Técnicas de Cultivo e Processamento de Organoides Tridimensionais para Geração de Miomas e Miomas Uterinos

Resumo

Este protocolo descreve uma técnica manual para criar hidrogéis contendo colágeno embutidos com culturas organoides 3D de células-tronco a partir de tecido miométrial e miomáide.

Resumo

Miomas uterinos são os tumores ginecológicos benignos, monoclonais e ginecológicos mais comuns no útero de uma mulher. Para superar os obstáculos comuns relacionados aos métodos usados no estudo dessas patologias, buscamos elaborar uma estratégia para gerar modelos organoides tridimensionais de células-tronco de miométrio e miomas uterinos usando hidrogéis contendo colágeno como andaimes de incorporação. Especificamente, hidrogéis contendo colágeno em placas de baixo V-bottom de 96 poços foram explorados. Esse método permitiu o desenvolvimento de organoides 3D de dois tipos de células-tronco a partir do miométrio normal e do miomátrio contendo miomas uterinos, ao incorporá-los em hidrogéis contendo colágeno e formar organoides em um meio adequado para proliferação de células-tronco. Os organoides conseguiram se diferenciar, proliferar e autoorganizar em estruturas complexas, desenvolvendo um sistema sustentável. A importância desse modelo é a compreensão da fisiopatologia e da etiopatogênese, bem como o teste de novos medicamentos para prevenir ou tratar miomas uterinos.

Introdução

Miomas uterinos, ou leiomiomas, são os tumores benignos mais comuns do^{útero 1}. Eles afetam uma parte significativa das mulheres durante seus anos reprodutivos, com pesquisas sugerindo que cerca de 77% das mulheres os experimentam em algum momento. Embora muitas mulheres tenham miomas sem sintomas, uma substancial de 25% apresenta sintomas como sangramento uterino anormal, dor pélvica ou^{infertilidade 2}. O desenvolvimento e crescimento dos miomas são influenciados por uma variedade de fatores, incluindo hormônios sexuais, fatores de crescimento, mudanças genéticas e outros mecanismos^{biológicos 3}.

Para estudar patogênese e testar a eficácia de fármacos, foram desenvolvidos modelos in vitro e animais. As células em culturas 2D são forçadas a crescer em uma superfície plana, distorcendo sua forma e alterando seu comportamento em comparação com o comportamento que se comportariam em um ambiente de tecido 3D. A principal desvantagem do cultivo 2D em comparação ao cultivo 3D é que ele representa mal o ambiente celular natural dentro de um tecido, falhando em imitar com precisão interações complexas célula-célula e matriz celular que ocorrem em um organismo vivo, levando a resultados potencialmente imprecisos ao estudar o comportamento celular e a sua resposta a^{estímulos 4}. Além disso, a UF e as células do miométrio perdem rapidamente a resposta hormonal em cultura^{2D 5}. No geral, os diferentes modelos animais forneceram informações relevantes sobre a fisiopatologia^{da UF 6}. Comparados aos modelos animais, os organoides 3D oferecem várias vantagens: eles simplificam experimentos, são compatíveis com imagens em tempo real e permitem o estudo de aspectos específicos do desenvolvimento e doenças humanas que não são bem representados em modelos^{animais 7}. Por outro lado, experimentos com animais mais sofisticados, como primatas, são muito difíceis de justificar eticamente, além de custos^{elevados 8}. O modelo organoide 3D é geralmente superior às culturas celulares 2D por imitar mais de perto a arquitetura tecidular in vivo , sendo mais controlado, eficiente e econômico do que os modelos animais. Portanto, é essencial desenvolver modelos alternativos mais eficazes que repliquem com precisão o crescimento celular natural e as complexidades dos tecidos doentes.

Nosso objetivo era estabelecer o procedimento para realizar culturas 3D de organoides de células-tronco miometriais e uterinas usando hidrogéis contendo colágeno, com um procedimento manual, destacando as principais vantagens e limitações.

Protocolo

O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Etnias da Universidade de Chicago, com o número de aprovação IRB#20-1414. De acordo com o banco de tecidos da Universidade de Chicago, foi obtido consentimento informado de todos os sujeitos dos quais o tecido foi coletado.

1. 3D cultura dos organoides

1. Cultive e mantenha as células-tronco miometriais e UF (SC) isoladas e purificadas, conforme descrito^{anteriormente 9}.
2. Obtenha os SCs do nitrogênio líquido e deixe-os descongelar. Um fluxograma do processo de cultura é mostrado na Figura 1.
3. Adicione 5 mL da proteína do fator de fixação para preparar os frascos pré-revestidos. Incube por pelo menos 4 horas a 37 °C. Depois, descarte o excesso de proteína do fator de fixação.
4. Cultive os SCs nos 2 frascos pré-revestidos de 75 cm usando 10 mL do meio que compreende tanto o meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) quanto F12, suplementado com 12% de soro fetal bovino (FBS). Incube o frasco em uma incubadora de hipóxia a 37 °C com concentração de oxigênio de 2% até atingir 90% de confluência, como mostrado na Figura 2A.
   NOTA: A hipóxia pode desempenhar um papel significativo no crescimento das células-tronco, pois pode promover a proliferação e a sobrevivência das células-tronco.
5. Ao atingir a confluência, separe as células usando solução de 25% de tripsina e 0,1% de EDTA em HBSS, sem cálcio ou magnésio.
   1. Para isso, remova o meio de cultura celular. Lave as células com 1x PBS. Adicione 1 mL de tripsina a uma célula de 25 cm² e incube por 2-3 minutos.
   2. Quando as células começarem a se desprender, adicione um com soro para parar a reação à tripsina. Aspire a solução da célula em um tubo de 15 mL e centrifuge por 5 minutos a 500 x g em temperatura ambiente.
   3. Cuidadosamente, descarte o sobrenadante, deixando a pastilha intacta.
6. Resuspenda o pellet celular posteriormente em 1 mL de meio proliferante de células-tronco sem soro. Desligue quaisquer aglomerados com pipeteamento suave.
7. Realize a quantificação celular usando um hemocitômetro.
   1. Misture 100 μL de suspensão celular com 10 μL de solução de Trippan Blue a 0,4%.
   2. Vórtice a mistura brevemente e pipete 10 μL de suspensão de célula azul de tripano para a câmara do hemocitômetro entre a incisura da câmara e o escorregador de vidro ( Figura 2B).
   3. Conte as células nas caixas 1 a 4, use as seguintes equações para calcular a contagem de células:
      Células/mL = (total de células contadas/número total de caixas contadas) x fator de diluição x 10.000
      Células totais na amostra = células/mL x volume total da amostra
8. Misture aproximadamente 10.000 células com 2 μL de hidrogéis contendo colágeno e 98 μL de meio proliferante de células-tronco sem soro, resultando em um volume final de 100 μL por^{poço 5}para uma placa de 96 poços no fundo em V.
9. Pipete 100 μL da mistura da célula em cada poço de uma placa de baixo V-bottom de 96 poços. Centrifuge em temperatura ambiente por 5 minutos a 100 x g.
10. Coloque a placa em uma incubadora a 37 °C com 5% de_CO2 por 30 minutos.
11. Adicione um volume adicional de 100 μL de meio proliferante de células-tronco sem soro, sem hidrogéis contendo colágeno, em cada poço para fornecer a nutrição necessária ao crescimento dos órgãos.
12. Compense a evaporação do meio adicionando 10-20 μL de meio proliferante de células-tronco sem soro em cada poço em caso de evaporação excessiva, que raramente ocorre.
13. Cultive as células por 7 dias para o crescimento completo dos organoides Figura 2C-H. Troque o meio proliferante das células-tronco sem soro duas vezes por semana (aspirando o meio antigo suavemente e depois adicionando meio novo) para permitir que o cultivo de organoides derivados de SCs seja estendido por até 21 dias.

2. Corte congelado

1. Colete células da placa de 96 poços em um tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
2. Para criossecção, lave os organoides 2x com soro tampão fosfatado (PBS; 1x). Adicione 500 μL de PBS aos organoides, depois centrifuge e descarte o sobrenadante.
3. Fixe os organoides com 500 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% por 60 minutos a 4 °C e lave novamente com 1x PBS.
4. Resuspenda os organoides em 100 μL de azul de metileno a 2% para corar por 20 minutos. Lave com 1x PBS e crioprotect durante a noite por suspensão em 500 μL de 30% de sacarose.
5. No dia seguinte, remova a solução de sacarose por centrifugação. Incorpore os organoides em um composto de Temperatura Ótima de Corte (OCT) e congele rapidamente a −80 °C.
6. Seccionar os organoides embutidos em OCT usando um criostato, a profundidade ótima de seção é de 10 μm, e imediatamente posicione as seções nas lâminas, uma seção por lâmina.
7. Preserve as lâminas a 4 °C até que a coloração por imunofluorescência seja realizada segundo o método a seguir.
8. Lave o ferrolho 3x com 100 μL de 1x PBS. Depois, adicione 100 μL de 0,1% de Triton em PBS (1x) por 15 minutos em temperatura ambiente.
9. Bloqueie os organoides com 5% de BSA em 1x PBS por 60 minutos e incube durante a noite com anticorpos primários para Sox-2 com diluição (1:500) e actina do músculo liso α (α-SMA) com concentração final de 1 μg/mL.
10. Lave os organoides com 100 μL de 1x PBS 3x e depois incube por 1 hora no escuro com anticorpos secundários fluorescentes marcados com Alexa Fluor (1:1000).
11. Lave com 100 μL de 1x PBS 2x e depois monte em meio de montagem antifade suplementado com DAPI (1 ng/mL).
12. Adquira imagens usando um microscópio fluorescente com ampliação 20x. Veja a Figura 3A e analise as imagens com software para análise de bioimagem.

3. Coloração por imunofluorescência em organoides de montagem inteira

1. Remova os organoides do meio (passo 1.11) para um tubo de microcentrífuga e lave 2x com 500 μL de PBS 1x.
2. Fixe os organoides com 500 μL de 4% de PFA por 60 minutos em temperatura ambiente. Depois, descarte o PFA e lave com 500 μL de PBS 3x.
3. Permeabilize os organoides fixos com 0,5 mL de buffer bloqueador durante a noite a 4 °C.
4. No dia seguinte, remova o tampão bloqueante, adicione anticorpos primários (300-500 μL) de Colágeno III (COL3A1) com diluição (1:500) e AHR com diluição (1:1000), e incube as amostras a 4 °C durante a noite.
5. Lave os organoides 3 vezes com 500 μL de 1x PBS e então incube com anticorpos secundários (594 IgG anti-coelho de cabra e 488 IgG anti-camundongo) durante a noite a 4 °C no escuro.
6. Lave os organoides 3 vezes com 500 μL de 1x PBS, depois incube com 5 μg/mL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em 1x PBS (300-500 μL por amostra) em temperatura ambiente por 20 minutos.
7. Lave os organoides três vezes com 500 μL de PBS 1x e imagine em um microscópio confocal (Figura 3B).

4. Dissociação organoide

1. Reconstitua 100 mg de papaína em solução ativada esterilizada por filtro até uma concentração de 250 U/mL, incube a solução a 37 °C por 30 minutos para ativar a enzima
   NOTA: Pode ser armazenado entre 2 e 8 °C por até 2 semanas.
2. Prepare uma solução de dissociação (imediatamente antes do uso) com 30 U/mL de papaína e 125 U/mL de DNase I na Solução Equilibrada de Sal (HBSS) de Hanks.
3. Transfira os organoides (passo 1.11) para placas de 24 poços e adicione 500 μL de solução dissociativa.
4. Incube as amostras a 37 °C por 30 a 60 minutos em um agitador orbital ajustado para 90 rpm.
5. Triture intermitentemente 5x-6x usando um pipetador de 1 mL em temperatura ambiente para obter uma suspensão composta principalmente por células individuais.
6. Adicione a suspensão celular a um tubo centrífugo de 15 mL contendo uma solução inibidora de protease (1 mL de 10 mg/mL) e centrifuge a 300 x g por 5 minutos para granular as células e descartar o sobrenadante.
7. Ressuspenda as células no buffer apropriado, e a suspensão resultante de célula única é mostrada na Figura 2I.

Resultados

Já no primeiro dia após a semeadura, os SCs começaram a se auto-agregar, formando organoides, como mostrado. Determinamos que a densidade ideal de semeadura era de 10.000 SCs, que consistentemente formavam organoides quando cultivados em um sistema de cultura definido. Esse sistema utilizou hidrogéis contendo colágeno como andaime ECM para células-tronco embutidas e meio de proliferação de células-tronco por 7 dias em uma placa de fixação ultrabaixa de 96...

Discussão

Organoides são estruturas tridimensionais que se assemelham a órgãos miniaturizados e consistem em células auto-organizadas derivadas de células-tronco ou amostras^{de tecido 11}. Os organoides de células-tronco derivados de tecidos dos pacientes têm potencial para revolucionar a pesquisa biomédica e as aplicações clínicas devido à sua notável capacidade de replicar com precisão a fisiologia e a doença^{da UF 12}. Aqui, este estudo tenta preenche...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-fótons confocal  Microscópio	Leica, EUA
Agarose I	VWR Corporation, EUA	97062-248
Microplacas Esferoides Akura 96	InSphero	CS-09-004-03	Placas de baixo encaixe em V
Alexa Fluor 488 cabras anti-camundongo IgG	Life Technologies, CA, EUA	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 cabras anti-coelho IgG	Life Technologies, CA, EUA	(A11037)	(1:1000)
Anti-Ahr [RPT]	GeneTex, Taiwan	(GTX227700a)	(1:1000)
Anticorpo actina anti-alfa muscular liso	Abcam, MA, EUA	(ab7817)	1 & micro; g/mL
Anticorpo anticolágeno III	Abcam, MA, EUA	(ab7778)	(1:500)
Anticorpo Anti-SOX1	Abcam, MA, EUA	ab242125	(1:500)
Fator de anexação	Gibco, EUA	S-006-100
Buffer de bloqueio	Dako	X0909	5%  soro de cavalo + 0,5%  Triton X-100  em 1X  PBS
Criostato	Fisher Scientific, Waltham, MA	Microm HM 550
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol)	Thermo Scientific, Alemanha	62248	1 mg/mL
DNase I	Termo-Científica, Lituânia	EN0521
Dullbecco' s modificado Eagle' médio DMEM e   F12	Gibco, EUA	21041-025
Soro bovino fetal	Omega Scientific ,  Waltham, MA	NC0471611
Matrigel (hidrogéis contendo colágeno)	Corning, Corning, NY	356237
MesenCult-ACF Plus Medium (meio proliferante de células-tronco sem soro )	Stemcell Technologies, Vancouver, Canadá	5446
Composto OCT (Composto de temperatura de corte ideal)	Sakura, EUA	4583
Microscópio Olympus BX41	Olympus America, Center Valley, PA
Solução de inibidor da protease ovomucoide & nbsp;	Worthington Biochemical Corporation, EUA	LK003182
Papain	Worthington Biochemical Corporation, EUA	LK003176	solução de ativação (1,1 mM EDTA, 0,067 mM mercaptoetanol, 5,5 mM L-cisteína HCl)
PBS (soro tampão fosfatado)	Gibco, EUA	70011	pH 7,4
PFA (paraformaldeído) 4%	Invitrogen, EUA	FB002
Qupath	Bankhead, P. et al.  QuPath: Software de código aberto para análise de imagens em patologia digital.  Relatórios Científicos   (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	Software para análise de bioimagem
Microscópio de lapso de tempo
Frascos de cultura de tecidos	Fisher Scientific, Waltham, MA	FB012937
Tripsina	Gibco, EUA	A12859-01	0,25% de tripsina e 0,1% de EDTA em HBSS sem cálcio ou magnésio
Meio de montagem antifade VECTASHIELD complementado com DAPI	Laboratórios Vector, CA, EUA	#  UX-93952-24	1  ng/mL