Técnicas de Cultivo e Processamento de Organoides Tridimensionais para Geração de Miomas e Miomas Uterinos

Summary

Este protocolo descreve uma técnica manual para criar hidrogéis contendo colágeno embutidos com culturas organoides 3D de células-tronco a partir de tecido miométrial e miomáide.

Abstract

Miomas uterinos são os tumores ginecológicos benignos, monoclonais e ginecológicos mais comuns no útero de uma mulher. Para superar os obstáculos comuns relacionados aos métodos usados no estudo dessas patologias, buscamos elaborar uma estratégia para gerar modelos organoides tridimensionais de células-tronco de miométrio e miomas uterinos usando hidrogéis contendo colágeno como andaimes de incorporação. Especificamente, hidrogéis contendo colágeno em placas de baixo V-bottom de 96 poços foram explorados. Esse método permitiu o desenvolvimento de organoides 3D de dois tipos de células-tronco a partir do miométrio normal e do miomátrio contendo miomas uterinos, ao incorporá-los em hidrogéis contendo colágeno e formar organoides em um meio adequado para proliferação de células-tronco. Os organoides conseguiram se diferenciar, proliferar e autoorganizar em estruturas complexas, desenvolvendo um sistema sustentável. A importância desse modelo é a compreensão da fisiopatologia e da etiopatogênese, bem como o teste de novos medicamentos para prevenir ou tratar miomas uterinos.

Introduction

Miomas uterinos, ou leiomiomas, são os tumores benignos mais comuns do^{útero 1}. Eles afetam uma parte significativa das mulheres durante seus anos reprodutivos, com pesquisas sugerindo que cerca de 77% das mulheres os experimentam em algum momento. Embora muitas mulheres tenham miomas sem sintomas, uma substancial de 25% apresenta sintomas como sangramento uterino anormal, dor pélvica ou^{infertilidade 2}. O desenvolvimento e crescimento dos miomas são influenciados por uma variedade de fatores, incluindo hormônios sexuais, fatores de crescimento, mudanças genéticas e outros mecanismos

Protocol

O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Etnias da Universidade de Chicago, com o número de aprovação IRB#20-1414. De acordo com o banco de tecidos da Universidade de Chicago, foi obtido consentimento informado de todos os sujeitos dos quais o tecido foi coletado.

1. 3D cultura dos organoides

1. Cultive e mantenha as células-tronco miometriais e UF (SC) isoladas e purificadas, conforme descrito^{anteriormente 9}.
2. Obtenha os SCs do nitrogênio líquido e deixe-os descongelar. Um fluxograma do processo de cultura é mostrado na Figura 1.
3. ....

Results

Já no primeiro dia após a semeadura, os SCs começaram a se auto-agregar, formando organoides, como mostrado. Determinamos que a densidade ideal de semeadura era de 10.000 SCs, que consistentemente formavam organoides quando cultivados em um sistema de cultura definido. Esse sistema utilizou hidrogéis contendo colágeno como andaime ECM para células-tronco embutidas e meio de proliferação de células-tronco por 7 dias em uma placa de fixação ultrabaixa de 96.......

Discussion

Organoides são estruturas tridimensionais que se assemelham a órgãos miniaturizados e consistem em células auto-organizadas derivadas de células-tronco ou amostras^{de tecido 11}. Os organoides de células-tronco derivados de tecidos dos pacientes têm potencial para revolucionar a pesquisa biomédica e as aplicações clínicas devido à sua notável capacidade de replicar com precisão a fisiologia e a doença^{da UF 12}. Aqui, este estudo tenta preenche.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-fótons confocal  Microscópio	Leica, EUA
Agarose I	VWR Corporation, EUA	97062-248
Microplacas Esferoides Akura 96	InSphero	CS-09-004-03	Placas de baixo encaixe em V
Alexa Fluor 488 cabras anti-camundongo IgG	Life Technologies, CA, EUA	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 cabras anti-coelho IgG	Life Technologies, CA, EUA	(A11037)	(1:1000)
Anti-Ahr [RPT]	GeneTex, Taiwan	(GTX227700a)	(1:1000)
Anticorpo actina anti-alfa muscular liso	Abcam, MA, EUA	(ab7817)	1 & micro; g/mL
Anticorpo anticolágeno III	Abcam, MA, EUA	(ab7778)	(1:500)
Anticorpo Anti-SOX1	Abcam, MA, EUA	ab242125	(1:500)
Fator de anexação	Gibco, EUA	S-006-100
Buffer de bloqueio	Dako	X0909	5%  soro de cavalo + 0,5%  Triton X-100  em 1X  PBS
Criostato	Fisher Scientific, Waltham, MA	Microm HM 550
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol)	Thermo Scientific, Alemanha	62248	1 mg/mL
DNase I	Termo-Científica, Lituânia	EN0521
Dullbecco' s modificado Eagle' médio DMEM e   F12	Gibco, EUA	21041-025
Soro bovino fetal	Omega Scientific ,  Waltham, MA	NC0471611
Matrigel (hidrogéis contendo colágeno)	Corning, Corning, NY	356237
MesenCult-ACF Plus Medium (meio proliferante de células-tronco sem soro )	Stemcell Technologies, Vancouver, Canadá	5446
Composto OCT (Composto de temperatura de corte ideal)	Sakura, EUA	4583
Microscópio Olympus BX41	Olympus America, Center Valley, PA
Solução de inibidor da protease ovomucoide & nbsp;	Worthington Biochemical Corporation, EUA	LK003182
Papain	Worthington Biochemical Corporation, EUA	LK003176	solução de ativação (1,1 mM EDTA, 0,067 mM mercaptoetanol, 5,5 mM L-cisteína HCl)
PBS (soro tampão fosfatado)	Gibco, EUA	70011	pH 7,4
PFA (paraformaldeído) 4%	Invitrogen, EUA	FB002
Qupath	Bankhead, P. et al.  QuPath: Software de código aberto para análise de imagens em patologia digital.  Relatórios Científicos   (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	Software para análise de bioimagem
Microscópio de lapso de tempo
Frascos de cultura de tecidos	Fisher Scientific, Waltham, MA	FB012937
Tripsina	Gibco, EUA	A12859-01	0,25% de tripsina e 0,1% de EDTA em HBSS sem cálcio ou magnésio
Meio de montagem antifade VECTASHIELD complementado com DAPI	Laboratórios Vector, CA, EUA	#  UX-93952-24	1  ng/mL