Artigo de método

Ensaios automatizados de imunofluorescência multiplex de alto rendimento para pesquisa translacional

DOI:

10.3791/67584

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10 de junho de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ultivue, Inc.

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este relatório descreve um protocolo automatizado para ensaios de imunofluorescência multiplex (mIF) em um corador de lâmina automatizado. Ele demonstra a alta reprodutibilidade da proteômica espacial em autocorantes de tecido padrão de alto rendimento e imageadores de fluorescência de lâmina inteira, o que é ideal para ensaios mIF personalizados em um grande número de lâminas de tecido em pesquisa translacional.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A imunofluorescência multiplex (mIF) é uma técnica avançada que permite uma análise detalhada e espacialmente resolvida de amostras de tecido, visualizando vários biomarcadores de proteínas em uma única seção. No entanto, a maioria das tecnologias mIF enfrenta compensações significativas entre sensibilidade e rendimento durante a multiplexação, representando uma limitação crítica para a detecção robusta de biomarcadores de baixa abundância em várias seções de tecido. Uma nova abordagem para mIF usa códigos de barras de DNA exclusivos ligados a anticorpos, que são amplificados por meio de um mecanismo paralelo de amplificação de molécula única. Este método atinge uma qualidade de coloração altamente comparável à imuno-histoquímica (IHC) de grau clínico, ao mesmo tempo em que fornece alta capacidade de multiplexação e imagens de lâmina inteira de alto rendimento. Este ensaio envolve a amplificação de um coquetel de anticorpos com código de barras de DNA no tecido, seguido por rodadas sequenciais de etapas de detecção para visualizar quatro oligonucleotídeos marcados com fluorescência por ciclo. Este processo permite, assim, a detecção de oito ou mais biomarcadores por amostra de tecido. As principais etapas desse método incluem preparação automatizada de tecidos, aplicação de anticorpos primários conjugados com códigos de barras de DNA, amplificação de sinal e ciclos iterativos de detecção, imagem e remoção de sinal. A aquisição de imagens é seguida pelo registro de imagens e análise de célula única usando uma plataforma de ciência de dados de imagens espaciais aprimorada por IA. Para este estudo, o protocolo foi aplicado a micro-arrays multi-tecidos (TMAs) fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE), incluindo núcleos de amígdalas, melanoma, cólon e linfonodos em triplicata. As tecnologias avançadas de mIF fornecem mais informações sobre a resposta do tumor, o microambiente tumoral e o cenário imunológico. Ao superar as compensações inerentes entre sensibilidade, recursos de multiplexação e taxa de transferência de imagem, os pesquisadores agora podem ter como objetivo entender a heterogeneidade de assinaturas moleculares desafiadoras e biomarcadores de respostas terapêuticas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A imunofluorescência altamente multiplexada (mIF) é uma técnica avançada que está revolucionando o campo da análise de tecidos, permitindo a visualização simultânea de vários biomarcadores proteicos em uma única seção de tecido 1,2. Essa capacidade fornece um nível incomparável de detalhes e resolução espacial, o que muitas vezes é crucial para entender as interações entre os tipos de células com morfologias complexas dentro do microambiente do tecido em várias escalas espaciais3. A técnica é particularmente valiosa na pesquisa oncológica, onde pode ser usada para co-localizar biomarcadores tumorais, alvos de drogas proteicas, o status imunológico local e de checkpoint, as interações entre diferentes tipos de células e até mesmo os padrões de colocalização subcelular relacionados ao metabolismo da droga dentro do tecido 4,5,6.

Apesar de seu potencial, a maioria das tecnologias mIF ainda enfrenta desafios significativos, principalmente no equilíbrio entre sensibilidade e taxa de transferência com recursos de multiplexação. Essa limitação é especialmente crítica para a detecção de biomarcadores clínicos que podem apresentar expressão muito baixa, como HER2 e PD-L1 7,8,9. Para ver por que isso acontece, é essencial entender outras modalidades de mIF. Esses métodos tradicionais abriram caminho para plataformas mIF mais sofisticadas, mas vêm com seus próprios conjuntos de vantagens e limitações.

A imunofluorescência direta (IFD) utiliza anticorpos diretamente conjugados a fluoróforos ou a um oligonucleotídeo capaz de recrutar fluoróforos10. Este método é simples de multiplexar, mas sofre de menor sensibilidade e dificuldade em resolver o sinal do fundo do tecido ou artefatos de coloração.

A imunofluorescência indireta (IFI) usa um anticorpo secundário que se liga ao anticorpo primário. Isso aumentou o sinal em comparação com o DIF baseado em primário. Quando combinada com projetos aprimorados de células de fluxo, a IFI sequencial pode detectar até 40 biomarcadores em um ensaio 2,11. No entanto, estes ainda sofrem de uma relativa falta de sensibilidade em comparação com as estratégias baseadas em enzimas para amplificação de sinal, como as encontradas nas técnicas de imuno-histoquímica (IHQ).

A imunofluorescência baseada em catálise enzimática é mais frequentemente observada em métodos de IHQ que utilizam peroxidase de rábano (HRP) para deposição de corante cromogênico (DAB) ou fluorescente (por exemplo, amplificação de sinal de tiramida (TSA)). Como esses ensaios são baseados na mesma enzima catalítica, sua sensibilidade de detecção é semelhante, tornando os ensaios multiespectrais de mIF baseados em TSA adequados para aplicações clínicas 2,12. A vantagem da amplificação de sinal baseada em DNA é o alto grau de multiplexação possível, mantendo excelente amplificação de sinal e modularidade. Em contraste, os métodos baseados em HRP são menos modulares e difíceis de otimizar, exigindo ciclos adicionais de desenvolvimento e teste de painéis.

Imunofluorescência de anticorpos com código de barras de DNA
O ensaio mIF demonstrado aqui usa uma DNA polimerase para amplificar simultaneamente anticorpos com código de barras de DNA, seguido por ciclos de coloração e descoloração da sonda repórter usando quatro oligonucleotídeos fluorescentes por rodada de imagem (Figura 1).

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Figura 1: Ilustração gráfica do protocolo de ensaio de imunofluorescência multiplex. Anticorpos conjugados com código de barras são adicionados em uma única etapa e os códigos de barras são amplificados simultaneamente. Grupos de quatro sondas fluorescentes são adicionados em cada ciclo, permitindo que quatro marcadores sejam visualizados ao mesmo tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Essa adição de anticorpos de rodada única e amplificação de etapa única simplificam muito o protocolo de ensaio. O processo é facilitado por sistemas automatizados de coloração e varredura de alto rendimento, que garantem resultados reprodutíveis de lâmina a lâmina e lote a lote em um grande número de amostras utilizadas em estudos clínicos13.

Uma das principais vantagens dessa tecnologia é sua capacidade de manter alta sensibilidade, permitindo multiplexação extensiva2. O fluxo de trabalho também garante que o rendimento da imagem permaneça alto, abordando assim uma das principais limitações das tecnologias mIF altamente multiplexadas (por exemplo, > 8 biomarcadores) para estudos clínicos. Isso é particularmente importante na pesquisa clínica, onde variações sutis nos alvos de medicamentos de baixa abundância (por exemplo, baixo HER2) entre os pacientes podem fornecer informações críticas sobre a resposta terapêutica.

Além desses atributos-chave, este ensaio também oferece configurabilidade do painel, recursos de imagem de lâmina inteira de alto rendimento e resolução óptica necessária para investigar processos e compartimentos subcelulares, bem como saliências celulares associadas a macrófagos e células dendríticas. A capacidade de investigar fenótipos celulares complexos em várias escalas espaciais é uma vantagem crítica da imagem óptica versus métodos baseados em citometria de massa de imagem (IMC)2.

Neste trabalho, um protocolo para um ensaio de mIF de 8 plex é apresentado usando um corador automático e um scanner de lâmina inteira. Este ensaio inclui um painel de oito anticorpos primários: CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1 e pan-citoqueratina14. Este painel de marcadores permitirá o imunoperfil do tecido tumoral e a identificação de células encontradas no ambiente tumoral ou estroma. Este protocolo usa um corador de lâmina automatizado para coloração inicial e rodadas de troca de sonda, e a coloração e a imagem podem ser concluídas em 2 dias. Métodos de validação de um ensaio mIF e realização de análise das imagens resultantes também são mostrados.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os experimentos devem seguir as diretrizes institucionais do comitê de ética em pesquisa com seres humanos. Todas as seções de tecido empregadas neste protocolo foram obtidas de um fornecedor externo de tecidos.

1. Preparação de amostras de tecido

  1. Selecione o bloco de tecido FFPE a ser corado usando o ensaio mIF. Se estiver usando lâminas de tecido FFPE, certifique-se de que as amostras tenham entre 3-5 μm de espessura, montadas em lâminas de vidro carregadas positivamente e estejam livres de rugas ou outros rasgos que possam afetar negativamente os resultados finais.
    NOTA: Para obter melhores resultados, evite manchar amostras de tecido que foram seccionadas há mais de 2 meses. Além disso, evite blocos armazenados há mais de 10 anos ou que pareçam estar visualmente secos.
  2. Se estiver trabalhando com blocos de tecido FFPE, use um micrótomo para cortar o número necessário de lâminas de tecido com uma espessura de 4 μm, montando as lâminas em uma lâmina de vidro carregada positivamente. Para obter os resultados mais consistentes, monte todos os slides na mesma orientação. Certifique-se de que o tecido esteja livre de rugas e rasgos.
  3. Se as amostras não forem coradas imediatamente, armazene-as em uma caixa de lâminas sob nitrogênio por até 2 meses.

2. Registo dos reagentes auxiliares e do anticorpo primário para a instalação inicial

  1. No software do corador automático, navegue até a guia Configuração do reagente na parte superior da tela. Clique em Adicionar para adicionar novos reagentes.
  2. Os ensaios de coloração e troca utilizarão nove recipientes de reagentes, seguindo as informações encontradas na Tabela 1. Para usá-los, por exemplo, para o primeiro reagente chamado Wash Buffer, com o nome abreviado ISPWsh1, siga as etapas. Selecione o tipo como Auxiliar e verifique se *BWash e DI estão listados em Massas compatíveis. Marque a caixa Preferido antes de salvar.
  3. Repita este processo para os reagentes auxiliares restantes, usando os nomes e nomes abreviados encontrados na Tabela 1.
    1. O reagente de solução de amplificação (ULTAmp1) não é compatível com Bond Wash. Na janela de configuração do reagente para isso, selecione *BWash e clique no botão << para mover este reagente para fora da lista de reagentes compatíveis e para a seção de reagentes disponíveis. A não remoção do Bond Wash como um reagente compatível para o reagente da solução de amplificação pode resultar em uma redução significativa do desempenho de coloração do ensaio.
  4. Depois que todos os recipientes de reagentes estiverem registrados, crie um Kit de Detecção de Pesquisa antes de iniciar a execução inicial. O kit de detecção precisará de um recipiente de titulação de 30 mL.
  5. Adicione o recipiente de titulação de 30 mL ao kit de detecção. Para evitar que os dois sejam separados, prenda o recipiente de titulação na varinha.
  6. Digitalize o código de barras no lado esquerdo do kit de detecção. Na janela pop-up subsequente, nomeie o kit de detecção (por exemplo, InSituPlex Kit). Defina a data de validade para 10 anos a partir da data de registro.
    NOTA: A data de validade definida aqui não é a data listada no reagente, mas é a data de validade do reagente no recipiente de titulação. Definir a data de validade no futuro garante que o kit não expire desnecessariamente.
  7. Para a primeira posição do reagente do kit, selecione Tampão de lavagem como o reagente no menu suspenso.
  8. Clique no campo de código de barras para esta posição do reagente e escaneie o código de barras do recipiente de titulação de 30 mL com fita adesiva para registrar este recipiente como tampão de lavagem e vincular o recipiente do reagente ao tubo de detecção.
  9. Depois que o recipiente de titulação estiver vinculado ao kit, clique no botão Adicionar para salvar e fechar a janela pop-up.
  10. Encha o recipiente de titulação com 30 mL de 1x Bond Wash e guarde refrigerado a 4 °C entre as corridas de coloração.

Tabela 1: Reagentes auxiliares para a configuração. Clique aqui para baixar esta tabela.

3. Configuração inicial do protocolo

  1. Após o registro bem-sucedido de todos os recipientes de reagentes, navegue até a guia Configuração do protocolo na parte superior da tela do software do corador automático.
  2. Confirme qual versão do software está sendo executada no momento clicando no logotipo no canto superior direito da tela. O pop-up resultante exibirá a versão do software atualmente instalada sob o título Informações do software.
  3. Se o software for a versão 7.0 ou posterior, haverá um modelo pré-instalado do protocolo de coloração. Na parte inferior da tela, verifique se a seleção de Status Preferencial está definida como Todos. Nomeie o protocolo de modelo como *ISP Staining Assay. Para versões anteriores do software, o protocolo pode ser encontrado na Tabela 2.
  4. Clique com o botão direito do mouse no *ISP Staining Assay e copie o protocolo. Na janela pop-up resultante, renomeie o protocolo Ensaio de Coloração 1 com o nome abreviado (ISP_IHC1)
  5. No sistema de detecção preferido, selecione aquele que foi criado durante a configuração inicial do reagente na etapa 2.6.

Tabela 2: Protocolo para protocolo de coloração por imunofluorescência multiplex. *MARKER corresponde à solução de anticorpos e Wash Buffer corresponde à solução BOND Wash. Todos os outros reagentes auxiliares têm componentes de kit com nomes correspondentes. Este protocolo é compatível com a versão de software 7.0 e superior, BXD 39 e superior. Clique aqui para baixar esta tabela.

4. Configuração do reagente

  1. Descongele todos os reagentes do kit, exceto os conjugados de anticorpos, a enzima de amplificação, o iniciador de troca e o neutralizador de troca à temperatura ambiente. Armazene o restante dos componentes do kit a -20 °C até o uso.
  2. Se ainda não tiver feito, registar um novo recipiente de titulação para cada um dos reagentes definidos no passo 2.3. Coloque uma nova inserção de titulação em cada um.
  3. Pegue o Sistema de Detecção de Pesquisa registrado na etapa 2.6 e certifique-se de que o recipiente tampão de lavagem associado esteja cheio até 30 mL com 1x solução de lavagem Bond. Coloque os recipientes de titulação para cada reagente no sistema.
  4. Prepare o diluente de ab no recipiente correspondente. O volume necessário é de 350 + (150 μL x número de lâminas) e é composto pelo diluente de anticorpos fornecido. Vortex o tampão para misturar após o descongelamento.
  5. Preparar a solução de coloração de anticorpos no recipiente da solução de coloração de anticorpos 1. Adicione todos os anticorpos em uma diluição de 1:100 no diluente de anticorpos fornecido. O volume necessário é 350 + (150 μL x número de lâminas). Não revire os estoques de anticorpos ou a solução completa de coloração de anticorpos, misture apenas por pipetagem.
  6. Prepare a mistura de pré-amplificação no recipiente de mistura de pré-amplificação. O volume necessário é de 350 + (150 μL x número de lâminas) e é composto por uma mistura de pré-amplificação, conforme fornecido. Vortex esta solução após o descongelamento.
  7. Prepare a solução de amplificação no recipiente da solução de amplificação. O volume necessário é de 350 + (150 μL x número de lâminas) e é composto por enzima de amplificação diluída 1:10 em tampão de amplificação. Não vórtice a enzima de amplificação ou a solução de amplificação completa, misture apenas por pipetagem.
  8. Prepare a contracoloração nuclear em um recipiente de contracoloração nuclear. O volume necessário é de 350 + (300 μL x número de lâminas) e é composto pela solução de contracoloração nuclear fornecida diluída a 1:100 em água ultrapura. Misture por vórtice.
  9. Prepare a mistura de sondas fluorescentes correspondente à primeira rodada de imagens no recipiente da sonda fluorescente. O volume necessário é de 350 + (450 μL x número de lâminas), consistindo na solução das sondas fluorescentes 1 diluída 1:20 dentro do tampão da sonda. Vortex os componentes após o descongelamento, bem como a mistura final completa.
  10. Depois que todos os reagentes estiverem preparados e colocados em seus recipientes correspondentes, coloque a varinha de reagente completa no software para permitir que o volume do reagente seja medido.

5. Execute a configuração

  1. Depois que todos os reagentes estiverem preparados, navegue até a guia Configuração do slide na parte superior do software e selecione o botão Novo estudo . Adicione o ID do estudo, o nome do estudo e os comentários do estudo conforme desejado. Consulte a Figura 2 como exemplo.
  2. Em volume de dispensação, selecione 150 μL e *Desparafinar 4 etapas como protocolo de preparação. Se *Dewax 4 steps não aparecer no menu suspenso, localize este protocolo no menu Configuração de protocolo e marque a caixa Preferido . Pressione OK.
  3. Depois que o estudo for criado, selecione o botão Adicionar slide no lado direito da tela de configuração do slide. Em Comentários do slide, nomeie exclusivamente o slide.
  4. Para os campos adicionais nesta tela, defina Tipo de tecido para Tecido de teste e defina o volume de distribuição para 150 μL com o modo de coloração sendo Único no menu suspenso à esquerda e Rotina no menu suspenso à direita. Em processo, selecione IHC, com o marcador sendo Solução de coloração de anticorpos.
  5. Na seção de protocolo da janela Adicionar slide, selecione Ensaio de coloração 1 para coloração, * Desparafine 4 etapas como preparação e *HIER 20 min com ER2 como HIER. O protocolo da enzima permanecerá *----. Quando isso estiver concluído, clique em Adicionar slide. Consulte a Figura 2 como exemplo.
  6. Repita esse processo conforme necessário para o número de slides a serem executados no estudo, garantindo que o campo Comentários do slide seja atualizado para cada slide adicionado para que eles possam ser identificados exclusivamente posteriormente. Depois que todos os slides forem adicionados, feche a janela Adicionar slide e imprima todas as etiquetas, afixando-as em suas seções de tecido correspondentes.
  7. Carregue cada slide na bandeja e coloque os ladrilhos de cobertura no topo de cada seção antes de carregar a bandeja no software. Depois que os reagentes e as lâminas forem adicionados, selecione o corador automático correspondente no lado direito do software. Uma vez selecionado, todas as três bandejas de lâminas e informações de todos os reagentes no software ficarão visíveis, incluindo reagentes a granel e aqueles adicionados durante a preparação do reagente.
  8. Certifique-se de que os recipientes de reagentes a granel estejam cheios e que os recipientes de resíduos tenham volume suficiente para concluir a execução e, em seguida, pressione o botão Reproduzir para iniciar a execução.
  9. Cada corrida leva aproximadamente 5 h e 15 min para ser concluída. Anote o tempo de parada e certifique-se de que as lâminas sejam removidas do corador automático imediatamente assim que o protocolo for concluído.

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Figura 2: Prompts para o software. (A) Novo prompt de estudo no software Autostainer, mostrando as configurações corretas para o protocolo de coloração por imunofluorescência multiplexada (mIF). (B) Adicione o prompt de slide no software, mostrando as configurações corretas para o protocolo de coloração mIF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Exames de imagem

  1. Após a conclusão do protocolo de coloração, remova as lâminas manchadas e a lamínula no meio de montagem. Deixe o meio de montagem curar no escuro até que a lamínula esteja firmemente fixada no lugar (normalmente 1 h ou mais, ponto de pausa).
  2. A imagem é feita em um microscópio de fluorescência ou scanner de lâmina inteira com filtros apropriados para o ensaio. Os corantes usados neste ensaio são normalmente compatíveis com filtros para DAPI, FITC, TRITC, Cy5 e Cy7.
  3. As imagens serão semelhantes às da Figura 3A. Certifique-se visualmente de que todas as áreas do tecido estejam devidamente focadas e que os sinais apareçam em um nível de intensidade apropriado (não superexpostos/subexpostos). Se necessário, recrie a imagem dos slides com diferentes configurações de exposição.
  4. Após a imagem, se uma rodada adicional de imagens for necessária, mergulhe as lâminas em 1x PBS até que as lamínulas caiam sozinhas. (ponto de pausa)

7. Configuração inicial do protocolo Exchange

  1. Se o software for a versão 7.0 ou posterior, haverá um modelo pré-instalado do protocolo do corador automático. Na parte inferior da tela, verifique se a seleção de Status Preferencial está definida como Todos. O protocolo de modelo será denominado *ISP Signal Exchg. Para versões anteriores do software, o protocolo pode ser encontrado na Tabela 3.
  2. Clique com o botão direito do mouse em *ISP Signal Exchg e copie o protocolo. Na janela pop-up resultante, renomeie o protocolo Exchange Protocol 1 com o nome abreviado ISPEXCH1. Certifique-se de que a caixa Preferencial esteja marcada antes de prosseguir e atribua o mesmo nome de kit estabelecido na Etapa 2.6.

Tabela 3: Protocolo para protocolo de troca de sinal de imunofluorescência multiplex. O tampão de lavagem corresponde à solução BOND Wash. Todos os outros reagentes auxiliares têm componentes de kit com nomes correspondentes. Este protocolo é compatível com a versão de software 7.0 e superior, BXD 39 e superior. Clique aqui para baixar esta tabela.

8. Configuração e execução do protocolo Exchange

  1. Descongele o buffer de troca à temperatura ambiente. Manter o neutralizador de permuta e o iniciador de permuta a -20 °C até à utilização. Dois recipientes de titulação de reagente e o kit de detecção são necessários para executar o protocolo de troca.
  2. Prepare a solução de troca no recipiente correspondente. O volume necessário é de 350 + (450 μL x número de lâminas) e é composto por um iniciador de troca diluído 1:500 no buffer de troca. Não vortex a enzima de troca ou a solução de troca completa, misture apenas por pipetagem.
  3. Prepare a segunda mistura de sondas fluorescentes no recipiente de sondas fluorescentes 2. O volume necessário é de 350 + (450 μL x número de lâminas) e é composto pela solução fluorescente das sondas 2 diluída 1:20 e pelo neutralizador de troca diluído 1:40 dentro do tampão da sonda 2. A mistura da sonda fluorescente e o tampão da sonda podem ser vórtices, mas o neutralizador de troca e a solução combinada final devem ser misturados apenas com pipeta.
  4. Depois que todos os reagentes estiverem preparados, coloque a varinha cheia no corador automático e permita que os reagentes sejam testados por imersão pela máquina.
  5. Adicione todos os slides seguindo a etapa 5. Durante a adição do slide, altere o marcador para *Negativo. Para Preparação, HIER e Enzima, selecione a opção *----, pois nenhuma desparafinação ou recuperação de antígeno é necessária para o protocolo de troca. Quando isso estiver concluído, clique em Adicionar slide.
  6. Repita esse processo conforme necessário para o número de slides a serem executados no estudo, garantindo que o campo Comentários do slide seja atualizado para cada slide adicionado para que eles possam ser identificados exclusivamente posteriormente.
  7. Depois que todos os slides forem adicionados, feche a janela Adicionar slide e imprima todas as etiquetas, afixando-as em suas seções de tecido correspondentes.
  8. Carregue cada slide na bandeja e coloque os ladrilhos de cobertura no topo de cada seção antes de carregar a bandeja no software.
  9. Depois que todos os reagentes e lâminas forem adicionados, selecione o Corador Automático Correspondente no software; isso estará no lado direito. Uma vez selecionado, todas as três bandejas de lâminas e informações de todos os reagentes no software ficarão visíveis, incluindo reagentes a granel e aqueles adicionados durante a preparação do reagente.
  10. Certifique-se de que os recipientes de reagentes a granel estejam cheios e que os recipientes de resíduos tenham volume suficiente para completar a execução.
  11. Depois que isso for confirmado, pressione o botão Reproduzir para iniciar a execução. O protocolo leva aproximadamente 90 minutos para ser concluído. Anote o tempo de parada e certifique-se de que os slides sejam removidos imediatamente após a conclusão da corrida.

9. Imagem

  1. Repita a imagem para a nova rodada de sondas, como na etapa 5. As imagens aparecerão como na Figura 3B.

10. Empilhamento (para imagens de proteínas >4-plex)

  1. Várias imagens agora existirão para o mesmo slide. Combine as imagens no software de co-registro de imagem para gerar uma imagem empilhada de 8 plex.
  2. Registre as imagens de cada rodada da seguinte forma.
    1. Cada imagem redonda é nomeada da seguinte maneira: _ em que é o nome exclusivo do slide (código de barras) e é uma cadeia de caracteres que, quando classificada em ordem alfabética, colocará a imagem da rodada 1 em primeiro lugar, a imagem da rodada 2 em segundo. Por exemplo, para = 1234ABC, os arquivos podem ser nomeados 1234ABC_Round1 e 1234ABC_Round2, com todos os arquivos tendo a extensão apropriada (por exemplo, .czi) do scanner. Coloque todas as imagens redondas em uma única pasta chamada, por exemplo, Imagens de origem.
    2. No software de co-registro, clique no botão Definir na seção do diretório de imagens de origem da interface do usuário e, quando solicitado, selecione a pasta criada acima.
    3. Defina o tipo de arquivo na seção Imagens de origem para a extensão das imagens de origem (por exemplo, .czi, .qptiff, etc.). O software agora exibirá as duas imagens redondas juntas em uma tabela mostrando que o slide 1234ABC tem 2 imagens redondas.
    4. Se desejar, defina o local das imagens empilhadas de saída para um diretório diferente da pasta de imagens de origem usando o botão Definir na seção do diretório de imagens empilhadas da interface do usuário e, quando solicitado, escolha a pasta Saída desejada . Caso contrário, a pasta de imagens de origem será usada por padrão.
    5. Por padrão, apenas uma representação de arquivo .afi da pilha é criada. Marque a opção para salvar um arquivo OME.tif de toda a pilha na seção de opções de processamento da interface.
    6. Para validar a precisão do co-registro em toda a amostra, marque a opção Validação na seção de saída da interface.
    7. Pressione o botão START para iniciar o co-registro de imagem.

11. Análise de imagem

  1. Depois que as lâminas forem visualizadas, visualize e analise as lâminas usando qualquer método de análise de sua escolha, como o pacote de processamento de imagem STARVUE da Ultivue ou o QuPath15.

Resultados

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Seguindo o protocolo acima, o tecido FFPE será corado com múltiplos alvos, e imagens de alta qualidade de todos os marcadores em grupos de quatro foram obtidas (Figura 3A, B). O software de co-registro de imagem permitirá que as imagens do mesmo slide sejam combinadas e co-registradas, como visto na Figura 3C. Resultados semelhantes são mostrados na Figura 4 para uma lâmina de tecido de câncer colorretal (CRC).

O sucesso do protocolo deve ser determinado pela avaliação do padrão de coloração esperado. No exemplo de CRC mostrado, cada um dos alvos corados é expresso no compartimento subcelular esperado, por exemplo, FoxP3 nuclear, CD3 membranoso, CD68 citoplasmático (Figura 4B-D). Cada um dos alvos funcionais é expresso no tipo de célula apropriado, como demonstrado pelo exemplo de co-localização de PD1 e CD3 ou de PDL-1 e CD68, que mostram células T exaustas e macrófagos imunossupressores, respectivamente. A avaliação de uma boa relação sinal-fundo, permitindo a distinção bem-sucedida do sinal positivo verdadeiro do ruído de fundo potencial, geralmente é realizada qualitativamente por patologistas ou especialistas em análise de imagem que confirmam a qualidade da coloração, permitindo uma análise de imagem bem-sucedida. Para confirmar ainda mais a qualidade e o desempenho da coloração, pode-se adicionar uma comparação com o padrão ouro IHC (DAB cromogênico) em seções seriadas (veja o exemplo na Figura 5), bem como uma amostra de tecido de controle positivo, como amígdala humana, que para a maioria dos alvos imunológicos pode ser útil para confirmar o sucesso da coloração. Observe que os cânceres podem apresentar menor expressão de alvos do que a amígdala humana16.

Após a confirmação qualitativa dos resultados, a análise quantitativa pode ser realizada. Neste trabalho, este consiste principalmente em calcular a densidade celular de diferentes fenótipos (número de células/mm2) expressando um determinado alvo ou alvos, bem como calcular os níveis médios de intensidade de alvos funcionais que podem apresentar uma ampla faixa dinâmica de expressão. Ao avaliar a precisão dos ensaios de mIF, cortes seriados corados com os mesmos marcadores devem mostrar sinais comparáveis entre as lâminas, que podem ser vistos qualitativamente na Figura 6. Exemplos de resultados quantitativos de densidades de marcadores únicos em diferentes tipos de tecido são mostrados na Figura 7. A análise de imagem nessas imagens permite que células positivas sejam identificadas, e uma densidade de células positivas correspondente pode ser calculada para cada marcador, bem como a intensidade média do sinal por célula positiva. Isso permite que um coeficiente de variabilidade (CV) seja calculado para cada marcador para avaliar a precisão do ensaio de multiplexação (Tabela 4).

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Figura 3: Imagens de um núcleo de microarray de tecido (TMA) obtidas de sucessivas rodadas de coloração em protocolo de imunofluorescência 8-plex. (A) Imagem obtida na primeira rodada de imagens, apresentando os marcadores CD8, PD1, PD-L1 e CD68. Após o protocolo de troca, (B) mostra a segunda rodada de imagens na mesma lâmina para a segunda rodada de marcadores CD3, CD4, FoxP3 e CK/SOX10, e (C) mostra uma imagem co-registrada combinando as imagens (A) e (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Coloração representativa do tecido de câncer colorretal (CCR) com coloração de imunofluorescência 8-plex. A figura mostra fenótipos celulares que podem ser identificados pela co-localização de vários alvos na mesma célula. (topo) Imagem de lâmina inteira do tecido do CCR. (parte inferior) Visualizações detalhadas de regiões de tecido destacando (A) células T-reg (CD3+/CD4+/FOXP3+), (B) células que expressam PD-1 e PD-L1 dentro do tumor e estroma, (C) células T citotóxicas exaustas (CD3+/CD8+/PD-1), (D) células tumorais que evitam imunidade (PD-L1+/CK+) e macrófagos imunossupressores (CD68+/PDL1+). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Comparação qualitativa da imuno-histoquímica (IHQ) com a coloração por imunofluorescência (IF). Cortes seriados corados com coloração imuno-histoquímica de marcador único (DAB, linha superior), imunofluorescência de marcador único (ISP monoplex) e visão de canal único de imunofluorescência multiplex (ISP multiplex) demonstrando concordância qualitativa entre os diferentes métodos de coloração. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Coloração de seção serial. (A) Diagrama mostrando o layout de uma TMA multi-tecido. (B) Imagens representativas de 8 plex de núcleos de tecido de cada tipo de tecido no TMA. (C) Imagens representativas de CD8 em um núcleo de amígdala em seis seções seriadas de TMA coradas em uma única corrida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Quantificação da densidade de marcador único por tipo de tecido incluído no TMA. As densidades por tecido são as densidades médias em três núcleos representativos de cada tipo de tecido na lâmina de TMA. O eixo y representa as densidades de marcadores únicos em diferentes tipos de tecido no eixo x, em unidades de células positivas/mm2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8: Análise da região de interesse (ROI) do sinal fluorescente relativo comparando o mIF ISP amplificado descrito neste protocolo com o IF indireto. (A) Lâmina representativa corada para CK (esquerda) ou PD-L1 (direita) com cinco ROIs indicadas. (B) Imagens ROI representativas para CK (superior) e PD-L1 (inferior). Intensidade média do sinal alcançada com mIF amplificado (roxo) e IF indireto (azul) para (C) CK e (D) PD-L1 em cinco ROIs, cada uma medindo 100 μm x 100 μm e contendo aproximadamente 200 células. Os valores do eixo Y mostram unidades fluorescentes arbitrárias e as barras de erro mostram desvios padrão (n = 3). (E) A intensidade relativa do sinal alcançada com o mIF ISP amplificado (roxo) e o IF indireto (azul) foi calculada tomando a razão entre o sinal mIF amplificado médio e o sinal IF indireto médio em todas as ROIs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 4: Coeficiente de variância (CV) calculado. O CV de densidade celular positiva e a intensidade média do sinal para as imagens das amígdalas são mostrados na Figura 6. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

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Este relatório descreve um protocolo para coloração de imunofluorescência multiplex de alto rendimento e alta sensibilidade usando um corador automático. Ao conduzir este protocolo, as etapas de preparação do reagente são críticas e merecem atenção. É necessário garantir que os reagentes sejam misturados adequadamente e medidos corretamente para minimizar a variabilidade da coloração entre diferentes lâminas na mesma corrida ou entre diferentes corridas usando os mesmos componentes.

Problemas comuns ao realizar este protocolo incluem não misturar os reagentes adequadamente antes do carregamento e o potencial de perda de tecido devido a um procedimento inadequado de remoção de lamínula. Embora este protocolo de coloração seja aplicável a qualquer tipo de tecido FFPE, incluindo tipos de câncer, alguns tipos de tecido podem exigir um manuseio mais cuidadoso (por exemplo, tecidos com alto teor de gordura). Para evitar a perda de tecido, deixe as lâminas de cobertura de molho por um tempo suficientemente longo para que a lamínula se solte sozinha. Não force a lamínula a se soltar ou retirar o vidro.

Uma limitação é que, embora muitos dos alvos mais comumente usados em imuno-oncologia estejam validados e prontos para uso, alguns alvos podem exigir o desenvolvimento de ensaios antes de serem incluídos em um painel multiplex. Embora esse processo seja relativamente rápido, isso pode exigir mais algumas semanas antes de poder usar um painel multiplex personalizado.

Existem várias diferenças entre este ensaio e outras tecnologias de imunofluorescência multiplex. Em comparação com as tecnologias baseadas em imunofluorescência direta e indireta, o ensaio aqui demonstrado tem um nível significativamente maior de amplificação, permitindo uma melhora significativa da relação sinal-ruído, particularmente em canais que tendem a mostrar autofluorescência tecidual, como o canal FITC. Isso resulta em um sinal ~ 30x mais forte do que a imunofluorescência direta e um sinal ~ 10x mais forte do que a imunofluorescência indireta, conforme quantificado usando análise de intensidade de lâmina inteira e análise manual baseada em ROI (Figura 8). Esse método permite a detecção de proteínas-alvo muito mais sensíveis em tempos de exposição substancialmente mais baixos e elimina a necessidade de manipulação de imagens, incluindo subtração de fundo que corre o risco de remover sinais de baixa intensidade.

Em comparação com os ensaios de mIF baseados na amplificação catalisada por enzimas, o ensaio demonstrado aqui tem uma capacidade significativamente melhorada de realizar multiplexação, além de ter um fluxo de trabalho mais simples e um tempo de execução de ensaio geralmente mais curto (Figura 1). Neste ensaio, os anticorpos são adicionados em uma única etapa e amplificados simultaneamente, simplificando muito o protocolo de ensaio. Além disso, algumas tecnologias baseadas em enzimas, como a amplificação do sinal de tiramida (TSA), podem mostrar interferência entre diferentes anticorpos, no que é denominado efeito guarda-chuva 12,17,18. A tecnologia de amplificação aqui utilizada evita esse problema, permitindo a detecção de múltiplos marcadores colocalizados e co-expressos na mesma célula, como pode ser visto na Figura 4.

Aproximadamente 90% dos cânceres humanos surgem de células epiteliais19. Isso ocorre porque eles geralmente formam a primeira linha de defesa contra o ambiente externo e proliferam mais rapidamente, levando a um acúmulo mais rápido de mutações potencialmente oncogênicas. Aqui, a inflamação desempenha um papel crítico na tumorigênese, progressão e disseminação. Na última década, muitas terapias direcionadas a inibidores de checkpoint imunológico e células imunes surgiram como um poderoso arsenal contra muitos tipos de tumores 5,20,21. No entanto, uma parcela significativa dos pacientes ainda não responde. É provável que o microambiente tumoral (TME) e a paisagem imune local desempenhem um papel crítico. Ao traçar o perfil das assinaturas moleculares de TME associadas à resposta diferencial a medicamentos em muitos pacientes, pode ser possível definir melhor os biomarcadores terapêuticos. Este relatório demonstra que a tecnologia mIF pode ser usada para traçar o perfil de vários biomarcadores de proteínas em paralelo, incluindo marcadores com baixa expressão, em centenas de lâminas de amostras inteiras ou microarrays de tumores.

Divulgações

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Os autores K. H., A. Veith, L. D., D. W., G. C., Y. C., J. H. L. e A. Vasaturo são funcionários da Ultivue, que produz os kits de imunofluorescência multiplex usados neste trabalho.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Ultivue.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Clone Anti-CD3UltivueBC33 (BioCare). Parte de ULT50801
clone anti-CD4UltivueSP35 (Abcam). Parte de ULT50801
anti-CD68UltivueKP1 (BioCare). Parte de ULT50801
anti-CD8UltivueC8 / 144B (BioCare). Parte dos ULT50801
clones anti-citoqueratina + anti-SOX10UltivueAE1/AE3 (Bethyl Labs) e BC34 (BioCare). Parte do ULT50801, fornecido como uma mistura
Anti-FOXP3UltivueClone 236A/E7 (Thermo). Parte de ULT50801
clone anti-PD1UltivueCAL20 (Abcam). Parte de ULT50801
Clone UltivueAnti-PDL173-10 (Abcam). Parte do ULT50801
Microscópio Axioscan.Z1Zeisschamado microscópio de fluorescência em texto
Solução de desparafinamento de ligaçãoLeicaAR9222
Solução de recuperação de epítopos de ligação 2LeicaAR9640
Recipientes abertos de ligação, 30 mLLeicaOP309700
Kit de detecção de pesquisa de ligaçãoLeicaDS9455
Inserções de titulação de ligaçãoLeicaOPT9049
Kit de titulação de ligaçãoLeicaOPT9719
Bond Universal CovertilesLeicaS21.4611
Solução de lavagem de ligação 10x concentradoLeicaAR9590
BondRX AutostainerLeicachamado de "autostainer" no texto
SoftwareBondRXLeicaVersão 6.0 ou posterior
Lamínulas, espessura #1.5Etanol Corning2980-244
, 200 provasVWR89370-084
FFPE blocos de tecido OsBioIVTvariam
Ensaio OmniVUE 8-plex (CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1, pan-Citoqueratina/SOX10)UltivueULT50801contém todos os outros componentes Ultivue
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Boston BioProductsC-9911F(pH 7,4 com 2,7 mM KCl e 137 mM NaCl)
ProLong Gold AntifadeMountant ThermoP10144chamado de "meio de montagem" no texto
UltiAnalyzer.AIUltivue
UltiStacker.AIUltivue
Ultivue Ampüm de amplificaçãoUltivueparte do ULT50801
Diluente de anticorpos UltivuePartedo ULT50801
Tampão de troca UltivuePartedo ULT50801
Iniciador de troca Ultivuedo ULT50801
Neutralizador de troca UltivueParte do ULT50801
Sondas fluorescentes Ultivue 1Ultivueparte de ULT50801
Sondas Fluorescentes Ultivue 2Parte Ultivuede ULT50801
Mistura de Pré-Amplificação UltivueParte de ULT50801
Tampão de Sonda Ultivuede ULT50801
Água ultrapuraSigma-AldrichW4502
cloneclone tipos de tecido Parte Parte

Referências

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