O presente protocolo descreve um método econômico para purificar, expandir e caracterizar células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSCs) altamente homogêneas de camundongos. Essa abordagem facilita a aquisição de grandes quantidades de BMSCs com alto potencial de proliferação e diferenciação, apoiando modelos de camundongos e avançando na pesquisa pré-clínica.
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Artigo de método
Purificação, expansão e fenotipagem baseada em citometria de fluxo de células-tronco mesenquimais da medula óssea derivadas de camundongos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células-tronco mesenquimais (MSCs) são uma população de células-tronco que podem se auto-renovar e se diferenciar em múltiplas linhagens celulares. Entre eles, as MSCs encontradas na medula óssea, conhecidas como células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSCs), desempenham um papel crucial na osteogênese, suporte hematopoiético, homing / migração e imunossupressão. As BMSCs são amplamente utilizadas em pesquisas de biologia celular e engenharia de tecidos devido ao seu potencial para estratégias terapêuticas celulares, bem como sua fácil disponibilidade, estabilidade genética e baixa imunogenicidade. As células-tronco hematopoiéticas (HSCs) e BMSCs coexistem na medula óssea, mas possuem células progenitoras distintas. Ao extrair células da medula óssea, vários tipos de células são normalmente obtidos, o que pode levar à heterogeneidade na população de células, potencialmente causando viés e não atendendo a altos padrões experimentais. Portanto, é crucial desenvolver técnicas eficazes para melhorar a homogeneidade e o rendimento das BMSCs in vitro. Este estudo apresenta um protocolo detalhado para a purificação, expansão e fenotipagem baseada em citometria de fluxo de BMSCs obtidas de camundongos BALB/c. A homogeneidade e o fenótipo de células-tronco das BMSCs de terceira passagem foram caracterizados por citometria de fluxo, demonstrando positividade para CD29, CD44 e Sca-1, negatividade para CD45 e CD31 e confirmando sua capacidade de diferenciação osteogênica e adipogênica. Este protocolo econômico fornece um método fácil e eficiente para obter um número suficiente de BMSCs homogêneos com alto potencial de proliferação e diferenciação, o que é essencial para o avanço da pesquisa em modelos de camundongos e extensos estudos pré-clínicos.
Introdução
As células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSCs) são conhecidas por suas características multipotentes e são amplamente utilizadas no tratamento de várias doenças devido às suas propriedades auto-renováveis, diferenciadoras e imunomoduladoras 1,2. As BMSCs são facilmente obtidas, capazes de expansão extensa, exibem propriedades imunossupressoras e não desencadeiam reações imunes imediatas3, tornando-as atraentes para aplicações de engenharia de tecidos e transportadores eficazes para terapia celular.
Na medula óssea, duas populações principais de células-tronco e suas progênies, as células-tronco hematopoiéticas e as BMSCs, são os residentes primários4. Tradicionalmente, as BMSCs são obtidas por meio de aspiração direcionada da medula óssea e identificadas como células aderentes ao plástico in vitro. No entanto, esse método é insuficiente para diferenciar as BMSCs de outras subpopulações da medula óssea, incluindo células endoteliais, pericitos, leucócitos e células-tronco hematopoiéticas5. Portanto, é necessário um protocolo fácil e eficaz para isolamento de BMSCs.
O trabalho atual detalha a separação e purificação de BMSCs por meio de sua aderência física a placas de cultura de células plásticas. Experimentos de citometria de fluxo foram conduzidos em BMSCs de terceira passagem usando os marcadores de superfície CD29, CD44 e Sca-1, conforme descrito pelo comitê de células estromais mesenquimais (MSC) da Sociedade Internacional de Terapia Celular e Genética (ISCT)6. De acordo com os critérios do ISCT, as MSCs de camundongos são caracterizadas por positividade para CD29, CD44 e antígeno de células-tronco 1 (Sca-1) e negatividade para marcadores de células hematopoiéticas CD45 e marcadores de células endoteliais CD31. Além disso, as BMSCs devem ser multipotentes, demonstrando diferenciação de trilinhagem em osteoblastos, condrócitos e adipócitos. Neste experimento, a osteogênese foi induzida nas BMSCs extraídas, com coloração ALP realizada no dia 7 e um ensaio de S com vermelho de alizarina no dia 21 para avaliar a diferenciação. A diferenciação adipogênica de BMSCs isoladas e purificadas também foi induzida, com coloração Oil Red O realizada no dia 21 para avaliar a adipogênese.
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Protocolo
O manejo dos animais foi aprovado de acordo com as diretrizes de Ética em Animais de Laboratório (aprovação ética nº: PZSHUTCM2211070009) da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai. Camundongos BALB/c fêmeas de oito semanas de idade (grau SPF, 20 ± 1 g de peso corporal) foram usados neste estudo. Este protocolo descreve a purificação, passagem, fenotipagem baseada em citometria de fluxo e diferenciação osteogênica e adipogênica de BMSCs derivadas de camundongos. Os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Manipulação de animais
- Abrigar camundongos em condições específicas livres de patógenos (SPF) em gaiolas ventiladas individualmente, com cinco camundongos por gaiola. Forneça ração de qualidade SPF e água estéril. Mantenha um ciclo claro/escuro de 12 horas.
NOTA: Este método foi testado e considerado viável nas cepas de camundongo BALB/c e C57BL/6. Este artigo usa principalmente BALB/c como exemplo.
2. Colheita de fêmures e tíbias de membros posteriores de camundongos
- Eutanásia dos animais por asfixia por CO2 seguida de luxação cervical7 seguindo diretrizes éticas.
- Mergulhe os camundongos em etanol a 75% por 5 min (Figura 1A).
NOTA: As células-tronco foram colhidas dentro de 30 min2 após a eutanásia, e todo o processo, incluindo lavagem da medula, filtração e semeadura em placas de cultura, foi concluído em 2 h para garantir a viabilidade celular ideal.
NOTA: Use camundongos adultos (≥8 semanas de idade) para obter o rendimento ideal do BMSC; Ratos de 8 a 12 semanas são ideais8. - Faça uma incisão de cerca de 1 cm no membro posterior do tendão de Aquiles com tesoura de dissecção estéril (Figura 1B).
- Faça uma incisão circular ao redor do membro posterior do tendão de Aquiles com tesoura estéril para expor a tíbia distal (Figura 1C).
- Retire a pele da incisão em direção ao quadril para removê-la de ambos os membros posteriores (Figura 1D).
- Corte ao longo do osso ilíaco para separar a cabeça femoral do osso do quadril (Figura 2A).
NOTA: Evite danificar as articulações bilaterais do fêmur durante a dissecção para evitar a perda de medula óssea. - Coloque os fêmures e tíbias coletados em um prato de 60 mm contendo PBS pré-resfriado estéril contendo penicilina/estreptomicina a 2% (Figura 2B).
- Corte o máximo possível de tendão e músculo da tíbia e da fíbula usando um bisturi estéril para facilitar a lavagem posterior (Figura 2C).
- Retorne os ossos processados ao PBS contendo penicilina / estreptomicina a 2% e transfira-os para o capuz estéril para as etapas de isolamento subsequentes.
3. Purificação e cultura de BMSCs de camundongo
- Prepare o meio completo de modificação alfa MEM (αMEM) para cultura de BMSC suplementando αMEM com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina.
NOTA: Escolha o meio αMEM, pois contém 1000 mg / L de glicose, que é uma concentração relativamente baixa. Isso ajuda a prevenir a inibição da proliferação celular que pode ocorrer em ambientes com alto teor de glicose9 - Pegue uma seringa de 50 mL e coloque a agulha que acompanha a seringa.
- Aspire 20 mL de meio αMEM na seringa de 50 mL e, em seguida, substitua a agulha pela que vem com a seringa de 1 mL.
NOTA: Use uma agulha de seringa de 1 mL para acomodar o tamanho do osso e minimizar o dano celular. Uma seringa de 50 mL permite a lavagem eficiente da medula óssea com risco reduzido de contaminação celular por inserções repetidas. - Use uma tesoura para cortar ambas as extremidades do fêmur ou tíbia separados em um capuz estéril.
- Insira a agulha no osso ao longo da borda cortada e lave a medula óssea em uma placa de cultura de 100 mm contendo meio αMEM completo (Figura 2D).
- Lave as cavidades ósseas repetidamente até que os pedaços de osso pareçam pálidos para garantir que a maior parte da medula óssea tenha sido extraída (Figura 2E).
- Pipete para cima e para baixo 40 vezes suavemente com uma ponta de pipeta para dispersar as células agregadas o máximo possível.
- Filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 40 μm em um tubo de centrífuga de 50 mL para remover detritos, fragmentos de tecido e aglomerados não dispersos.
- Transferir a suspensão de células filtradas para uma placa de cultura de células de 100 mm e adicionar o meio αMEM completo a um volume final de 15 ml por placa.
NOTA: Cultive todas as células da medula óssea coletadas dos fêmures e tíbias de cada camundongo em uma placa de cultura de 100 mm para facilitar o crescimento celular. Com base em experimentos anteriores, aproximadamente 1 × 107 BMC pode ser isolado de um camundongo de 8 semanas de idade (de dois fêmures e duas tíbias). Essas células são semeadas em uma placa de cultura de 100 mm a uma densidade de 1,8 × 105 células/cm2 para cultura primária. - Segure o prato com as duas mãos e gire-o suavemente em um movimento em forma de oito 15 vezes para garantir uma distribuição uniforme das células pelo prato.
- Coloque a placa de cultura a 37 °C em uma incubadora de CO5% 2 e cultive por 5 dias (Figura 3A).
NOTA: Evite mover a placa de cultura durante este período para garantir um crescimento celular uniforme.
4. Substituição do meio αMEM para cultura BMSC
- Observe as células ao microscópio para determinar se atingiram 80% de confluência. Caso contrário, prossiga com a substituição do meio no5º dia.
- Retire 3 mL de PBS com uma pipeta Pasteur estéril e dispense-o de uma altura de 1 cm acima da placa de cultura em diferentes posições.
NOTA: Evite dispensar líquido em um lado do prato, pois isso pode remover as células aderentes devido à força de impacto excessiva e impedir a remoção eficaz de células indesejadas. - Depois de adicionar 3 mL de PBS, agite suavemente a placa de cultura para lavar bem as células e remova a PBS da placa com uma pipeta. Repita o processo de lavagem mais uma vez para garantir que as células sejam bem lavadas.
- Retire 15 ml de meio αMEM completo com uma pipeta Pasteur estéril e dispense-o a partir de 1 cm acima da placa de cultura em diferentes posições.
- Retorne a placa de cultura para a incubadora e monitore até que as células atinjam 80% de confluência antes da subcultura (Figura 3B).
5. Passagem de BMSCs
- Lave 80% das células confluentes duas vezes com PBS (Figura 3C).
NOTA: Lavar as células com PBS antes da digestão ajuda a remover o meio residual e as secreções celulares e reduz a adesão do MSC à placa de cultura. - Digerir as células com 1 ml de tripsina-EDTA a 0,25% incubando a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5% durante 2 a 3 min.
- Neutralize a tripsina adicionando 4 mL de meio αMEM completo à suspensão celular.
- Aspire a suspensão celular da placa de cultura usando uma ponta de pipeta de 1 mL e lave suavemente o fundo da placa para separar todas as células aderentes.
- Transfira a suspensão da célula para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugue a 300 × g por 5 min em temperatura ambiente.
- Use uma pipeta para descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 2 mL de meio αMEM completo.
NOTA: Para subcultivo, uma densidade de semeadura de aproximadamente 4 × 104 células / cm2 foi considerada ideal para crescimento e proliferação contínuos. - Divida as células na proporção de 1:1–1:2 em novas placas de cultura de células de 100 mm (isso constitui a1ª passagem, P1) (Figura 3D).
- Divida as células aproximadamente a cada três dias na proporção de 1:1,5 quando atingirem 80% de confluência para gerar a segunda passagem (P2) (Figura 3E) e a terceira passagem (P3) (Figura 3F) de BMSCs.
6. Preparação de BMSCs P3 para identificação fenotípica e diferenciação osteogênica
- Rejeitar o meio de cultura celular.
- Lave os BMSCs P3 com 3 mL de PBS duas vezes.
- Digerir os BMSCs P3 com 1 mL de tripsina-EDTA a 0,25% incubando a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5% por 2–3 min quando atingirem 80% de confluência.
- Neutralize a tripsina adicionando 4 mL de meio αMEM completo à suspensão celular.
- Transfira a suspensão da célula para um tubo de centrífuga de 15 mL, centrifugue a 300 × g por 5 min em temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
NOTA: Os pellets P3 BMSC preparados aqui serão usados para identificação fenotípica por citometria de fluxo e para avaliar a diferenciação osteogênica ou adipogênica.
7. Identificação fenotípica de BMSCs por citômetro de fluxo
- Ressuspenda os grânulos celulares de P3 BMSCs com 1,5 mL de solução de PBS contendo 2% de FBS e ajuste a concentração para 5 × 106 células / mL.
- Alíquota de 100 μL da suspensão celular em cada um dos 11 tubos para obter 5 × 105 células por tubo. Prepare os seguintes grupos: rótulo em branco, controle de isotipo CD29, CD29, controle de isotipo CD44, CD44, controle de isotipo Sca-1, Sca-1, controle de isotipo CD31, CD31, controle de isotipo CD45 e CD45.
NOTA: No presente estudo, foram utilizados os seguintes fluorocromos: CD29-FITC, CD29 isotipo-FITC, CD44-APC, CD44 isotipo-APC, Sca-1-PECy7, Sca-1 isotipo-PECy7, CD45-PerCPcy5.5, CD45 isotipo-PerCPcy5.5, CD31-PE e CD31 isotipo-PE (conforme mostrado na tabela de materiais). Esses fluorocromos podem ser modificados com base nas configurações de diferentes citômetros de fluxo. - Para cada grupo, adicionar os seguintes reagentes: 2 μL de PBS ao grupo de controlo do isotipo CD44, 2 μL de isotipo CD29 ao grupo de controlo do isotipo CD29 (diluição 1:50), 2 μL de CD29 ao grupo CD29 (diluição 1:50), 0,5 μL de isotipo CD44 ao grupo de controlo do isotipo CD44 (diluição 1:200), 0,5 μL de CD44 ao grupo CD44 (diluição 1:200), 0,5 μL de isotipo Sca-1 para o grupo controle do isotipo Sca-1 (diluição 1:200), 0,5 μL de Sca-1 para o grupo Sca-1 (diluição 1:200), 2 μL de isotipo CD31 para o grupo controle do isotipo CD31 (diluição 1:50), 2 μL de CD31 para o grupo CD31 (diluição 1:50), 2 μL de isotipo CD45 para o grupo controle do isotipo CD45 (diluição 1:50), e 2 μL de CD45 para o grupo CD45 (diluição 1:50).
NOTA: Os anticorpos foram usados de acordo com as recomendações otimizadas do fabricante para citometria de fluxo. Experimentos preliminares confirmaram a coloração e a especificidade ideais para as células-alvo. Consulte as diretrizes de dosagem do fabricante e realize pré-testes de titulação conforme necessário. - Misturar delicadamente, centrifugar com uma centrífuga de palma e incubar durante 30 min a 4 °C na obscuridade.
- Adicione 900 μL de PBS a cada tubo, misture invertendo e centrifugue a 300 × g por 5 min a 4 ° C. Descarte o sobrenadante para remover o excesso de anticorpos.
- Ressuspender o sedimento celular em cada tubo com 300 μL de PBS e analisar com um citómetro de fluxo.
NOTA: As células não precisam ser fixadas com formaldeído neutro a 2,5% se o ensaio do citômetro de fluxo puder ser concluído em 1–2 h. Se a análise não puder ser realizada dentro de 1–2 h, fixe as células com formalina tamponada neutra a 2,5% (preparada misturando formalina tamponada neutra a 10% com PBS na proporção de 1:3) e armazene a 4 ° C no escuro durante a noite para posterior ensaio do citômetro de fluxo. - Ajuste a tensão do citômetro de fluxo usando o grupo de etiquetas em branco para garantir que a autofluorescência da célula esteja dentro de aproximadamente 1/4–1/3 do eixo de coordenadas. Carregue sequencialmente as células do isotipo CD29, CD29, isotipo CD44, CD44, isotipo Sca-1, Sca-1, isotipo CD31, CD31, isotipo CD45 e grupos CD45. Defina a porta P1 (conforme definido no gráfico FSC/SSC) para capturar 10.000 células, rodando em velocidade média.
NOTA: Certifique-se de que o citômetro de fluxo esteja equipado com os canais apropriados, como os comumente usados nos experimentos: FITC, PE, PerCp-Cy5.5, PE-Cy7 e APC, ou outros canais que correspondam a fluoresceínas acopladas a anticorpos.
8. Diferenciação osteogênica de BMSCs
- Ressuspenda os grânulos P3 BMSC em meio αMEM completo, ajustando a concentração para 1 × 105 células/mL.
- Semeie BMSCs P3 em uma placa de cultura de células de 24 poços adicionando 1 mL de meio αMEM completo contendo 1 × 105 células a cada poço.
- Cultive os BMSCs P3 a 37 ° C em uma incubadora de CO5 2 a 5% por 3-5 dias até atingirem mais de 90% de confluência. Substitua o meio αMEM completo por meio novo a cada 2 dias.
- Divida os diferentes poços igualmente em dois grupos: o grupo de controle negativo (sem indução de diferenciação osteogênica) e o grupo de diferenciação osteogênica
- Prepare o meio de indução de diferenciação osteogênica suplementando o meio αMEM completo com 10 mmol / L β-glicerofosfato, 50 mg / L de ácido L-ascórbico e 10-8 mol / L dexametasona.
- Descarte o meio de cultura celular e lave os BMSCs P3 com 1 mL de PBS.
- Adicionar o meio de indução de diferenciação osteogênica aos poços do grupo de diferenciação osteogênica para a indução de diferenciação osteogênica (1 mL/poço).
- Adicione o meio αMEM completo aos poços do grupo controle (1 mL / poço).
- Cultivar os BMSCs P3 a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5% por 7 ou 21 dias, substituindo o meio de indução de diferenciação osteogênica ou o meio αMEM completo pelo mesmo meio fresco a cada 3 dias.
NOTA: Células com indução de 7 dias são usadas para a coloração de fosfatase alcalina (ALP). Células com indução de 21 dias são usadas para o ensaio S vermelho de alizarina.
9. Identificação de células osteogênicas diferenciadas com coloração ALP
- Lave as células em cada poço da placa de 24 poços com 1 mL de PBS uma vez.
- Fixe as células adicionando 0,5 mL de solução de formalina tamponada a 10% e incubando por 20 min.
- Lave as células em cada poço novamente com 1 mL de PBS uma vez.
- Adicione 0,5 mL de reagente de coloração de fosfatase alcalina 1-Step NBT/BCIP a cada poço e incube a 37 °C por 30 min com embalagem de papel alumínio para proteger da luz.
- Descarte a solução, lave as células em cada poço com 1 mL de água destilada uma vez e deixe a placa secar.
- Observe e adquira imagens de colônias coradas usando uma câmera para identificar células ALP-positivas com precipitado preto-púrpura.
NOTA: O reagente de coloração de fosfatase alcalina (ALP) 1-Step NBT/BCIP produz um precipitado preto-púrpura forte e insolúvel após a reação com ALP, que pode ser facilmente visualizado.
10. Identificação de células osteogênicas diferenciadas pelo ensaio S do vermelho de alizarina
- Lave as células em cada poço da placa de 24 poços com 1 mL de PBS uma vez.
- Fixe as células adicionando 0,5 mL de solução de formalina tamponada a 10% e incubando por 20 min.
- Lave as células em cada poço da placa de 24 poços com 1 mL de PBS uma vez.
- Adicione 0,5 mL de vermelho de alizarina S a 0,1% em Tris-HCl 0,1 mol / L (pH 8,3) a cada poço e incube a 37 ° C por 30 a 60 min.
- Descarte a solução, lave as células em cada poço com 1 mL de água destilada uma vez e deixe a placa secar.
- Observe e adquira imagens de colônias coradas usando uma câmera para identificar células S-positivas vermelhas de alizarina.
NOTA: O ensaio de S vermelho de alizarina para diferenciação de MSC em células ósseas mineralizadas maduras resulta na formação de um complexo S-cálcio vermelho de alizarina, que produz uma coloração vermelha brilhante que pode ser observada visualmente.
11. Preparação de meios de diferenciação de indução adipogênica A para BMSCs
NOTA: Para diferenciação de adipócitos de BMSCs, um Kit de Diferenciação Adipogênica de Células-Tronco Mesenquimais da Medula Óssea de Camundongo (consulte a Tabela de Materiais) é frequentemente usado de acordo com as diretrizes.
- Coloque o soro fetal bovino (um componente do kit, conhecido como soro) na geladeira a 4 ° C por pelo menos 6 h antes do descongelamento completo.
- Coloque o Suplemento A-I (componente do Kit) no frigorífico a 4° C pelo menos 30 min antes da preparação; coloque o suplemento A-II (componente do kit) em temperatura ambiente até descongelar completamente.
- Inverta ou bata suavemente no tubo de reagente para misturar o conteúdo.
- Centrifugue o tubo de reagente Suplemento A-II a 300 × g por 30 s em temperatura ambiente para garantir que o reagente se acumule na parte inferior para facilitar a recuperação.
- Limpe bem a embalagem externa de todos os componentes com álcool medicinal 75% e abra-os em um armário de biossegurança.
- Adicione soro, suplemento A-I e suplemento A-II no meio.
NOTA: Para garantir a dissolução adequada, pré-aqueça o meio basal (um componente do kit) a 37 ° C, ou o suplemento A-II pode precipitar devido à exposição ao frio. - Use uma pequena quantidade de meio basal para enxaguar cada frasco e tubo, certificando-se de transferir todos os componentes para o meio basal.
- Feche a tampa do frasco Basal Medium e agite suavemente para misturar bem.
- Feche a garrafa com filme de parafina, embrulhe-a em papel alumínio e rotule-a com o nome, data de preparação e outros detalhes.
12. Preparação de meios de diferenciação de indução adipogênica B para BMSCs
- Coloque o soro fetal bovino na geladeira a 4 ° C por pelo menos 6 h antes de descongelar completamente.
- Coloque o suplemento B (um componente do kit) em uma geladeira a 4 ° C até que esteja completamente descongelado por pelo menos 30 minutos antes da preparação.
- Inverta ou bata suavemente no tubo de reagente para misturar o conteúdo.
- Centrifugue o tubo do Suplemento B para concentrar o reagente na parte inferior para facilitar a coleta.
- Limpe bem a embalagem externa de todos os componentes com álcool medicinal 75% e abra-os em um armário de biossegurança.
- Adicione soro e suplemento B ao meio basal.
- Use uma pequena porção do meio basal para lavar cada frasco e tubo, garantindo que todos os componentes sejam totalmente transferidos para o meio.
- Feche a tampa do frasco Basal Medium e agite suavemente para misturar bem.
- Feche a garrafa com parafilme, embrulhe-a em papel alumínio e rotule-a com o nome, data de preparação e outros detalhes.
13. Diferenciação de adipócitos de BMSCs
- Adicione 1 mL de gelatina a 0,1% em uma placa de seis poços, agitando-a para cobrir uniformemente o fundo de cada poço.
- Coloque a placa de seis poços revestida com gelatina a 0,1% em uma coifa estéril ou incubadora de CO2 por pelo menos 30 min.
- Aspire a gelatina e a placa está pronta para a semeadura celular ou espere que os poços sequem antes de semear após 30 min.
- Semeie os BMSCs P3 a uma densidade de 4 × 104 células/cm2 em cada poço da placa de seis poços, adicionando 2 mL de meio completo a cada poço.
- Incubar as células a 37 °C em uma incubadora de CO2 com 5% de CO2 e umidade saturada.
- Aspire o meio cuidadosamente e adicione 2 mL de meio de indução de diferenciação adipogênica A a cada poço quando as células atingirem 100% de confluência.
- Aspire o meio A dos poços após 3 dias de indução e adicione 2 mL de meio de diferenciação adipogênica B.
- Aspire o meio B após 1 dia e volte para o meio A para posterior indução.
- Alterne entre os meios A e B e observe as células diariamente. Se ocorrer contração ou morte celular durante a indução com o meio A, mude para o meio B imediatamente.
- Repita o processo de indução e manutenção até que apareça um número suficiente de gotículas lipídicas de tamanho apropriado e, em seguida, prepare-se para a coloração.
14. Coloração Oil Red O (ORO)
NOTA: Execute todos os procedimentos o mais suavemente possível para evitar o descolamento das gotículas lipídicas.
- Aspire o meio de diferenciação de indução adipogênica da placa de 6 poços após a conclusão da diferenciação de indução adipogênica e lave suavemente com 1×PBS 2 a 3 vezes.
- Adicione 2 mL de formalina tamponada neutra a 10% por poço e fixe por 20 min em temperatura ambiente.
- Prepare a solução de trabalho Oil Red O misturando o estoque Oil Red O com água destilada na proporção de 3:2. Após a mistura, centrifugue a 250 × g durante 4 min e utilize o sobrenadante.
- Aspire o fixador e lave suavemente com PBS 2 a 3 vezes, garantindo a remoção completa do fixador.
- Adicione 0,8 mL de solução de coloração O vermelha a cada poço, deixe em temperatura ambiente por 30 min.
- Aspire a solução do corante, lave duas vezes com 1 mL de etanol a 75%.
- Adicione 1 mL de contracoloração de hematoxilina a cada poço por 2 min e, em seguida, aspire.
- Adicione 2 mL de PBS a cada poço e observe os resultados da coloração adipogênica ao microscópio.
- Selar a placa de seis poços corada com parafilme e conservar a 4 °C.
NOTA: Não armazene por mais de 1 semana. As gotículas lipídicas podem se fundir, perdendo o estado de coloração.
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Resultados
BMSCs derivadas de camundongos foram isoladas e cultivadas por aproximadamente 2 semanas para gerar as BMSCs da terceira passagem (P3) (Figura 3). Como mostrado na Figura 3A, as células recém-extraídas da medula óssea permaneceram mononucleares com gotículas de gordura visíveis. Células fusiformes apareceram na placa de cultura, atingindo uma confluência de 60% a 80% no5º dia de cultura (Figura 3B<...
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Discussão
A terapia com células-tronco atraiu um interesse considerável devido ao seu potencial para revolucionar a medicina regenerativa. Estudos pré-clínicos forneceram evidências substanciais que apoiam a aplicação clínica de células-tronco, particularmente BMSCs13. No entanto, desafios como baixo rendimento celular, contaminação e crescimento lento impediram sua aplicação clínica. Portanto, há uma necessidade urgente de pesquisas com foco na padronização dos processos d...
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse em relação a este estudo.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por doações do Programa Nacional de P&D da China (2020YFE0201600) e da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82174408 e 82374477).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringa de 1mL (agulha de seringa 22G) | GRUPO AMÁVEL (KDL) | 60017031 | |
| NBT/BCIP de 1 Passo | Pierce Biotecnologia, Inc. | 34042 | Coloração de fosfatase alcalina |
| 10% de formalina tamponada neutra | Wexis | 5200250 | fixação celular |
| Placa de 6 poços | Seleção de laboratório | 11110 | Cultura de células |
| Placa de 24 poços | Seleção de laboratório | 11310 | Cultura de células |
| 40 μ Filtro de células m | Cornig | 352340 | Filtração para remoção de aglomerados |
| Seringa de 50 mL | GRUPO AMÁVEL (KDL) | 60017040 | |
| 75% de etanol | Biotecnologia Co. de Shanghai NianYue, Ltd | 31009001 | Desinfete a pele de camundongos |
| Vermelho de alizarina S | Sigma-Aldrich | Rolamento A5533 | Detecção de depósitos de cálcio e nódulos calcificados |
| Anticorpo monoclonal APC CD44 (clone: IM7) | eBiociência | 17-0441-82 | Citometria de fluxo |
| Controle de isotipo APC Rat IgG2b kappa (clone: eB149 / 10H5) | eBiociência | 17-4031-82 | Citometria de fluxo |
| Autoclave | Japão Hiryama Empresa | HVE-50 | Instrumentos cirúrgicos de esterilização |
| Incubadora CO2 | Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd. | 300583057 | Cultura de células |
| Fluxometria Cytoflex | Beckman Coulter | A00-1-1102 | Citometria de fluxo |
| dexametasona | Sigma-Aldrich | D4902 | Diferenciação osteogênica de BMSCs |
| Prato (100mm) | Corning | 430167 | Cultura de células |
| Prato (60mm) | Corning | 430166 | Amostra durante o transplante |
| Bolas de algodão desinfetante | Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd. | 20230627 | Desinfete a pele de camundongos |
| Luvas estéreis descartáveis | Xangai Honglong Industrial Co., Ltd | YT21131 | Operação estéril |
| Dieta de roedores irradiados com leão duplo | Suzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd. | GB 14924.3 | Alimentação animal |
| Soro Fetal Bovino | Xangai Biosun Sci & Fornecedor:Tech Co.,Ltd. | BS-0002-500 | Cultura de células |
| FITC Hamster Anti-Rato CD29 (clone: Ha2/5) | BD Biociências | 555003 | Citometria de fluxo |
| FITC Hamster IgM, λ 1 Controle de Isotipo (clone:G235-1) | BD Biociências | 553960 | Citometria de fluxo |
| gelatina (0,1%) | OriCell | GLT-11301 | aumentar a capacidade de adesão das células |
| gaiola de camundongos IVCs | Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd. | HH-MMB-2 | Barreira animal |
| Ácido L-ascórbico | Sigma-Aldrich | Rolamento A8960 | Diferenciação osteogênica de BMSCs |
| Marcar caneta | Zebra Trading (Shenzhen) Co.,Ltd. | YYST5 | Marque as informações do celular na placa de Petri |
| Modificação do MEM Alpha (1X) | Biotecnologia Co. de Shanghai NianYue, Ltd | SH30265 | Cultura de células |
| Kit de diferenciação adipogênica de células-tronco mesenquimais da medula óssea de camundongo | Cyagen | MUXMX-90031 | Diferenciação adipogênica de BMSCs |
| Nikon Eclipse Ti2 Microscópio Invertido Synstem | Japão Nikon Corporatin | Ti2-U | Observe as células e tire fotos |
| Tesoura oftálmica | Biotecnologia Co. de Shanghai NianYue, Ltd | Y00030 JZ | Corte a pele |
| Pinças oftálmicas | Biotecnologia Co. de Shanghai NianYue, Ltd | BS-ZER-S-100 Biosharp | Obtenha tecido ósseo de camundongo. |
| PIPETA PASTEUR | Biotecnologia Co. de Shanghai NianYue, Ltd | BS-XG-03M | Aspirar o meio de cultura |
| PE Rato Anti-Rato CD31 (clone: Ha2/5) | BD Biociências | 553373 | Citometria de fluxo |
| PE Rato IgG2a, κ Controle de isotipo (clone: R35-95) | BD Biociências | 553930 | Citometria de fluxo |
| PE-Cyanine7 Ly-6A/E (Sca-1) Anticorpo monoclonal (clone:D7) | eBiociência | 25-5981-82 | Citometria de fluxo |
| Controle de isotipo PE-Cyanine7 Rat IgG2a kappa (clone: eBR2a) | eBiociência | 25-4321-82 | Citometria de fluxo |
| Penicilina-estreptomicina | Biotecnologia Co. de Shanghai NianYue, Ltd | 2585636 | Cultura de células |
| PerCP-Cy5.5 Rato Anti-Rato CD45 (clone: Ha2/5) | BD Biociências | 561869 | Citometria de fluxo |
| PerCP-Cy5.5 Rato IgG2b, κ Controle de Isotipo (clone:A95-1) | BD Biociências | 550764 | Citometria de fluxo |
| Bisturis | Fábrica de Instrumentos Cirúrgicos oShanghai Dispositivos Médicos? Group?Co., Ltd. | J11010-10# JZ | Isole os membros posteriores e o tronco do camundongo e remova os tecidos estranhos do osso |
| Capuz estéril | Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd. | ECO0.9 | Mesa cirúrgica |
| campos cirúrgicos estéreis | Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd. | 20160900 | Fornecer área de cirurgia estéril |
| Tubo (50 mL) | Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd. | BLD-BL2002500 | Armazene a solução de célula filtrada |
| tripsina-EDTA (0,25%) | Gibco | 25200056 | digerir células aderentes |
| β-glicerofosfato | Sigma-Aldrich | G5422 | Diferenciação osteogênica de BMSCs |
Referências
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- Papaccio, F., et al. Concise review: Cancer cells, cancer stem cells, and mesenchymal stem cells: Influence in cancer development. Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2115-2125 (2017).
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