Purificação, expansão e fenotipagem baseada em citometria de fluxo de células-tronco mesenquimais da medula óssea derivadas de camundongos

Summary

O presente protocolo descreve um método econômico para purificar, expandir e caracterizar células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSCs) altamente homogêneas de camundongos. Essa abordagem facilita a aquisição de grandes quantidades de BMSCs com alto potencial de proliferação e diferenciação, apoiando modelos de camundongos e avançando na pesquisa pré-clínica.

Abstract

As células-tronco mesenquimais (MSCs) são uma população de células-tronco que podem se auto-renovar e se diferenciar em múltiplas linhagens celulares. Entre eles, as MSCs encontradas na medula óssea, conhecidas como células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSCs), desempenham um papel crucial na osteogênese, suporte hematopoiético, homing / migração e imunossupressão. As BMSCs são amplamente utilizadas em pesquisas de biologia celular e engenharia de tecidos devido ao seu potencial para estratégias terapêuticas celulares, bem como sua fácil disponibilidade, estabilidade genética e baixa imunogenicidade. As células-tronco hematopoiéticas (HSCs) e BMSCs coexistem na medula óssea, mas possuem células progenitoras distintas. Ao extrair células da medula óssea, vários tipos de células são normalmente obtidos, o que pode levar à heterogeneidade na população de células, potencialmente causando viés e não atendendo a altos padrões experimentais. Portanto, é crucial desenvolver técnicas eficazes para melhorar a homogeneidade e o rendimento das BMSCs in vitro. Este estudo apresenta um protocolo detalhado para a purificação, expansão e fenotipagem baseada em citometria de fluxo de BMSCs obtidas de camundongos BALB/c. A homogeneidade e o fenótipo de células-tronco das BMSCs de terceira passagem foram caracterizados por citometria de fluxo, demonstrando positividade para CD29, CD44 e Sca-1, negatividade para CD45 e CD31 e confirmando sua capacidade de diferenciação osteogênica e adipogênica. Este protocolo econômico fornece um método fácil e eficiente para obter um número suficiente de BMSCs homogêneos com alto potencial de proliferação e diferenciação, o que é essencial para o avanço da pesquisa em modelos de camundongos e extensos estudos pré-clínicos.

Introduction

As células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSCs) são conhecidas por suas características multipotentes e são amplamente utilizadas no tratamento de várias doenças devido às suas propriedades auto-renováveis, diferenciadoras e imunomoduladoras ^1,2. As BMSCs são facilmente obtidas, capazes de expansão extensa, exibem propriedades imunossupressoras e não desencadeiam reações imunes imediatas³, tornando-as atraentes para aplicações de engenharia de tecidos e transportadores eficazes para terapia celular.

Na medula óssea, duas populações principais de células-tronco e suas progênies, as células-tronco hematopoiéticas e as BMSCs, são os residentes primários⁴. Tradicionalmente, as BMSCs são obtidas por meio de aspiração direcionada da medula óssea e identificadas como células aderentes ao plástico in vitro. No entanto, esse método é insuficiente para diferenciar as BMSCs de outras subpopulações da medula óssea, incluindo células endoteliais, pericitos, leucócitos e células-tronco hematopoiéticas⁵. Portanto, é necessário um protocolo fácil e eficaz para isolamento de BMSCs.

O trabalho atual detalha a separação e purificação de BMSCs por meio de sua aderência física a placas de cultura de células plásticas. Experimentos de citometria de fluxo foram conduzidos em BMSCs de terceira passagem usando os marcadores de superfície CD29, CD44 e Sca-1, conforme descrito pelo comitê de células estromais mesenquimais (MSC) da Sociedade Internacional de Terapia Celular e Genética (ISCT)⁶. De acordo com os critérios do ISCT, as MSCs de camundongos são caracterizadas por positividade para CD29, CD44 e antígeno de células-tronco 1 (Sca-1) e negatividade para marcadores de células hematopoiéticas CD45 e marcadores de células endoteliais CD31. Além disso, as BMSCs devem ser multipotentes, demonstrando diferenciação de trilinhagem em osteoblastos, condrócitos e adipócitos. Neste experimento, a osteogênese foi induzida nas BMSCs extraídas, com coloração ALP realizada no dia 7 e um ensaio de S com vermelho de alizarina no dia 21 para avaliar a diferenciação. A diferenciação adipogênica de BMSCs isoladas e purificadas também foi induzida, com coloração Oil Red O realizada no dia 21 para avaliar a adipogênese.

Protocol

O manejo dos animais foi aprovado de acordo com as diretrizes de Ética em Animais de Laboratório (aprovação ética nº: PZSHUTCM2211070009) da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai. Camundongos BALB/c fêmeas de oito semanas de idade (grau SPF, 20 ± 1 g de peso corporal) foram usados neste estudo. Este protocolo descreve a purificação, passagem, fenotipagem baseada em citometria de fluxo e diferenciação osteogênica e adipogênica de BMSCs derivadas de camundongos. Os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Manipulação de animais

1. Abrigar camundongos em condições específicas livres de patógenos (SPF) em gaiolas ventiladas individualmente, com cinco camundongos por gaiola. Forneça ração de qualidade SPF e água estéril. Mantenha um ciclo claro/escuro de 12 horas.
   NOTA: Este método foi testado e considerado viável nas cepas de camundongo BALB/c e C57BL/6. Este artigo usa principalmente BALB/c como exemplo.

2. Colheita de fêmures e tíbias de membros posteriores de camundongos

1. Eutanásia dos animais por asfixia por CO₂ seguida de luxação cervical⁷ seguindo diretrizes éticas.
2. Mergulhe os camundongos em etanol a 75% por 5 min (Figura 1A).
   NOTA: As células-tronco foram colhidas dentro de 30 min² após a eutanásia, e todo o processo, incluindo lavagem da medula, filtração e semeadura em placas de cultura, foi concluído em 2 h para garantir a viabilidade celular ideal.
   NOTA: Use camundongos adultos (≥8 semanas de idade) para obter o rendimento ideal do BMSC; Ratos de 8 a 12 semanas são ideais⁸.
3. Faça uma incisão de cerca de 1 cm no membro posterior do tendão de Aquiles com tesoura de dissecção estéril (Figura 1B).
4. Faça uma incisão circular ao redor do membro posterior do tendão de Aquiles com tesoura estéril para expor a tíbia distal (Figura 1C).
5. Retire a pele da incisão em direção ao quadril para removê-la de ambos os membros posteriores (Figura 1D).
6. Corte ao longo do osso ilíaco para separar a cabeça femoral do osso do quadril (Figura 2A).
   NOTA: Evite danificar as articulações bilaterais do fêmur durante a dissecção para evitar a perda de medula óssea.
7. Coloque os fêmures e tíbias coletados em um prato de 60 mm contendo PBS pré-resfriado estéril contendo penicilina/estreptomicina a 2% (Figura 2B).
8. Corte o máximo possível de tendão e músculo da tíbia e da fíbula usando um bisturi estéril para facilitar a lavagem posterior (Figura 2C).
9. Retorne os ossos processados ao PBS contendo penicilina / estreptomicina a 2% e transfira-os para o capuz estéril para as etapas de isolamento subsequentes.

3. Purificação e cultura de BMSCs de camundongo

1. Prepare o meio completo de modificação alfa MEM (αMEM) para cultura de BMSC suplementando αMEM com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina.
   NOTA: Escolha o meio αMEM, pois contém 1000 mg / L de glicose, que é uma concentração relativamente baixa. Isso ajuda a prevenir a inibição da proliferação celular que pode ocorrer em ambientes com alto teor de glicose⁹
2. Pegue uma seringa de 50 mL e coloque a agulha que acompanha a seringa.
3. Aspire 20 mL de meio αMEM na seringa de 50 mL e, em seguida, substitua a agulha pela que vem com a seringa de 1 mL.
   NOTA: Use uma agulha de seringa de 1 mL para acomodar o tamanho do osso e minimizar o dano celular. Uma seringa de 50 mL permite a lavagem eficiente da medula óssea com risco reduzido de contaminação celular por inserções repetidas.
4. Use uma tesoura para cortar ambas as extremidades do fêmur ou tíbia separados em um capuz estéril.
5. Insira a agulha no osso ao longo da borda cortada e lave a medula óssea em uma placa de cultura de 100 mm contendo meio αMEM completo (Figura 2D).
6. Lave as cavidades ósseas repetidamente até que os pedaços de osso pareçam pálidos para garantir que a maior parte da medula óssea tenha sido extraída (Figura 2E).
7. Pipete para cima e para baixo 40 vezes suavemente com uma ponta de pipeta para dispersar as células agregadas o máximo possível.
8. Filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 40 μm em um tubo de centrífuga de 50 mL para remover detritos, fragmentos de tecido e aglomerados não dispersos.
9. Transferir a suspensão de células filtradas para uma placa de cultura de células de 100 mm e adicionar o meio αMEM completo a um volume final de 15 ml por placa.
   NOTA: Cultive todas as células da medula óssea coletadas dos fêmures e tíbias de cada camundongo em uma placa de cultura de 100 mm para facilitar o crescimento celular. Com base em experimentos anteriores, aproximadamente 1 × 10⁷ BMC pode ser isolado de um camundongo de 8 semanas de idade (de dois fêmures e duas tíbias). Essas células são semeadas em uma placa de cultura de 100 mm a uma densidade de 1,8 × 10⁵ células/^cm2 para cultura primária.
10. Segure o prato com as duas mãos e gire-o suavemente em um movimento em forma de oito 15 vezes para garantir uma distribuição uniforme das células pelo prato.
11. Coloque a placa de cultura a 37 °C em uma incubadora de CO_{5% 2} e cultive por 5 dias (Figura 3A).
    NOTA: Evite mover a placa de cultura durante este período para garantir um crescimento celular uniforme.

4. Substituição do meio αMEM para cultura BMSC

1. Observe as células ao microscópio para determinar se atingiram 80% de confluência. Caso contrário, prossiga com a substituição do meio no^5º dia.
2. Retire 3 mL de PBS com uma pipeta Pasteur estéril e dispense-o de uma altura de 1 cm acima da placa de cultura em diferentes posições.
   NOTA: Evite dispensar líquido em um lado do prato, pois isso pode remover as células aderentes devido à força de impacto excessiva e impedir a remoção eficaz de células indesejadas.
3. Depois de adicionar 3 mL de PBS, agite suavemente a placa de cultura para lavar bem as células e remova a PBS da placa com uma pipeta. Repita o processo de lavagem mais uma vez para garantir que as células sejam bem lavadas.
4. Retire 15 ml de meio αMEM completo com uma pipeta Pasteur estéril e dispense-o a partir de 1 cm acima da placa de cultura em diferentes posições.
5. Retorne a placa de cultura para a incubadora e monitore até que as células atinjam 80% de confluência antes da subcultura (Figura 3B).

5. Passagem de BMSCs

1. Lave 80% das células confluentes duas vezes com PBS (Figura 3C).
   NOTA: Lavar as células com PBS antes da digestão ajuda a remover o meio residual e as secreções celulares e reduz a adesão do MSC à placa de cultura.
2. Digerir as células com 1 ml de tripsina-EDTA a 0,25% incubando a 37 °C numa incubadora de CO₂ a 5% durante 2 a 3 min.
3. Neutralize a tripsina adicionando 4 mL de meio αMEM completo à suspensão celular.
4. Aspire a suspensão celular da placa de cultura usando uma ponta de pipeta de 1 mL e lave suavemente o fundo da placa para separar todas as células aderentes.
5. Transfira a suspensão da célula para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugue a 300 × g por 5 min em temperatura ambiente.
6. Use uma pipeta para descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 2 mL de meio αMEM completo.
   NOTA: Para subcultivo, uma densidade de semeadura de aproximadamente 4 × 10⁴ células / cm² foi considerada ideal para crescimento e proliferação contínuos.
7. Divida as células na proporção de 1:1–1:2 em novas placas de cultura de células de 100 mm (isso constitui a^1ª passagem, P1) (Figura 3D).
8. Divida as células aproximadamente a cada três dias na proporção de 1:1,5 quando atingirem 80% de confluência para gerar a segunda passagem (P2) (Figura 3E) e a terceira passagem (P3) (Figura 3F) de BMSCs.

6. Preparação de BMSCs P3 para identificação fenotípica e diferenciação osteogênica

1. Rejeitar o meio de cultura celular.
2. Lave os BMSCs P3 com 3 mL de PBS duas vezes.
3. Digerir os BMSCs P3 com 1 mL de tripsina-EDTA a 0,25% incubando a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5% por 2–3 min quando atingirem 80% de confluência.
4. Neutralize a tripsina adicionando 4 mL de meio αMEM completo à suspensão celular.
5. Transfira a suspensão da célula para um tubo de centrífuga de 15 mL, centrifugue a 300 × g por 5 min em temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
   NOTA: Os pellets P3 BMSC preparados aqui serão usados para identificação fenotípica por citometria de fluxo e para avaliar a diferenciação osteogênica ou adipogênica.

7. Identificação fenotípica de BMSCs por citômetro de fluxo

1. Ressuspenda os grânulos celulares de P3 BMSCs com 1,5 mL de solução de PBS contendo 2% de FBS e ajuste a concentração para 5 × 10⁶ células / mL.
2. Alíquota de 100 μL da suspensão celular em cada um dos 11 tubos para obter 5 × 10⁵ células por tubo. Prepare os seguintes grupos: rótulo em branco, controle de isotipo CD29, CD29, controle de isotipo CD44, CD44, controle de isotipo Sca-1, Sca-1, controle de isotipo CD31, CD31, controle de isotipo CD45 e CD45.
   NOTA: No presente estudo, foram utilizados os seguintes fluorocromos: CD29-FITC, CD29 isotipo-FITC, CD44-APC, CD44 isotipo-APC, Sca-1-PECy7, Sca-1 isotipo-PECy7, CD45-PerCPcy5.5, CD45 isotipo-PerCPcy5.5, CD31-PE e CD31 isotipo-PE (conforme mostrado na tabela de materiais). Esses fluorocromos podem ser modificados com base nas configurações de diferentes citômetros de fluxo.
3. Para cada grupo, adicionar os seguintes reagentes: 2 μL de PBS ao grupo de controlo do isotipo CD44, 2 μL de isotipo CD29 ao grupo de controlo do isotipo CD29 (diluição 1:50), 2 μL de CD29 ao grupo CD29 (diluição 1:50), 0,5 μL de isotipo CD44 ao grupo de controlo do isotipo CD44 (diluição 1:200), 0,5 μL de CD44 ao grupo CD44 (diluição 1:200), 0,5 μL de isotipo Sca-1 para o grupo controle do isotipo Sca-1 (diluição 1:200), 0,5 μL de Sca-1 para o grupo Sca-1 (diluição 1:200), 2 μL de isotipo CD31 para o grupo controle do isotipo CD31 (diluição 1:50), 2 μL de CD31 para o grupo CD31 (diluição 1:50), 2 μL de isotipo CD45 para o grupo controle do isotipo CD45 (diluição 1:50), e 2 μL de CD45 para o grupo CD45 (diluição 1:50).
   NOTA: Os anticorpos foram usados de acordo com as recomendações otimizadas do fabricante para citometria de fluxo. Experimentos preliminares confirmaram a coloração e a especificidade ideais para as células-alvo. Consulte as diretrizes de dosagem do fabricante e realize pré-testes de titulação conforme necessário.
4. Misturar delicadamente, centrifugar com uma centrífuga de palma e incubar durante 30 min a 4 °C na obscuridade.
5. Adicione 900 μL de PBS a cada tubo, misture invertendo e centrifugue a 300 × g por 5 min a 4 ° C. Descarte o sobrenadante para remover o excesso de anticorpos.
6. Ressuspender o sedimento celular em cada tubo com 300 μL de PBS e analisar com um citómetro de fluxo.
   NOTA: As células não precisam ser fixadas com formaldeído neutro a 2,5% se o ensaio do citômetro de fluxo puder ser concluído em 1–2 h. Se a análise não puder ser realizada dentro de 1–2 h, fixe as células com formalina tamponada neutra a 2,5% (preparada misturando formalina tamponada neutra a 10% com PBS na proporção de 1:3) e armazene a 4 ° C no escuro durante a noite para posterior ensaio do citômetro de fluxo.
7. Ajuste a tensão do citômetro de fluxo usando o grupo de etiquetas em branco para garantir que a autofluorescência da célula esteja dentro de aproximadamente 1/4–1/3 do eixo de coordenadas. Carregue sequencialmente as células do isotipo CD29, CD29, isotipo CD44, CD44, isotipo Sca-1, Sca-1, isotipo CD31, CD31, isotipo CD45 e grupos CD45. Defina a porta P1 (conforme definido no gráfico FSC/SSC) para capturar 10.000 células, rodando em velocidade média.
   NOTA: Certifique-se de que o citômetro de fluxo esteja equipado com os canais apropriados, como os comumente usados nos experimentos: FITC, PE, PerCp-Cy5.5, PE-Cy7 e APC, ou outros canais que correspondam a fluoresceínas acopladas a anticorpos.

8. Diferenciação osteogênica de BMSCs

1. Ressuspenda os grânulos P3 BMSC em meio αMEM completo, ajustando a concentração para 1 × 10⁵ células/mL.
2. Semeie BMSCs P3 em uma placa de cultura de células de 24 poços adicionando 1 mL de meio αMEM completo contendo 1 × 10⁵ células a cada poço.
3. Cultive os BMSCs P3 a 37 ° C em uma incubadora de CO_{5 2} a 5% por 3-5 dias até atingirem mais de 90% de confluência. Substitua o meio αMEM completo por meio novo a cada 2 dias.
4. Divida os diferentes poços igualmente em dois grupos: o grupo de controle negativo (sem indução de diferenciação osteogênica) e o grupo de diferenciação osteogênica
5. Prepare o meio de indução de diferenciação osteogênica suplementando o meio αMEM completo com 10 mmol / L β-glicerofosfato, 50 mg / L de ácido L-ascórbico e ^10-8 mol / L dexametasona.
6. Descarte o meio de cultura celular e lave os BMSCs P3 com 1 mL de PBS.
7. Adicionar o meio de indução de diferenciação osteogênica aos poços do grupo de diferenciação osteogênica para a indução de diferenciação osteogênica (1 mL/poço).
8. Adicione o meio αMEM completo aos poços do grupo controle (1 mL / poço).
9. Cultivar os BMSCs P3 a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5% por 7 ou 21 dias, substituindo o meio de indução de diferenciação osteogênica ou o meio αMEM completo pelo mesmo meio fresco a cada 3 dias.
   NOTA: Células com indução de 7 dias são usadas para a coloração de fosfatase alcalina (ALP). Células com indução de 21 dias são usadas para o ensaio S vermelho de alizarina.

9. Identificação de células osteogênicas diferenciadas com coloração ALP

1. Lave as células em cada poço da placa de 24 poços com 1 mL de PBS uma vez.
2. Fixe as células adicionando 0,5 mL de solução de formalina tamponada a 10% e incubando por 20 min.
3. Lave as células em cada poço novamente com 1 mL de PBS uma vez.
4. Adicione 0,5 mL de reagente de coloração de fosfatase alcalina 1-Step NBT/BCIP a cada poço e incube a 37 °C por 30 min com embalagem de papel alumínio para proteger da luz.
5. Descarte a solução, lave as células em cada poço com 1 mL de água destilada uma vez e deixe a placa secar.
6. Observe e adquira imagens de colônias coradas usando uma câmera para identificar células ALP-positivas com precipitado preto-púrpura.
   NOTA: O reagente de coloração de fosfatase alcalina (ALP) 1-Step NBT/BCIP produz um precipitado preto-púrpura forte e insolúvel após a reação com ALP, que pode ser facilmente visualizado.

10. Identificação de células osteogênicas diferenciadas pelo ensaio S do vermelho de alizarina

1. Lave as células em cada poço da placa de 24 poços com 1 mL de PBS uma vez.
2. Fixe as células adicionando 0,5 mL de solução de formalina tamponada a 10% e incubando por 20 min.
3. Lave as células em cada poço da placa de 24 poços com 1 mL de PBS uma vez.
4. Adicione 0,5 mL de vermelho de alizarina S a 0,1% em Tris-HCl 0,1 mol / L (pH 8,3) a cada poço e incube a 37 ° C por 30 a 60 min.
5. Descarte a solução, lave as células em cada poço com 1 mL de água destilada uma vez e deixe a placa secar.
6. Observe e adquira imagens de colônias coradas usando uma câmera para identificar células S-positivas vermelhas de alizarina.
   NOTA: O ensaio de S vermelho de alizarina para diferenciação de MSC em células ósseas mineralizadas maduras resulta na formação de um complexo S-cálcio vermelho de alizarina, que produz uma coloração vermelha brilhante que pode ser observada visualmente.

11. Preparação de meios de diferenciação de indução adipogênica A para BMSCs

NOTA: Para diferenciação de adipócitos de BMSCs, um Kit de Diferenciação Adipogênica de Células-Tronco Mesenquimais da Medula Óssea de Camundongo (consulte a Tabela de Materiais) é frequentemente usado de acordo com as diretrizes.

1. Coloque o soro fetal bovino (um componente do kit, conhecido como soro) na geladeira a 4 ° C por pelo menos 6 h antes do descongelamento completo.
2. Coloque o Suplemento A-I (componente do Kit) no frigorífico a 4° C pelo menos 30 min antes da preparação; coloque o suplemento A-II (componente do kit) em temperatura ambiente até descongelar completamente.
3. Inverta ou bata suavemente no tubo de reagente para misturar o conteúdo.
4. Centrifugue o tubo de reagente Suplemento A-II a 300 × g por 30 s em temperatura ambiente para garantir que o reagente se acumule na parte inferior para facilitar a recuperação.
5. Limpe bem a embalagem externa de todos os componentes com álcool medicinal 75% e abra-os em um armário de biossegurança.
6. Adicione soro, suplemento A-I e suplemento A-II no meio.
   NOTA: Para garantir a dissolução adequada, pré-aqueça o meio basal (um componente do kit) a 37 ° C, ou o suplemento A-II pode precipitar devido à exposição ao frio.
7. Use uma pequena quantidade de meio basal para enxaguar cada frasco e tubo, certificando-se de transferir todos os componentes para o meio basal.
8. Feche a tampa do frasco Basal Medium e agite suavemente para misturar bem.
9. Feche a garrafa com filme de parafina, embrulhe-a em papel alumínio e rotule-a com o nome, data de preparação e outros detalhes.

12. Preparação de meios de diferenciação de indução adipogênica B para BMSCs

1. Coloque o soro fetal bovino na geladeira a 4 ° C por pelo menos 6 h antes de descongelar completamente.
2. Coloque o suplemento B (um componente do kit) em uma geladeira a 4 ° C até que esteja completamente descongelado por pelo menos 30 minutos antes da preparação.
3. Inverta ou bata suavemente no tubo de reagente para misturar o conteúdo.
4. Centrifugue o tubo do Suplemento B para concentrar o reagente na parte inferior para facilitar a coleta.
5. Limpe bem a embalagem externa de todos os componentes com álcool medicinal 75% e abra-os em um armário de biossegurança.
6. Adicione soro e suplemento B ao meio basal.
7. Use uma pequena porção do meio basal para lavar cada frasco e tubo, garantindo que todos os componentes sejam totalmente transferidos para o meio.
8. Feche a tampa do frasco Basal Medium e agite suavemente para misturar bem.
9. Feche a garrafa com parafilme, embrulhe-a em papel alumínio e rotule-a com o nome, data de preparação e outros detalhes.

13. Diferenciação de adipócitos de BMSCs

1. Adicione 1 mL de gelatina a 0,1% em uma placa de seis poços, agitando-a para cobrir uniformemente o fundo de cada poço.
2. Coloque a placa de seis poços revestida com gelatina a 0,1% em uma coifa estéril ou incubadora de CO₂ por pelo menos 30 min.
3. Aspire a gelatina e a placa está pronta para a semeadura celular ou espere que os poços sequem antes de semear após 30 min.
4. Semeie os BMSCs P3 a uma densidade de 4 × 10⁴ células/^cm2 em cada poço da placa de seis poços, adicionando 2 mL de meio completo a cada poço.
5. Incubar as células a 37 °C em uma incubadora de CO₂ com 5% de CO₂ e umidade saturada.
6. Aspire o meio cuidadosamente e adicione 2 mL de meio de indução de diferenciação adipogênica A a cada poço quando as células atingirem 100% de confluência.
7. Aspire o meio A dos poços após 3 dias de indução e adicione 2 mL de meio de diferenciação adipogênica B.
8. Aspire o meio B após 1 dia e volte para o meio A para posterior indução.
9. Alterne entre os meios A e B e observe as células diariamente. Se ocorrer contração ou morte celular durante a indução com o meio A, mude para o meio B imediatamente.
10. Repita o processo de indução e manutenção até que apareça um número suficiente de gotículas lipídicas de tamanho apropriado e, em seguida, prepare-se para a coloração.

14. Coloração Oil Red O (ORO)

NOTA: Execute todos os procedimentos o mais suavemente possível para evitar o descolamento das gotículas lipídicas.

1. Aspire o meio de diferenciação de indução adipogênica da placa de 6 poços após a conclusão da diferenciação de indução adipogênica e lave suavemente com 1×PBS 2 a 3 vezes.
2. Adicione 2 mL de formalina tamponada neutra a 10% por poço e fixe por 20 min em temperatura ambiente.
3. Prepare a solução de trabalho Oil Red O misturando o estoque Oil Red O com água destilada na proporção de 3:2. Após a mistura, centrifugue a 250 × g durante 4 min e utilize o sobrenadante.
4. Aspire o fixador e lave suavemente com PBS 2 a 3 vezes, garantindo a remoção completa do fixador.
5. Adicione 0,8 mL de solução de coloração O vermelha a cada poço, deixe em temperatura ambiente por 30 min.
6. Aspire a solução do corante, lave duas vezes com 1 mL de etanol a 75%.
7. Adicione 1 mL de contracoloração de hematoxilina a cada poço por 2 min e, em seguida, aspire.
8. Adicione 2 mL de PBS a cada poço e observe os resultados da coloração adipogênica ao microscópio.
9. Selar a placa de seis poços corada com parafilme e conservar a 4 °C.
   NOTA: Não armazene por mais de 1 semana. As gotículas lipídicas podem se fundir, perdendo o estado de coloração.

Results

BMSCs derivadas de camundongos foram isoladas e cultivadas por aproximadamente 2 semanas para gerar as BMSCs da terceira passagem (P3) (Figura 3). Como mostrado na Figura 3A, as células recém-extraídas da medula óssea permaneceram mononucleares com gotículas de gordura visíveis. Células fusiformes apareceram na placa de cultura, atingindo uma confluência de 60% a 80% no^5º dia de cultura (Figura 3B<...

Discussion

A terapia com células-tronco atraiu um interesse considerável devido ao seu potencial para revolucionar a medicina regenerativa. Estudos pré-clínicos forneceram evidências substanciais que apoiam a aplicação clínica de células-tronco, particularmente BMSCs¹³. No entanto, desafios como baixo rendimento celular, contaminação e crescimento lento impediram sua aplicação clínica. Portanto, há uma necessidade urgente de pesquisas com foco na padronização dos processos d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringa de 1mL (agulha de seringa 22G)	GRUPO AMÁVEL (KDL)	60017031
NBT/BCIP de 1 Passo	Pierce Biotecnologia, Inc.	34042	Coloração de fosfatase alcalina
10% de formalina tamponada neutra	Wexis	5200250	fixação celular
Placa de 6 poços	Seleção de laboratório	11110	Cultura de células
Placa de 24 poços	Seleção de laboratório	11310	Cultura de células
40 μ Filtro de células m	Cornig	352340	Filtração para remoção de aglomerados
Seringa de 50 mL	GRUPO AMÁVEL (KDL)	60017040
75% de etanol	Biotecnologia Co. de Shanghai NianYue, Ltd	31009001	Desinfete a pele de camundongos
Vermelho de alizarina S	Sigma-Aldrich	Rolamento A5533	Detecção de depósitos de cálcio e nódulos calcificados
Anticorpo monoclonal APC CD44 (clone: IM7)	eBiociência	17-0441-82	Citometria de fluxo
Controle de isotipo APC Rat IgG2b kappa (clone: eB149 / 10H5)	eBiociência	17-4031-82	Citometria de fluxo
Autoclave	Japão Hiryama Empresa	HVE-50	Instrumentos cirúrgicos de esterilização
Incubadora CO2	Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.	300583057	Cultura de células
Fluxometria Cytoflex	Beckman Coulter	A00-1-1102	Citometria de fluxo
dexametasona	Sigma-Aldrich	D4902	Diferenciação osteogênica de BMSCs
Prato (100mm)	Corning	430167	Cultura de células
Prato (60mm)	Corning	430166	Amostra durante o transplante
Bolas de algodão desinfetante	Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd.	20230627	Desinfete a pele de camundongos
Luvas estéreis descartáveis	Xangai Honglong Industrial Co., Ltd	YT21131	Operação estéril
Dieta de roedores irradiados com leão duplo	Suzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd.	GB 14924.3	Alimentação animal
Soro Fetal Bovino	Xangai Biosun Sci & Fornecedor:Tech Co.,Ltd.	BS-0002-500	Cultura de células
FITC Hamster Anti-Rato CD29 (clone: Ha2/5)	BD Biociências	555003	Citometria de fluxo
FITC Hamster IgM, λ 1 Controle de Isotipo (clone:G235-1)	BD Biociências	553960	Citometria de fluxo
gelatina (0,1%)	OriCell	GLT-11301	aumentar a capacidade de adesão das células
gaiola de camundongos IVCs	Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.	HH-MMB-2	Barreira animal
Ácido L-ascórbico	Sigma-Aldrich	Rolamento A8960	Diferenciação osteogênica de BMSCs
Marcar caneta	Zebra Trading (Shenzhen) Co.,Ltd.	YYST5	Marque as informações do celular na placa de Petri
Modificação do MEM Alpha (1X)	Biotecnologia Co. de Shanghai NianYue, Ltd	SH30265	Cultura de células
Kit de diferenciação adipogênica de células-tronco mesenquimais da medula óssea de camundongo	Cyagen	MUXMX-90031	Diferenciação adipogênica de BMSCs
Nikon Eclipse Ti2 Microscópio Invertido Synstem	Japão Nikon Corporatin	Ti2-U	Observe as células e tire fotos
Tesoura oftálmica	Biotecnologia Co. de Shanghai NianYue, Ltd	Y00030 JZ	Corte a pele
Pinças oftálmicas	Biotecnologia Co. de Shanghai NianYue, Ltd	BS-ZER-S-100 Biosharp	Obtenha tecido ósseo de camundongo.
PIPETA PASTEUR	Biotecnologia Co. de Shanghai NianYue, Ltd	BS-XG-03M	Aspirar o meio de cultura
PE Rato Anti-Rato CD31 (clone: Ha2/5)	BD Biociências	553373	Citometria de fluxo
PE Rato IgG2a, κ Controle de isotipo (clone: R35-95)	BD Biociências	553930	Citometria de fluxo
PE-Cyanine7 Ly-6A/E (Sca-1) Anticorpo monoclonal (clone:D7)	eBiociência	25-5981-82	Citometria de fluxo
Controle de isotipo PE-Cyanine7 Rat IgG2a kappa (clone: eBR2a)	eBiociência	25-4321-82	Citometria de fluxo
Penicilina-estreptomicina	Biotecnologia Co. de Shanghai NianYue, Ltd	2585636	Cultura de células
PerCP-Cy5.5 Rato Anti-Rato CD45 (clone: Ha2/5)	BD Biociências	561869	Citometria de fluxo
PerCP-Cy5.5 Rato IgG2b, κ Controle de Isotipo (clone:A95-1)	BD Biociências	550764	Citometria de fluxo
Bisturis	Fábrica de Instrumentos Cirúrgicos oShanghai Dispositivos Médicos? Group?Co., Ltd.	J11010-10# JZ	Isole os membros posteriores e o tronco do camundongo e remova os tecidos estranhos do osso
Capuz estéril	Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.	ECO0.9	Mesa cirúrgica
campos cirúrgicos estéreis	Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd.	20160900	Fornecer área de cirurgia estéril
Tubo (50 mL)	Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.	BLD-BL2002500	Armazene a solução de célula filtrada
tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200056	digerir células aderentes
β-glicerofosfato	Sigma-Aldrich	G5422	Diferenciação osteogênica de BMSCs