Artigo de método

Modelo de ingestão periódica intermitente em camundongos

DOI:

10.3791/67560

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10 de janeiro de 2025

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1Department of Physiology, Faculty of Medicine, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

Neste artigo

Resumo

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Um modelo de compulsão alimentar foi estabelecido em camundongos usando acesso intermitente a M&M's (um alimento altamente palatável feito de gordura e açúcar). Camundongos com acesso intermitente a esse alimento rico em gordura e açúcar mostraram comportamentos semelhantes ao estresse, aumento da ingestão calórica e preferência por esse alimento em relação à ração padrão em comparação com camundongos com acesso contínuo ou nenhum acesso ao alimento.

Resumo

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A obesidade afeta um em cada oito indivíduos em todo o mundo. Comer demais, especialmente alimentos com alto teor calórico, desempenha um papel significativo na obesidade. O transtorno da compulsão alimentar periódica (TCAP) é uma condição complexa causada por uma combinação de fatores biológicos, psicológicos e sociais. Envolve o consumo excessivo de alimentos com alto teor calórico em um curto período e muitas vezes está ligado à ansiedade e aos desejos.

Aqui, apresentamos um protocolo que emprega acesso contínuo e intermitente a um novo alimento altamente palatável (HPF) - M & M's - para desenvolver um modelo de camundongo para investigar o transtorno da compulsão alimentar periódica (TCAP). O HPF, escolhido por seu alto teor de gordura e açúcar, representa uma fonte de alimento ideal para estudar devido à sua forte palatabilidade, o que o torna particularmente adequado para examinar comportamentos alimentares compulsivos. Usando camundongos C57BL/6, fornecemos acesso contínuo ou intermitente a M&M's, permitindo acesso irrestrito a ração e água padrão. No8º dia, os camundongos do grupo de acesso intermitente exibiram comportamentos pronunciados de compulsão alimentar, que persistiram até o26º dia. Esses camundongos também consumiram significativamente mais calorias - predominantemente da confeitaria - do que aqueles nos grupos de acesso contínuo e controle. O contraste entre acesso contínuo e intermitente ressalta o papel crítico dos horários de alimentação na promoção do consumo excessivo de alimentos palatáveis.

Além disso, as avaliações comportamentais revelaram acesso intermitente aos comportamentos semelhantes à ansiedade induzidos por HPF, destacando o impacto psicológico dos padrões de acesso no comportamento alimentar e nos estados emocionais. Ao incorporar esses dois paradigmas alimentares distintos, este estudo oferece informações valiosas sobre como a disponibilidade de alimentos altamente palatáveis pode exacerbar as tendências de compulsão alimentar. Este modelo fornece uma abordagem mais realista para estudar os comportamentos de compulsão alimentar e suas consequências metabólicas. Ele destaca a importância de modelos padronizados na pesquisa biomédica. Nossas descobertas oferecem insights sobre os mecanismos fisiológicos e neurais subjacentes ao TCAP, o que pode abrir caminho para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas eficazes para TCAP e obesidade.

Introdução

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De acordo com dados da Organização Mundial da Saúde1, uma em cada oito pessoas em todo o mundo é obesa. Embora a alimentação seja uma necessidade fisiológica, sabe-se que comer demais sem necessidade fisiológica é um fator associado ao sobrepeso e à obesidade2. É bem sabido que os humanos preferem alimentos palatáveis e ricos em calorias, como gorduras e açúcares, a alimentos mais saudáveis3.

Do ponto de vista da ciência da complexidade, os transtornos alimentares, particularmente o transtorno da compulsão alimentar periódica (TCAP), são fenômenos multifacetados que emergem da interação de vários fatores biológicos, psicológicos e sociais que exibem comportamentos emergentes, como padrões cíclicos de compulsão alimentar, comportamentos compensatórios complexos e relacionamentos interpessoais disfuncionais4. O TCAP é caracterizado pela ingestão excessiva de alimentos altamente calóricos em um curto período, aproximadamente 2 h, de acordo com o Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais, 5ª ed.5 (DSM-V). Além disso, o TCAP está associado a comorbidades comportamentais, como ansiedade e fissuras 6,7. A complexidade desses transtornos requer melhores modelos experimentais que possam capturar essa interação de fatores e fornecer uma compreensão mais abrangente do comportamento de compulsão alimentar e suas implicações para a obesidade.

Os modelos mais usados para comportamento semelhante à compulsão alimentar na pesquisa básica foram principalmente ratos. Esses modelos normalmente usam acesso limitado e intermitente a alimentos ricos em gordura ou açúcar para induzir comportamentos semelhantes à compulsãoalimentar 8,9,10. Uma abordagem alternativa envolve o fornecimento de alimentos palatáveis por um curto período (2 h) a cada 8 dias, conhecido como modelo cíclico, usando uma pasta de alimentos altamente palatáveis (HPF) contendo uma mistura de gorduras e açúcares11. Outro método apresenta os HPF como cookies de forma imprevisível12. Em modelos de camundongos, comportamentos semelhantes à compulsão são frequentemente estudados usando o mesmo modelo cíclico13. Outro estudo com camundongos usa acesso limitado à sacarose para induzir comportamentos semelhantes à compulsãoalimentar 14.

Apesar da extensa pesquisa sobre comportamentos de compulsão alimentar em ratos, os modelos de compulsão alimentar em camundongos permanecem limitados. Este estudo tem como objetivo propor um modelo de compulsão alimentar usando M&M's (doravante denominado "HPF") como um HPF de acordo com os critérios nutricionais de HPF propostos por Fazzino e colaboradores15. Além disso, pretendemos avaliar as propriedades recompensadoras do HPF com base no fato de serem apresentadas de forma contínua ou intermitente. Em nossa pesquisa, nosso objetivo foi observar semelhanças entre os critérios diagnósticos específicos do DSM-V para compulsão alimentar em humanos dentro de um modelo murino: consumir alimentos em um curto período (2 h), ingerir uma grande quantidade de comida do que o normal, comer uma quantidade substancial apesar de estar em estado de saciedade e experimentar episódios de compulsão alimentar pelo menos duas vezes por semana.

O uso de modelos de camundongos de laboratório é uma ferramenta inestimável na pesquisa biomédica, especialmente para o estudo de doenças humanas, pois os camundongos compartilham 99% de seus genes com humanos16. A utilização de camundongos também oferece vantagens significativas na compreensão das informações transcriptômicas e na modificação de alvos terapêuticos relacionados às funções celulares e circuitos neurais associados a várias doenças17.

Portanto, este estudo propõe um modelo de acesso contínuo e intermitente a M&M's (um HPF feito de gordura e açúcar) para observar compulsão alimentar em camundongos C57BL/6 sem ração padrão ou privação de água. Este modelo é novo e necessário para a pesquisa biomédica, pois representa uma melhor abordagem para estudar esses problemas complexos. A padronização de modelos animais é essencial para obter resultados reprodutíveis e comparáveis, o que é fundamental para o avanço da pesquisa translacional e o desenvolvimento de intervenções terapêuticas eficazes para TCAP e obesidade. A abordagem descrita aqui expandirá o escopo da pesquisa de comportamento alimentar semelhante à compulsão alimentar em estudos futuros, facilitando o teste de vários medicamentos como potenciais alvos terapêuticos para o TCAP. A implementação de modelos mais realistas e padronizados em camundongos permitirá uma melhor compreensão da complexa dinâmica envolvida nos transtornos alimentares e suas consequências metabólicas, oferecendo assim novas alternativas para o tratamento e prevenção do TCAP.

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Protocolo

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Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com a Norma Oficial Mexicana de Especificações Técnicas para a Produção e Uso de Animais de Laboratório (NOM-062-ZOO-1999) e em total conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Interno para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (CICUAL) da Universidade Nacional Autônoma do México (UNAM).

1. Animais

  1. Para seguir este protocolo, alojar individualmente 27 camundongos C57BLC/6 machos, com 1 mês de idade e pesando 16-20 g, em gaiolas sob condições ambientais controladas: um ciclo claro-escuro de 12-12 h (06:00 ligado, 18:00 desligado), mantendo a temperatura em 21 ± 22 °C e níveis de umidade em 70 ± 10%.
    NOTA: Neste estudo, usamos exclusivamente camundongos machos para eliminar os efeitos dos hormônios femininos durante a ingestão do tipo compulsão. No entanto, em outro estudo18, aplicamos o mesmo modelo a camundongos fêmeas e não observamos diferenças na ingestão compulsiva.

2. Habituação

  1. Forneça aos camundongos de 30 dias acesso ad libitum à ração e água padrão. Coloque-os em gaiolas individuais para facilitar a medição do consumo de água e alimentos.
  2. Forneça um ambiente enriquecido, incluindo um tubo de papel, para todos os ratos e forneça aparas de madeira como cama.
  3. Meça o peso corporal, o consumo de alimentos e água a cada 24 horas durante 7 dias.

3. Modelo de compulsão alimentar

  1. No dia 7 do período de habituação, atribua aleatoriamente os roedores (N = 27) em um dos três grupos a seguir.
  2. Fornecer a todos os indivíduos acesso ao HPF (conteúdo nutricional por 100: 480 kcal, 19g de gordura, 70 g de carboidratos, 5,1 g de proteína, 0,13 g de sal) por 2 h (das 16:00 às 18:00) para minimizar a neofobia em relação ao HPF.
  3. Continuar as condições de alimentação especificadas para cada grupo de forma consistente por um período de 26 dias.
    1. Grupo Chow (GC) n = 9: fornecer acesso ad libitum à ração e água padrão.
    2. Grupo Contínuo (CdG) n = 9; fornecer umacesso d libitum à ração padrão, HPF e água.
    3. Grupo Intermitente (GI) n = 9: fornecer acesso ad libitum à ração e água padrão, mas dar-lhes HPF apenas em dias específicos (1, 3, 5, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 22, 24 e 26) por 2 h (das 16:00 às 18:00 h).
  4. Da primeira sessão à sessão 26, medir o peso corporal, a ingestão padrão de ração, a ingestão de alimentos palatáveis e o consumo de água para todos os indivíduos às 16:00 h e novamente às 18:00 h.

4. Instruções específicas

  1. Coloque a ração padrão nas prateleiras da gaiola e o HPF em pequenos recipientes de plástico. Em cada sessão, coloque aleatoriamente esses recipientes nos cantos das gaiolas (posterior esquerdo, posterior direito, anterior direito e anterior esquerdo).
  2. Reabasteça a água (280-300 mL) e a ração padrão (10-15 g) às segundas, quartas e sextas-feiras.
  3. Substitua o HPF (4-4,5 g) diariamente para o CdG. Para o IG, coloque o HPF (4-4,5 g) às segundas, quartas e sextas-feiras às 16:00 h. Distribua aleatoriamente o HPF por cor (marrom, azul, vermelho, laranja, verde e amarelo), sem preferência por nenhuma cor.
  4. No dia 7 de habituação, dê aos camundongos designados para o grupo CoG o HPF às 16:00 h. Meça todos os animais quanto à ingestão padrão de ração, peso corporal e consumo de água.

5. Análise dos dados

  1. Para medições de ingestão de 24 h, registre os valores às 16:00 h do dia anterior e às 16:00 h do dia atual. Por exemplo, para avaliar o consumo do dia 2, subtraia os valores de ração padrão, HPF, água e peso corporal do dia 1 daqueles do dia 2 para os mesmos parâmetros.
  2. Para medições de ingestão de 2 h, registre os valores às 16:00 h e 18:00 h do mesmo dia. Por exemplo, subtraia os valores de ração padrão, HPF, água e peso corporal às 16:00 h daqueles às 18:00 h para os mesmos parâmetros.
  3. Colete todos os dados diariamente em dois momentos (16:00 h e 18:00 h), insira-os em uma planilha e execute cálculos de kcal.
    1. Para calcular as kcal, converta os gramas consumidos de ração padrão e HPF em kcal com base no valor energético de cada alimento usando uma proporção (por exemplo, ração padrão: 3,02 kcal/g; HPF: 4,80 kcal/g).
  4. Analise e plote os dados usando o software de sua escolha.
    1. Para análise estatística, utilizar os testes U de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney.

6. Teste de campo aberto

NOTA: Um teste de campo aberto de 22 dias, 14:00 h, foi conduzido de acordo com o protocolo descrito por Kraeuter e colegas19. Este protocolo consiste em colocar os animais no centro de uma caixa de folha de acrílico preto. O chão da arena era branco e a grade era preta. O comportamento foi registrado e quantificado com um sistema de rastreamento de vídeo. O sistema registrou a distância, velocidade e tempo que os animais passaram no centro ou na periferia da arena.

  1. Preparação da sala de teste e do aparelho de campo aberto
    1. Para a arena, use uma câmara quadrada de 60 cm (comprimento) x 60 cm (largura) x 20 cm (altura) feita de plástico preto não poroso.
    2. Limpe o dispositivo antes e entre os usos com etanol a 70% vol/vol para remover os sinais de odor.
    3. Coloque a câmera acima do aparelho para uma visão de exploração ideal.
    4. Para minimizar o estresse, mantenha a temperatura e a umidade como as condições normais de habitação. Se os camundongos forem movidos de uma sala de alojamento para outra para o experimento, aclimate-os na nova sala por pelo menos 1 h por dia antes do uso.
  2. Executando o teste de campo aberto
    1. Para remover um único rato da gaiola, segure suavemente sua cauda e coloque-o no centro do labirinto de campo aberto. Ative o software de rastreamento de vídeo usando o recurso de inicialização automática, que detecta o investigador e começa a gravar assim que o investigador não estiver mais em foco na câmera.
    2. Deixe o mouse se mover livremente ao longo do labirinto por 5 min. Durante esse tempo, o software de rastreamento registrará o movimento.
    3. No final do período de teste, remova o animal da arena e devolva-o à sua gaiola de origem.
    4. Antes de limpar o labirinto, conte visualmente as fezes depositadas e registre-as para análise posterior.
    5. Remova todos os pellets fecais e limpe todas as manchas de urina. Pulverize o piso e as paredes do aparelho com etanol a 70% e limpe com uma toalha de papel limpa. Deixar secar completamente a solução de etanol.
    6. Depois de testar todos os animais, volte ao viveiro, limpe a arena e organize todos os materiais utilizados.
  3. Análise de dados
    NOTA: O software de rastreamento de vídeo facilita a extração de uma série de dados, como a velocidade média dos animais, a distância percorrida e o tempo gasto no centro e na periferia do aparelho.
    1. Selecione a distância percorrida e o tempo gasto pelos animais no centro e na periferia do aparelho.
    2. Exporte os dados do software de rastreamento para uma planilha ou outro formato preferido para análise estatística posterior.
    3. Analise os dados com o software de sua escolha.

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Resultados

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Usando HPF, estabelecemos com sucesso um modelo de compulsão alimentar em camundongos C57BL / 6. No dia 8, o comportamento de compulsão alimentar (consumir alimentos em excesso por 2 h) foi firmemente estabelecido e mantido até o dia 26 (Figura 1A). Durante as sessões intermitentes, o grupo GI exibiu consumo total de kcal significativamente maior (tanto da ração padrão quanto do HPF do que os grupos GC e CoG) (Figura 1A, ### p < 0,0001, *** p < 0,0001, ** ...

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Discussão

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Utilizou-se o modelo de compulsão alimentar proposto por Corwin em 2006 como base para o desenvolvimento desse protocolo. No entanto, o presente estudo modificou a variável de fornecimento de alimento palatável por 2 h para o CdG8. Em vez disso, oferecemos comida palatável ad libitum ao CdG, pois simula melhor uma realidade em que temos acesso 24 horas a qualquer alimento. Também usamos M&M's como um HPF porque eles combinam gorduras e açúcares, ao contrá...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

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Queremos expressar nossa gratidão ao Programa de Doutorado em Ciências Biomédicas da Universidade Nacional Autônoma do México e ao apoio prestado pelo Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCYT), No. CVU: 11025222. Este trabalho foi parcialmente apoiado pela IN207423 de subvenção UNAM-DGAPA-PAPIIT. Agradecemos a Andrea Mondragón García e José Enrique Ramírez Sánchez pelo apoio técnico.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ANY-maze Software de rastreamento de vídeoStoelting Co.4.73 versão
C270 HD WebcamLogitechC270 HDNão é necessário usar um gravador de vídeo específico; qualquer webcam ou filmadora com qualidade de imagem e resolução satisfatórias será suficiente.
Luvas Ambiderm (preto)Ambiderm7.50222E+12
GraphPad Prism 9GraphPad
Laboratory Dieta para roedores 5001LabDiet1320https://di.facmed.unam.mx/comisiones/Composici%C3%B3n%20del%20alimento%20Laboratory%20Rodent%20Diet%205001.pdf
M& Ms 43.8g (embalagem marrom)M& M´ s Conteúdo nutricional por 100 : 480 kcal, 19g de gordura, 70 g de carboidratos, 5,1 g de proteína, 0,13 g de sal Ingredientes: açúcar, massa de cacau, desnatado  leite  em pó, manteiga de cacau,  lactose, amido,  leite  gordura, gordura de palma, xarope de glicose, gordura de karité, estabilizador (goma arábica), dextrina, agentes de revestimento (cera de abelha, cera de carnaúba), corantes (E100, carmim, E132, E133, E150a, E150c, E150d, E153, E160a, E160e, E162, E163, E170), concentrado de beterraba, emulsionantes (soja; lecitina, E445), sal, aromas, óleo de palmiste, antioxidante (E306). (Pode conter:  amendoim, avelã, amêndoa). O chocolate ao leite contém sólidos de leite 14% no mínimo.  O chocolate ao leite contém gorduras vegetais, além da manteiga de cacau.
Labirinto de campo aberto 
Gaiola de Ratos de PolipropilenoOrchid ScientificSMP 01
Bebedouros de roedoresSunnypetSP-3656
Uline Balanza-220 g x 0,01 gunike.mxH-9884
UniMask4Uniseal
Garrafas plásticasunike.mxS-14487
Cama Sanitária, Serragem para AnimaisBIOINVERTSem número10 kg

Referências

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