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Artigo de método

Modelo Murino de Imunomodulação Induzida por Epicutâneo

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DOI:

10.3791/67578

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24 de junho de 2025

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1Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 2Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O estudo demonstra o papel da pele na modulação das respostas imunes em camundongos por meio da imunização epicutânea (EC). A imunização contra CE com um antígeno proteico pode suprimir as respostas imunes na hipersensibilidade de contato ou reverter a supressão induzida pela pele quando combinada com padrões moleculares associados a patógenos. A imunização contra a CE mostra-se promissora como uma abordagem eficaz e sem agulha para a imunoterapia.

Resumo

A pele, como o maior órgão do corpo humano em interface com o ambiente externo, desempenha papéis fisiológicos cruciais, incluindo (1) proteger o organismo de xenobióticos e microorganismos, (2) facilitar a termorregulação, (3) manter o equilíbrio hídrico e eletrolítico, (4) sintetizar vitamina D e (5) participar da imunidade. Este artigo destaca o envolvimento fundamental da pele nos mecanismos imunológicos, mostrando sua capacidade de imunomodular suprimindo ou potencializando a resposta imune. Descobertas anteriores revelam que, em camundongos, a imunização epicutânea (EC) com um antígeno, isoladamente ou em conjunto com padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), pode suprimir ou potencializar as respostas imunes, respectivamente. Especificamente, observou-se que a imunização contra CE com um antígeno pode suprimir as respostas imunes em vários modelos murinos de doenças autoimunes ou dermatite alérgica de contato. Os resultados indicam que a imunização contra CE com um antígeno combinado com PAMPs pode servir como uma estratégia eficaz para aumentar a imunidade contra patógenos ou aliviar alergias dependentes de linfócitos T helper tipo 2 (Th2). Este protocolo descreve um método para induzir a supressão da pele por meio da aplicação epicutânea de um antígeno em um modelo murino de dermatite de contato alérgica humana (DAC) - hipersensibilidade de contato (CHS) mediada por células Th1. No entanto, também pode ser aplicado a vários modelos de distúrbios murinos. O artigo apresenta a imunomodulação induzida por CE como um modelo murino atraente para imunoterapia sem agulha em vários distúrbios.

Introdução

Este artigo apresenta um método para induzir tolerância (referida como 'supressão' ao longo deste texto) em um modelo de camundongo de hipersensibilidade de contato (CHS) e para reverter essa tolerância (referida como 'contrassupressão' ao longo deste texto) por meio da aplicação epicutânea (EC) de um antígeno sozinho ou em combinação com ligantes para receptores de reconhecimento de patógenos (PRRs), respectivamente1. No protocolo descrito, (a) imunoglobulinas de camundongo haptenizadas (TNP-Ig) são usadas como antígeno para suprimir a hipersensibilidade de contato ou (b) antígeno com padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), ligantes para receptores do tipo Toll (TLR) e receptores semelhantes a proteínas contendo domínio de oligomerização de ligação a nucleotídeos (NOD) (NLRs), para reverter a supressão induzida pela pele 2,3,4. Os achados indicam que a imunomodulação induzida por CE é mediada por células T supressoras não específicas de antígeno (Ts) e células T contrassupressoras antígeno-específicas (Tcs). Essas células podem ser examinadas em um modelo de camundongo de transferência de células adotivas para determinar o mecanismo das reações testadas. O protocolo atual descreve dois modelos de transferência de células, "transferência adotiva DENTRO" e "transferência adotiva FORA". A IN de transferência adotiva é útil para testar a imunomodulação nas fases aferente e eferente da HSC. Por outro lado, a "transferência adotiva OUT" reflete o efeito da imunomodulação apenas na fase eferente da HSC.

O artigo descreve um método de supressão cutânea por meio da aplicação epicutânea de um antígeno em um modelo murino de dermatite alérgica de contato humana (DAC) - hipersensibilidade de contato (HSC) mediada por linfócitos T helper tipo 1 (Th1)5. No entanto, essa abordagem também foi testada quanto à sua eficácia na regulação (supressão, tolerância) de modelos experimentais de HSC mediada por linfócitos T citotóxicos tipo 1 (Tc1) 6,7, doenças autoimunes como artrite induzida por colágeno (CIA)8,9 , encefalomielite autoimune experimental (EAE)10,11 e colite ulcerativa12. Além disso, o protocolo descreve o método de contrassupressão induzida pela pele (supressão reversa) via aplicação de CE de um antígeno junto com ligantes PRR em um modelo murino de CHS 13,14,15,16. Os resultados apresentados indicam que a supressão inespecífica do antígeno induzida por EC pode ser revertida pela purificação dos ligantes TLR2, TLR3, TLR4, TLR9 e NOD2. O método de contrassupressão induzida pela pele também foi empregado em um modelo animal de dermatite atópica (DA), mostrando que o tratamento com CE com um antígeno na presença de moléculas sintéticas de DNA de fita simples contendo oligodesoxinucleotídeos não metilados (CpG) - ligante para TLR9 pode suprimir as respostas mediadas por Th2 de maneira antígeno-específica (desloca a resposta imune para um fenótipo Th1/Th17)17. O método descrito também foi testado na pneumonia pneumocócica, demonstrando que a imunização contra CE com polissacarídeo pneumocócico conjugado à albumina de soro bovino (PC-BSA), juntamente com CpG, poderia potencialmente aumentar a imunidade ao Streptococcus pneumoniae18.

Um aspecto fundamental da imunomodulação induzida por CE é a seleção do modelo e a natureza do antígeno. O artigo inclui uma tabela detalhando os antígenos usados, a duração da exposição ao antígeno e a especificidade das células T dos modelos testados (consulte a Tabela 1). O método descrito para imunomodulação é direcionado para doenças envolvendo linfócitos T antígeno-específicos. A eficácia deste método foi avaliada utilizando um antígeno compatível aplicado pela CE no processo. A compatibilidade do antígeno é crucial para garantir que ele interaja efetivamente com os linfócitos T envolvidos no processo da doença. A aplicação de um adesivo proteico ou peptídico na pele intacta facilita a penetração do antígeno na epiderme19,20. Esse aumento da penetração do antígeno é atribuído ao aumento da transpiração sob o curativo. Alterações na permeabilidade epidérmica ocorrem dentro de 4-10 h após a aplicação do adesivo, enquanto a imunomodulação induzida por CE pode permanecer eficaz por até duas semanas 5,14.

Embora o tratamento da CE seja amplamente utilizado, a existência de muitas variações desse método pode levantar dúvidas. O entendimento atual sugere que a extensão do dano epidérmico antes da administração do antígeno pode influenciar a natureza da resposta imune resultante21. O dano epidérmico superficial desencadeia a liberação de citocinas anti-inflamatórias pelas células de Langerhans, favorecendo o início da resposta Th222. Em contraste, danos epidérmicos mais extensos promovem a liberação de citocinas pró-inflamatórias e facilitam a entrega de antígenos às células dendríticas dérmicas23. O protocolo apresentado destaca (a) o reconhecimento de desafios na aplicação deste método em animais pequenos e ativos, particularmente camundongos; b) Ter em conta factores como o estado da pele após a barbear com navalha, o contacto adequado das substâncias com a pele, o tempo de exposição e as condições de higiene da pele durante o tratamento CE, que podem determinar a eficácia do tratamento. É crucial considerar o método de depilação da pele, seja físico ou químico, antes da aplicação do antígeno, pois diferentes preparações cutâneas podem afetar a condição da pele de várias maneiras. Reconhece-se que todos esses procedimentos podem ativar as células imunológicas da pele, potencialmente levando a infecções de pele ou influenciando a progressão da doença. Os potenciais efeitos secundários nas doenças da pele após a depilação devem ser uma consideração primordial ao selecionar o método de depilação. Os pesquisadores descreveram um método de imunossupressão mediada por células T induzida por meio da aplicação de EC de um antígeno na pele dorsal raspada, demonstrando seu efeito em vários modelos de respostas imunes de camundongos. A aplicação de CE do antígeno, juntamente com PAMPs, induz células T contrassupressoras específicas do antígeno. Além disso, o método apresentado de aplicação de CE, particularmente com exposição repetida a antígenos ou PAMPs, não causa efeitos colaterais preocupantes.

O protocolo descrito destaca a importância de vários fatores para alcançar resultados confiáveis e repetíveis com este método, especialmente em pequenos animais como camundongos. A natureza não invasiva dessa abordagem geralmente resulta em um risco menor de reações adversas (como dor, infecção ou cicatrizes) em comparação com as técnicas de imunização intradérmica ou injetável. A imunização epicutânea é fácil de usar e facilmente administrada em ambientes não clínicos, melhorando a acessibilidade e a adesão em comparação com métodos mais invasivos.

Tabela 1: Modulação da resposta imune induzida por CE em diferentes modelos de doença de camundongo. Abreviaturas: ACD = dermatite alérgica de contato; DA = dermatite atópica; Ag = antígeno; CIA = artrite induzida por colágeno; CHS = hipersensibilidade de contato; CFA = adjuvante de Freund completo; COLL II = colágeno tipo II; DNFB = 2,4-dinitrofluorobenzeno; DNP-BSA = dinitrofenil conjugado à albumina sérica bovina; EAE = encefalomielite autoimune experimental; CE = epicutâneo; LPS = lipopolissacarídeo; OVA = ovalbumina; PAMP = padrão molecular associado a patógenos; PC-BSA = polissacarídeo pneumocócico conjugado à albumina sérica bovina; Th1 = linfócito T helper tipo 1; Tc1 = linfócito T citotóxico tipo 1; TNCB = 2,4,6-trinitroclorobenzeno; TNP-Ig = imunoglobulinas de camundongo conjugadas com 2,4,6-trinitrofenil; Ts = células T supressoras; Tcs = células T contrassupressoras. Clique aqui para baixar esta tabela.

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Protocolo

Todos os experimentos apresentados neste artigo foram aprovados e conduzidos de acordo com as diretrizes do1º e2º Comitê Local de Ética em Testes em Animais em Cracóvia, Polônia. Os procedimentos obedeceram às recomendações locais, principalmente quanto à administração de cetamina/xilazina ou isoflurano como anestésicos, raspagem da pele de camundongo com lâminas de barbear, aplicação de substâncias/haptenos na pele raspada e em ambos os lados da orelha e coleta de órgãos imunológicos periféricos. O estudo utilizou camundongos machos e fêmeas CBA/J (H-2k), de 6 a 12 semanas de idade, com pesos corporais variando de 20 a 25 g. Detalhes sobre os reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação animal

  1. Ratos domésticos juntos; É importante prevenir os efeitos negativos do isolamento em seu humor. Para significância estatística, use 10-12 animais por grupo.

2. Preparação da área de operação

  1. Limpe a mesa cirúrgica com uma solução de etanol a 70% antes e depois de todos os procedimentos. Se o uso de camundongos exigir condições estéreis, realize todas as operações dentro de um gabinete de biossegurança.

3. Indução de células supressoras (Ts) para reação CHS mediada por Th1

NOTA: Este procedimento é representado na Figura 1A.

  1. No dia "0" anestesiar os camundongos com isoflurano a 30% em propilenoglicol. Segure o mouse com a mão esquerda, expondo o lado dorsal de seu corpo. Com a mão direita, ensaboe o sabonete cinza com água abundante e aplique na pele.
    1. Usando uma lâmina de barbear estéril, raspe suavemente uma área de pele de 2 cm². Evite ferir a pele. Quaisquer lesões cutâneas desqualificarão os camundongos de outros procedimentos.
      NOTA: O sabonete cinza é um produto natural e hipoalergênico feito de uma base vegetal suave. Regenera e hidrata eficazmente a pele seca e sensível. Este sabonete não contém corantes artificiais, fragrâncias sintéticas ou ingredientes de origem animal. Os ingredientes incluem palmato de sódio, palmiste de sódio, Aqua (água), glicerina, extrato de flor/folha/caule de Taraxacum officinale (dente-de-leão), ácido de palma, ácido de palmiste, cloreto de sódio, propilenoglicol, EDTA tetrassódico, ácido etidrônico. O sabonete cinza é projetado para peles sensíveis e delicadas, propensas a irritações e psoríase. Limpa eficazmente a pele problemática, evitando a secura excessiva e uma sensação de repuxamento. Este sabonete também acalma irritações, hidrata e promove uma regeneração mais rápida da pele. É importante ressaltar que não compromete a barreira protetora da pele.
  2. Coloque os ratos na gaiola. Após o barbear, espere pelo menos seis horas antes de aplicar o antígeno para permitir que a pele seque e seja limpa pelo animal.
  3. No dia "+1", prepare uma solução de 1 mg/mL de imunoglobulina de camundongo conjugada com antígeno 2,4,6-trinitrofenil (TNP-Ig), em solução salina estéril tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS). Preparar o volume de um antigénio de 1200 μL para dez ratinhos. Misture as soluções imediatamente antes de usar em um frasco para injetáveis de 2 ml. Proteja o TNP-Ig da luz cobrindo o frasco com papel alumínio.
    NOTA: Inclua um grupo de controle CHS de camundongos tratados apenas com o veículo (DPBS) para avaliar reações inflamatórias inespecíficas causadas pelo barbear e aplicação do solvente no local raspado. Um tipo diferente de antígeno deve ser usado para a indução de Ts para testar sua especificidade de antígeno. Imunoglobulinas de camundongo (Ig) foram preparadas a partir de soros de camundongos e conjugadas com hapteno de TNP (Arquivo Suplementar 1). Uma única preparação com o nível de substituição de 40 TNP por molécula de Ig (TNP40-Ig) foi usada ao longo de24,25.
  4. No mesmo dia, anestesiar camundongos com isoflurano a 30% em propilenoglicol. Aplique o antigénio no local previamente raspado colocando um adesivo de gaze de 1 cm2 embebido em 100 μL do antigénio (preparado no passo 3.3). Cubra com um remendo de plástico fino (2 cm²) e prenda-o com fita adesiva de tecido. No grupo de controle CHS, aplique apenas DPBS.
    NOTA: Mangas de documentos transparentes de 30 μm podem ser usadas para o adesivo de plástico. A fita adesiva de tecido deve ser facilmente removível, flexível, adaptar-se às formas do corpo e permitir a permeabilidade ao ar e ao vapor de água.
  5. No dia "+5", anestesiar os camundongos com isoflurano a 30% em propilenoglicol. Corte cuidadosamente o adesivo com uma tesoura de segurança com cantos arredondados e, em seguida, remova cuidadosamente a fita adesiva. Permita que os ratos se movam livremente e limpem naturalmente a pele por pelo menos 4 h. Se necessário, raspe qualquer cabelo crescido no local da aplicação do antígeno, embora isso geralmente não seja necessário.
    NOTA: Corte a fita adesiva apenas na área de administração do antígeno (área de gaze e plástico), onde ela adere firmemente apenas nas bordas do curativo. Aguarde pelo menos 4 h antes de aplicar o antigénio para permitir que a pele seque e seja limpa pelo animal.
  6. No dia "+5", repita as etapas 3.3 e 3.4.
  7. No dia "+8", repita a etapa 3.5. Isso marca a conclusão de uma exposição cutânea de uma semana ao antígeno. Após este período, use os camundongos para testar a supressão da reação CHS - modelos ativos in vivo (etapa 6) ou eutanasia-los para servir como doadores de células Ts em "transferência adotiva IN" (etapa 8) ou em "transferência adotiva OUT" (etapa 9).

4. Indução de células T contrassupressoras (Tcs) para reação de HSC mediada por Th1

NOTA: Este procedimento é representado na Figura 1B.

  1. No dia "0" execute os passos 3.1-3.2.
  2. No dia "+1", prepare uma mistura de 100 μg de antígeno TNP-Ig e 100 μg de LPS (exemplo de PAMP) em 100 μL de DPBS. Prepare a solução imediatamente antes de usar em um frasco de 2 mL e proteja-a da luz envolvendo o frasco em papel alumínio se o antígeno for fotossensível.
    NOTA: Para avaliar a contrassupressão (reversão da supressão induzida pela pele), um controle para supressão (grupo controle Ts) deve ser incluído, onde os camundongos são tratados apenas com o antígeno TNP-Ig. Além disso, camundongos tratados apenas com DPBS (controle CHS) e LPS sozinho (controle PAMP) devem ser incluídos para determinar a extensão da modulação não específica das respostas imunes. LPS é um exemplo de partícula imunoestimuladora26. As características específicas de qualquer estimulador imunológico dependem do modelo de camundongo usado, dos tipos de células imunes envolvidas na resposta imune em estudo e da farmacocinética das substâncias sob investigação.
  3. No mesmo dia, anestesiar camundongos com isoflurano a 30% em propilenoglicol. Coloque um adesivo de gaze de 1 cm2 na pele raspada anterior, saturada com uma solução contendo 100 μL da mistura (preparada na etapa 4.2). Prenda a gaze com um remendo de plástico fino (2 cm²) e fixe-a no lugar com adesivo de tecido. Nos grupos controle, aplique DPBS (controle CHS) ou LPS (controle PAMP), ou TNP-Ig sozinho (grupo controle Ts).
    NOTA: Mangas de documentos transparentes de 30 μm podem ser usadas para o adesivo de plástico. A fita adesiva de tecido deve ser facilmente removível, flexível, adaptar-se às formas do corpo e permitir a permeabilidade ao ar e ao vapor de água.
  4. No dia "+5", execute a etapa 3.5.
  5. No dia "+5", repita os passos 4.2-4.3.
  6. No dia "+8", repita a etapa 3.5. Uma semana de exposição da pele ao antígeno misturado com LPS é concluída. Após este período, testar camundongos em modelos ativos in vivo de reação CHS (etapa 6) ou eutanasiar para servir como doadores de células Tcs em "transferência adotiva OUT" (etapa 10).

5. Indução de células T efetoras (Teff) para reação CHS mediada por Th1 (fase de sensibilização de CHS)

  1. No dia "0", raspe o tórax e o abdômen dos camundongos (área de 2 × 2 cm) usando sabão cinza com água seguido de uma lâmina de barbear. Deixe a pele descansar por 6 horas antes de aplicar o hapteno para garantir a ausência de irritação.
  2. No mesmo dia, pouco antes do uso, prepare a solução de hapteno (5%) em um frasco de vidro e cubra-o com papel alumínio para protegê-lo da luz: 2,4,6-trinitroclorobenzeno (TNCB) em uma mistura de acetona-etanol (proporção 1:3).
  3. No mesmo dia, sensibilize os camundongos aplicando 150 μL de hapteno no local previamente raspado. Aplicar o veículo isoladamente (mistura de acetona-etanol) no grupo de controlo negativo para avaliar a reação inflamatória inespecífica. Antes de devolver o animal à gaiola, espere 30 s para deixar a pele secar.
    CUIDADO: Use luvas; O TNCB causa reações alérgicas graves na maioria das pessoas.

6. Modelo ativo: Teste de células Ts ou Tcs em CHS mediado por Th1

NOTA: Este procedimento é representado na Figura 2.

  1. Induza a célula Ts ou Tcs seguindo as etapas 3 e 4. Este procedimento durará do dia "0" até o dia "+8".
  2. No dia "+8", comece a induzir as células Teff seguindo o passo 5.
  3. Quatro dias depois, avalie a resposta do CHS realizando a fase de elicitação (desafio). Em resumo, aplique TNCB em ambos os lados das orelhas. Em seguida, quantifique a espessura das orelhas medindo-as com um micrômetro. Uma descrição detalhada deste teste e de outros possíveis desfechos é relatada em outro lugar (Zemelka-Wiacek M. et al.27).

7. Isolamento de células Teff, Ts ou Tcs de camundongos doadores

  1. Esterilize a mesa de operação com uma solução de etanol a 70% antes e depois de cada procedimento. Realize todos os procedimentos dentro de um gabinete de biossegurança para manter a esterilidade e usar instrumentos esterilizados. Para isolar células Ts, Tcs e Teff no dia "+8", use camundongos imunizados com CE descritos nas etapas 3, 4 e 5, respectivamente.
    NOTA: Aderir a uma proporção doador-receptor de 1:1.
  2. Anestesie os doadores com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de uma mistura de cetamina (90-120 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg). Certifique-se de que o mouse esteja totalmente anestesiado por pelo menos 5 min.
  3. Desinfete toda a área abdominal do camundongo anestesiado com etanol a 70% e, em seguida, faça uma incisão na camada abdominal (3-4 cm) para expor a cavidade peritoneal. Isole os linfonodos auxiliares e inguinais (ALNs) e o baço (SPL) com a pinça estéril em tubos cheios de DPBS estéril que é suplementado com 1% de soro fetal bovino (FBS). Agrupe os ALNs de todos os doadores em um frasco e os SPLs em outro e mantenha os frascos no gelo. Cada axila contém dois linfonodos axilares, enquanto um único linfonodo inguinal está situado na região do quadril adjacente a três vasos sanguíneos. Os SPLs são posicionados no lado esquerdo do corpo, atrás do intestino e do estômago.
    NOTA: Trabalhe com ferramentas estéreis sob o gabinete de biossegurança para manter as condições estéreis. Após este procedimento, os camundongos devem ser sacrificados seguindo protocolos aprovados institucionalmente.
    1. Amasse o tecido entre as extremidades foscas de duas lâminas de microscópio. Coar a suspensão celular através de um filtro celular com poros de 70 μm.
  4. Enxágue as células com 30 mL de DPBS suplementado com 1% de FBS. Centrifugue a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1-5 mL de DPBS.
  5. Conte a viabilidade da célula usando um hemocitômetro e Trypan Blue. Misture 10 μL de suspensão celular com 90-990 μL de Trypan Blue, ajustando o volume com base na contagem de células. Incorporar este factor de diluição no cálculo da viabilidade.
  6. Prepare uma mistura de ALNs e SPLs (proporção 1:1). Respeite o número de células: use 1 até 5 x 107 células Ts ou Tcs por receptor em 1 mL de DPBS suplementado com 1% de FBS e 7 x 107 células Teff/receptor em 1 mL de DPBS. Mantenha a proporção doador-receptor para todas as populações de células 1:1 e também a proporção doador-DPBS 1:1. Mantenha os frascos com células no gelo.
    NOTA: A execução de outros experimentos in vitro requer um aumento proporcional no número de doadores de células.
    NOTA: Além disso, as células Teff, Ts e Tcs isoladas podem ser submetidas a purificação ou análises adicionais usando citometria de fluxo, como fenotipagem ou avaliação da secreção de citocinas. Também é viável iniciar culturas de células para explorar a capacidade de proliferação celular ou quantificar os níveis de citocinas em sobrenadantes de cultura. A realização de novos experimentos requer um aumento proporcional no número de doadores de células.

8. Transferência adotiva IN: Teste de Ts em CHS mediado por Th1

NOTA: Este procedimento é representado na Figura 3. Trabalhe estéril e use solução de etanol a 70% antes e depois de cada procedimento. Certifique-se de que todas as operações celulares sejam conduzidas dentro de um gabinete de biossegurança para manter a esterilidade e usar instrumentos esterilizados.

  1. Induza e isole as células T (doadores) seguindo as etapas 3 e 7. Enxágue as células com 30 mL de DPBS. Centrifugue a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 200 μL de DPBS por receptor (proporção doador-receptor 1:1).
  2. Receptores (camundongos singênicos ingênuos): anestesiar os receptores com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de uma mistura de cetamina (90-120 mg / kg) e xilazina (5-10 mg / kg). Certifique-se de que o mouse esteja totalmente anestesiado por pelo menos 5 min.
  3. Administre uma injeção intravenosa (i.v.) de uma mistura preparada de 1-5 x 107 células Ts (etapa 8.2) em 200 μL no receptor anestesiado.
  4. No mesmo dia, induza a reação de HSC mediada por Th1. Em resumo, induza a célula Teff (fase de sensibilização) descrita nas etapas 5.1-5.3). Quatro dias depois, avaliar a resposta do CHS realizando a fase de elicitação (desafio) descrita na etapa 6.3.

9. Transferência adotiva OUT: Teste de Ts em CHS mediado por Th1

  1. Induza e isole as células T e Teff (doadores) seguindo as etapas 3, 5 e 7. Manter os Ts e o Teff isolados em dois frascos separados. Divida as células Teff em dois frascos: um para o "grupo de teste Ts" e outro para o "controle CHS".
    NOTA: Trabalhe estéril e use uma solução de etanol a 70% antes e depois de cada procedimento. Certifique-se de que todas as operações celulares sejam conduzidas dentro de um gabinete de biossegurança para manter a esterilidade e usar instrumentos esterilizados. Inclua um grupo de controle de receptores aos quais apenas células Teff serão administradas ("controle CHS"). Para este grupo, doadores extras devem ser usados para aderir à proporção doador-receptor de 1:1. Para melhorar a qualidade dos resultados, devem ser adicionados os recetores que recebem células de controlo transferidas de dadores tratados com CE com uma solução solvente. A decisão de adicionar qualquer grupo adicional de receptores e doadores precisa ser cuidadosamente planejada, porque essa abordagem requer muitos camundongos, o que não está em conformidade com o princípio dos 3Rs (Reduzir, Refinar, Substituir).
  2. Adicione células Ts às células Teff para o "grupo de teste Ts". Adicione DPBS adequado às células Teff no frasco para injetáveis "CHS control".
    NOTA: Mantenha o número de 1-5 x 107 células Ts e 7 x 107 células Teff por receptor.
  3. Misture todos os frascos para injetáveis delicadamente. Manter os frascos para injetáveis em banho-maria (37 °C) durante 30 min, misturando suavemente de 5 em 5 min.
  4. Enxágue cada frasco de células com 30 mL de DPBS suplementado com 1% de FBS. Centrifugue a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 200 μL de DPBS/receptor.
  5. Passe cada suspensão celular por um filtro de células porosas de 70 μm. Se necessário, ajuste o volume de 200 μL de DPBS/receptor.
  6. Receptores (camundongos singênicos ingênuos): anestesiar os receptores com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de uma mistura de cetamina (90-120 mg / kg) e xilazina (5-10 mg / kg). Certifique-se de que o mouse esteja totalmente anestesiado por pelo menos 5 min.
  7. Administre uma injeção intravenosa (i.v.) de células preparadas.
  8. No mesmo dia, induzir a fase de elicitação da CHS (desafio) descrita no passo 6.3. Inclua "controle negativo", onde conduza apenas o desafio CHS.

10. Transferência adotiva OUT: Teste de Tcs em CHS mediado por Th1

  1. Induza e isole as células Ts, Tcs e Teff (doadores) seguindo as etapas 3-5 e 7.
    NOTA: Trabalhe estéril e use uma solução de etanol a 70% antes e depois de cada procedimento. Certifique-se de que todas as operações celulares sejam conduzidas dentro de um gabinete de biossegurança para manter a esterilidade e usar instrumentos esterilizados. Inclua dois grupos de controle de receptores: um "controle CHS" no qual apenas células Teff serão administradas e um "controle Ts" no qual as células Teff serão incubadas apenas com células Ts. Para esses grupos, use doadores extras para aderir à proporção doador-receptor de 1:1.
  2. Mantenha as células Ts e Tcs isoladas em frascos separados. Divida as células Teff em três frascos: um para o "grupo de teste Tcs", um para o "controle Ts" e um para o "controle CHS".
  3. Primeira incubação: Para o (a) "grupo de teste Tcs", adicione células Tcs às células Teff. Para o (b) "controle de Ts" e (c) "controle de CHS", adicione uma quantidade adequada de DPBS às células de Teff (ver Tabela 2).
    NOTA: Mantenha o número de 1-5 x 107 células Tcs e 7 x 107 células Teff por receptor.
  4. Misture todos os frascos para injetáveis delicadamente. Conservar em banho-maria (37 °C) durante 30 min, misturando delicadamente de 5 em 5 min.
  5. Enxágue cada frasco de células com 30 mL de DPBS suplementado com 1% de FBS. Centrifugue a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em 1 ml de DPBS suplementado com 1% de FBS por receptor. Mantenha uma proporção de mistura celular-DPBS 1:1.
  6. Segunda incubação: Para o (a) "grupo de teste Tcs", adicione células Ts à mistura de células Teff e Tcs pré-incubadas. Para o (b) "controle de Ts", adicione células Ts à mistura de células Teff pré-incubadas com DPBS. Para o (c) "controle CHS", adicione DPBS adequado às células Teff pré-incubadas.
    NOTA: Mantenha o número de células 1-5 x 107 Ts por destinatário. Realize incubações em todos os grupos experimentais (a, b e c) para garantir uniformidade na perda de células durante os procedimentos de lavagem e centrifugação.
  7. Misture todos os frascos para injetáveis delicadamente. Conservar em banho-maria (37 °C) durante 30 min, misturando delicadamente de 5 em 5 min.
  8. Enxágue cada frasco de células com 30 mL de DPBS. Centrifugue a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 200 μL de DPBS/receptor.
  9. Passe cada suspensão celular por um filtro de células porosas de 70 μm. Se necessário, ajuste o volume de 200 μL de DPBS/receptor.
  10. Receptores (camundongos singênicos ingênuos): anestesiar os receptores com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de uma mistura de cetamina (90-120 mg / kg) e xilazina (5-10 mg / kg). Certifique-se de que o mouse esteja totalmente anestesiado por pelo menos 5 min.
  11. Administre uma injeção intravenosa (i.v.) de células preparadas.
  12. No mesmo dia, induzir a fase de elicitação da CHS (desafio) descrita no passo 6.3. Inclua "controle negativo", onde conduza apenas o desafio CHS.

Tabela 2: Cronograma de incubações de células durante Tcs "transferência para fora". Clique aqui para baixar esta tabela.

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Resultados

Este estudo examina se os antígenos aplicados via pele isoladamente ou combinados com PAMP podem induzir células Ts ou Tcs, respectivamente, que modulam a reação de CHS. A imunização de camundongos CBA/J via CE com 100 μg de TNP-Ig ou TNP-Ig mais 100 μg de LPS induz células Ts ou Tcs, respectivamente. Os camundongos foram então sensibilizados com 5% de TNCB e desafiados com o mesmo hapteno 4 dias depois. A reação foi avaliada medindo o inchaço da orelha antes e após o d...

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Discussão

As investigações foram conduzidas em muitos modelos animais diferentes e usando muitas cepas de camundongos como BALB/c, C57BL/6, HLADR4-Tg, DBA 1 e B10.PL e SJL demonstram que a imunização CE com um antígeno atribuído pode servir como um meio versátil e potencialmente ilimitado de criar tolerância e controlar respostas imunes indesejadas. O protocolo atual descreve dois modelos de transferência celular: (1) 'transferência adotiva IN', que é útil para avaliar a imunomodulação durante as ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por doações do Comitê Polonês de Bolsas de Pesquisa Científica 3 PO5B 091 25, 2PO5A 204 29 e do Centro Nacional de Ciências N N401 3554 33 para MS Os gráficos foram desenhados usando o software GraphPad Prism 10.2.3, e as figuras 1-3 foram criadas no BioRender. Zemelka-Wiacek, M. (2025): (1) https://BioRender.com/3ux2px; (2) https://BioRender.com/s0y8zs7; (3) https://BioRender.com/0qziglw. Os autores agradecem a Dorota Woźniak por cuidar das colônias de camundongos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2,4,6-trinitroclorobenzeno (TNCB)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, JapãoC0307
Imunoglobulina de camundongos conjugada com 2,4,6-trinitrofenil (TNP-Ig)Cátedra de Ciências Biomédicas, Faculdade de Ciências da Saúde, Faculdade de Medicina da Universidade Jaguelônica, Cracóvia, Polônia
Acetona (reagente ACS, ≥ 99.5%)Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha179124
Papel alumínioMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaZ185140   
balanço analítico  Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, AlemanhaPRACTUM224-1, 29105177
Albumina sérica bovina (BSA)Merck KGaA, Darmstadt, AlemanhaA9418
CBA/J (H-2k) Unidade de melhoramento da Cátedra de Ciências Biomédicas, Faculdade de Ciências da Saúde, Faculdade de Medicina da Universidade Jaguelônica, Cracóvia, Polônia
Filtro de células, tamanho do poro 70 e mu; mBIOLOGIX, China15-1070
Capacidade das pipetas descartáveis: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaZ740301, Z740302, Z740303
Dulbecco & prime; S soro salino tamponado com fosfato (DPBS)ThermoFisher Scientific,   Waltham, Massachusetts, EUA14190144
Tubos Eppendorf Safe-Lock 1,5mlEppenforf, Alemanha30120086
Tubos Eppendorf Safe-Lock, 2,0 mlEppenforf, Alemanha30120094
etanol 100% (álcool absoluto)Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha1.07017
etanol 96%Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha1.59010
Soro fetal bovino (FBS)ThermoFisher Scientific,   Waltham, Massachusetts, EUAA3160802
Lâminas de microscópio de vidro (jateado com areia simples, com fosco)ThermoScientific, Portsmouth, NH, EUA421-004T
Prisma Graph PadGraphPad Software Inc.v. 10.2.3
sabonete cinza (barra de sabão Bialy jelen)Polena ostrzeszó w, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o., Sp. K., Polônia163057
HemocitômetroVWR, Avantor, EUA612-5719
incubadora Heracell 150iTermo Eletrônico & nbsp; LED Gmbh, Alemanha41071068
isoflurano (Aerrane)Baxter, Deerfield, IL, EUA8AGG9623
cetamina 100 mg/mL, solução para injeçãoBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Polôniacat.# não disponível
Centrífuga de laboratório (Heraeus Fresco 21)Thermo Scientific, Alemanha75002425
Centrífuga de laboratório (Heraeus Megafuge 1.0R)  Thermo Scientific, AlemanhaB00013899
Lipopolissacarídeo (LPS)Merck KGaA, Darmstadt, AlemanhaL-8274
máscara (FFP2)VWR, Radnor, Pensilvânia, Estados Unidos111-0917
MicrometroMitutoyo, Tóquio, Japão193-111
Microscópio com objetivosLeica Microsystems CMS GmbH, AlemanhaDM1000, 294011-082007
propilenoglicol  Chempur, Piekary figure-materials-1 Polônia114489005
Lâmina de barbearVWR, Radnor, Pensilvânia, Estados UnidosPERS94-0462
Capas transparentes para documentos 30 & micro; mESQUEMÁTICO5906961126542
Azul de tripanMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaT8154
tubos 15 mL estéreisMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaCLS430055 (Cornining)
tubos de 50 mL, estéreisMerck KGaA, Darmstadt, AlemanhaCLS430290 (Corning)
frascos, tampa roscada, vidro transparente (apenas frasco) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Alemanha27173
Viscoplast Polovis, adesivo de seda, 5x0,0125m3M Polônia, Nadarzyn, Polônia7100231620
banho-maria AJL Electronic, PolôniaLW102
Solução de xilazina (xylapan 20 mg/mL) para injeçãoVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Polôniacat.# não disponível

Referências

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