poço (evitando perturbação das células) e substitua-o por 1 mL de meio completo fresco pré-aquecido suplementado com 150 ng/mL de Flt3L murino recombinante.

5. Interação entre células dendríticas derivadas da medula óssea e vesículas extracelulares de E. granulosus

  1. Coloração da membrana da vesícula extracelular
    1. Descongele os sEVs armazenados na etapa 2.10 e mantenha-os no gelo.
    2. Ressuspenda 10 μL de sEVs purificados em 10 μL de veículo de rotulagem (Diluente C).
    3. Adicione 20 μL de solução de corante 2x PKH26 para atingir uma concentração final de 2 μM. Misture delicadamente usando uma pipeta e incube por 35 min a 37 ° C no escuro.
      NOTA: A solução de corante 2x PKH26 (4 μM) deve ser preparada imediatamente antes da coloração, adicionando 0,5 μL de solução de corante etanólico PKH26 a 125 μL de diluente C.
    4. Misture delicadamente a cada 3–5 minutos durante a incubação para garantir uma coloração homogênea.
    5. Adicione 40 μL de BSA 1% e incube por 10 min em RT para interromper o processo de coloração.
    6. Lave os sEVs com 1 mL de PBS e centrifugue a 100.000 x g por 1 h a 4 ° C para remover o excesso de corante.
      NOTA: O fator k para o rotor é 103.
    7. Ressuspenda o pellet em 90 μL de PBS seguindo o protocolo descrito na etapa 2.7.
  2. Estimulação de células dendríticas derivadas da medula óssea murina com vesículas extracelulares de E. granulosus
    1. Colha células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs) do poço da placa de cultura e transfira-as para tubos de 1,5 mL.
      NOTA: Manuseie com cuidado para evitar a maturação celular espontânea.
    2. Centrifugue o meio a 450 x g por 5 min para pellet as células.
      NOTA: Reserve os sobrenadantes da centrifugação para recolocar as células em placas nas etapas subsequentes da análise de citometria de fluxo.
    3. Ressuspenda os BMDCs em 30 μL de sEVs não corados da etapa 2.10 para análise de citometria de fluxo ou em 90 μL de sEVs corados contendo PBS da etapa 5.1.7. para microscopia confocal. Incubar durante 30 min a 37 °C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2. Misture delicadamente a amostra a cada 10 min.
      NOTA: Para garantir o contato efetivo entre BMDCs e sEVs, os primeiros 30 minutos de incubação devem ser realizados em um volume mínimo usando tubos de 1,5 mL.
    4. Para microscopia confocal, transfira as células para uma lamínula de vidro tratada com azul Alcian (12 mm de diâmetro) colocada em uma placa de 24 poços. Incubar durante mais 30 minutos a 37 °C numa câmara humidificada com 5 % de CO2.
      NOTA: O tratamento com azul de Alciano confere uma carga positiva à lamínula, facilitando a aderência das membranas plasmáticas carregadas negativamente dos BMDCs.
      1. Para preparar as lamínulas, mergulhe-as em um corante Alcian blue 8 GX a 1% filtrado e aqueça-as no micro-ondas por 1–2 min sem ferver. Incube-os na solução quente por 10 min, girando a cada 2 a 3 min.
      2. Em seguida, lave as lamínulas com água destilada deionizada para remover o excesso de azul Alcian e seque-as em papel toalha. Por fim, autoclave as lamínulas e guarde-as em condições estéreis até o uso.
    5. Para a análise por citometria de fluxo, transferir os BMDCs-sEVs de volta para o mesmo poço de onde foram colhidos (ver etapa 5.2.1), adicionar os sobrenadantes reservados da etapa 5.2.2 e incubar por 18 h a 37 ° C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2.
      NOTA: Deixe aproximadamente 500 μL de meio no poço para evitar a dessecação das células restantes após a coleta.
    6. Use controles positivos e negativos para avaliar a maturação do BMDC. Estimule as células com 100 ng/mL de lipopolissacarídeo (LPS) por 18 h como controle positivo. Para um controlo negativo da endocitose, incubar BMDCs com sEVs a 4 °C. Além disso, inclua um controle de células dendríticas não estimulado.
  3. Microscopia confocal de vesículas extracelulares de E. granulosus capturadas e internalizadas por células dendríticas derivadas da medula óssea.
    1. Uma vez terminado o período de incubação descrito no passo 5.2.4, aspirar e rejeitar o PBS da lamínula.
    2. Fixe os BMDCs adicionando 100 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% sobre a lamínula e incube por 10 min em RT.
      NOTA: Certifique-se de que o volume mantenha a tensão superficial na lamínula.
    3. Aspire e descarte o PFA e, em seguida, lave a lamínula três vezes com PBS-BSA 2%.
    4. Adicione 100 μL de PBS contendo anticorpo anti-MHC classe II-FITC diluído 1/100 e incube por 1 h em RT no escuro.
    5. Aspirar e rejeitar a solução de anticorpos e lavar a lamínula três vezes com PBS-BSA 2%.
    6. Adicione 100 μL de DAPI de 50 ng/mL e incube por 30 min em temperatura ambiente em uma câmara úmida para contracorar os núcleos.
    7. Aspirar e rejeitar a solução de corante e lavar a lamínula três vezes com PBS-BSA 2 %.
    8. Remova a lamínula usando uma pinça de ponta fina curva e seque-a em uma toalha de papel para eliminar o excesso de líquido.
    9. Monte a lamínula voltada para baixo em uma lâmina de vidro usando um meio de montagem composto de álcool polivinílico e glicerol. Deixe secar por 2 h a 37 °C ou durante a noite a 4 °C no escuro.
    10. Remova quaisquer bolhas de ar entre a lamínula e a lâmina de vidro pressionando suavemente a lamínula com uma pinça.
    11. Observe as amostras montadas sob um microscópio confocal usando uma objetiva de imersão em óleo de 60x com um comprimento de onda de excitação/emissão de 485/538 nm para FITC, 358/461 nm para DAPI e 551/567 nm para PKH26.
  4. Avaliação fenotípica de células dendríticas derivadas da medula óssea estimuladas por vesículas extracelulares por citometria de fluxo
    1. Após o período de incubação descrito na etapa 5.2.5, colher os BMDC lavando o meio várias vezes para cima e para baixo com uma pipeta.
    2. Colete os BMDCs contendo meio e coloque-os em tubos de 1,5 mL.
    3. Centrifugue a 450 x g durante 5 min a 4 °C para peletar as células.
      NOTA: Opcionalmente, para analisar a secreção de citocinas, remova os sobrenadantes com uma pipeta, transfira-os para novos tubos de 1,5 mL e armazene-os a -20 ° C para outros testes de ensaio imunoenzimático (ELISA).
    4. Ressuspenda os BMDCs em 100 μL de PBS contendo isotiocianato de fluoresceína (FITC), aloficocianina (APC) ou mAbs conjugados com ficoeritrina direcionados a CD11c, CD40, CD80, CD86, MHC classe I e MHC classe II e incube por 15 min a 4 ° C no escuro.
    5. Lavar os BMDCs com PBS e centrifugar a 450 × g durante 5 min a 4 °C.
    6. Ressuspender os BMDCs em 500 μL de PFA a 1% para fixá-los e armazená-los a 4 °C até a aquisição em um citômetro de fluxo.

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Resultados

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Um fluxograma resumindo as principais etapas para a manutenção de culturas puras do estágio larval de E. granulosus , o isolamento e caracterização de sEVs e sua captação por células dendríticas murinas são mostrados na Figura 1. Para alcançar alta produção de sEV a partir de protoscoleces e metacestóides de E. granulosus , um método de cultura in vitro previamente desenvolvido em laboratório foi empregado para maximizar a sobrevivência e a homeostase metabólica do...

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Discussão

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O fluxo de trabalho do protocolo para cultivar parasitas, isolar sEVs derivados de parasitas, diferenciar células dendríticas da medula óssea e analisar a captação de sEV por essas células é descrito na Figura 1. O objetivo foi descrever detalhadamente cada seção do protocolo que pode ser realizada como um todo ou separadamente, destacando as principais considerações para garantir a implementação da metodologia. A análise da população de EVs obtida de organi...

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Divulgações

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Os autores declaram não ter conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores reconhecem que Lic. Cecilia Gutiérrez Ayesta (Servicio de Microscopía Electrónica, CONICET, Bahía Blanca, Argentina) e Lic. Leonardo Sechi e Lic. Eliana Maza (INIFTA, Universidad Nacional de La Plata, Argentina) pela assistência técnica com microscopia eletrônica de transmissão e espalhamento dinâmico de luz, respectivamente. Agradecemos também à Dra. Graciela Salerno, Dra. Corina Berón e Dr. Gonzalo Caló pelo uso da ultracentrífuga no INBIOTEC-CONICET-FIBA, Argentina. Os autores agradecem a Lic. Kelly (SENASA, Mar del Plata, Argentina) e Lic. H. Núnez García (CONICET, Universidad Nacional de Mar del Plata, Argentina) por sua colaboração na avaliação do bem-estar de camundongos, e Med. Vet. J. Reyno, Med. Vet. S. Gonzalez e Med. Vet L. Netti por sua contribuição na obtenção de material parasitário. Este trabalho, incluindo os custos de experimentação, reagentes e equipamentos, foi apoiado pelo PICT 2020 nº 1651 financiado pela ANPCyT.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de 1,5 mLHensoN14059
Placa de 24 poçosJetBiofilCAP011024Poliestireno, fundo plano, Placa estéril
de 6 poços   Fornecedor:Henso Medical Co., Ltd.N14221Fundo plano, material PS,
filtro de células de polipropileno estéril de 70 mmBiologix Group Limited15-1070Corante
Alcian azul 8 GX estéril Santa Cruzsc-214517B
Incubadora automática de CO2NuarireUN-5100E/G DH
Albumina de soro bovinoWiener lab1443151
anticorpo monoclonal CD11c-PECy5    100 µ geBioscience15-0114-82clone (N418)
CD40 Anticorpo monoclonal-FITC 100 µ geBioscience11-0402-82clone (HM40-3)
CD80 Anticorpo monoclonal-APC 100 µ geBioscience17-0801-82clone (16-10A-1)
CD86 Anticorpo monoclonal-FITC  100 µ geBioscience11-0862-82clone (GL-1)
CentrífugaThermo ScientificIEC CL31R
NikonNikon Microscópio Confocal C1
Tubos cônicos 15 mL dia.17 x 120 mmCitotest4610-1865
DAPISigma107K4034
D-GlucoseMerk1.78343
Dimetil Sulfóxido Anedra6646
Soro Fetal Bovino 500 mLSigma-Aldrich   
12352207 Sistema de Citometria de FluxoBD BiosciencesBD FACSCanto™ II
Célula Zeta Capilar DobradaMalvern PanalyticalDTS1070
Sal de sulfato de gentamicinaSigmaG1264
Solução de glutaraldeídoFluka49630
HepesGibco11344041
Hypodermic  agulha 21 G x 1"25/8Weigao
Hipodermica Estéril 25 G x 5/8"Weigaoestéril
Microscópio invertido LeicaDMIL LED Fluo 
Lipopolissacarídeo de CetaminaHolliday
  5 mgInvitrogentlrl-rslpsLPS da bactéria Gram-negativa E. coli K12. TLR2/4 Agonistas
Cloridrato de LoperamidaSigma-Aldrich5.08162
Medium 199 Gibco11150059
Azul de MetilenoAnedra6337
MHC classe I (H2kb) Anticorpo monoclonal-PE 100 µ geBioscience12-5958-82clone (AF6-88.5.5.3)
MHC classe II (IA/IE) Anticorpo monoclonal-FITC  100 µ geBioscience11-5321-82clone (M5 / 114.15.2)
MicroscópioOlympusCX31
Mouse murino recombinante Flt3L.PrepoTech250-31L-10UG
Nanodrop Thermo ScientificND-One
ParaformaldeídoAgar ScientificR1018
Penicilina G sal de sódioSigmaP3032-10MU
PKH26Sigma-AldrichMINI26
Fosfato de potássio MonobasicTimperpara fosfato tamponado Tampão de lise salina (PBS)
RBC 100 mLRoche11814389001
meio RPMI  1640 1x 500 mLSigma-Aldrich (Gibco)11875093
Cacodilato de Sódio   Sigma-AldrichC0250
Cloreto de SódioAnedra7647-14-5Para Fosfato Salino Tampolado (PBS)
Fosfato de Sódio Dibásico (Anidro) p. a.Biopack1639.07Para Salino Tampolado com Fosfato (PBS)
Sal de sulfato de estreptomicinaSeringa SigmaS9137
10 mLBremenestéreis
Beckman Coulter13 x 55 mm, capacidade nominal 4 mL
Microscópio Eletrônico de TransmissãoJeolJEOL JSM 100CX II
UltracentrífugaBeckmanOptima LE-80k Rotor de 90 Ti
XylazineRichmond
Zetasizer Nano Malvern Nano ZSizer-ZEN3600Para realizar medições dinâmicas de espalhamento de luz e potencial zeta
Microscópio Confocal Multispeed Agulha Tubos de policarbonato de parede espessa

Referências

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