Este protocolo descreve um método para enxertar um cordão magnético no coração do peixe-zebra em desenvolvimento por meio de microcirurgia, permitindo a manipulação de forças mecânicas in vivo e desencadeando o influxo de cálcio dependente de estímulo mecânico nas células endocárdicas.
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Artigo de método
Manipulando forças mecânicas no coração do peixe-zebra em desenvolvimento usando contas magnéticas
Neste artigo
Resumo
Resumo
As forças mecânicas fornecem continuamente feedback aos programas morfogenéticos das válvulas cardíacas. No peixe-zebra, o desenvolvimento da válvula cardíaca depende da contração cardíaca e dos estímulos físicos gerados pelo coração batendo. A hemodinâmica intracardíaca, impulsionada pelo fluxo sanguíneo, surge como informação fundamental que molda o desenvolvimento do coração embrionário. Aqui, descrevemos um método eficaz para manipular forças mecânicas in vivo enxertando um cordão magnético de 30 μm a 60 μm de diâmetro no lúmen cardíaco. A inserção do cordão é realizada por meio de microcirurgia em larvas anestesiadas sem perturbar a função cardíaca e permite a alteração artificial das condições de contorno, modificando assim as forças de fluxo no sistema. Como resultado, a presença do grânulo amplifica as forças mecânicas experimentadas pelas células endocárdicas e pode desencadear diretamente o influxo de cálcio dependente de estímulo mecânico. Essa abordagem facilita a investigação das vias de mecanotransdução que governam o desenvolvimento do coração e pode fornecer informações sobre o papel das forças mecânicas na morfogênese da válvula cardíaca.
Introdução
Desde sua introdução no finalda década de 1970, o peixe-zebra (Danio rerio) emergiu como um poderoso sistema modelo para estudar os meandros do desenvolvimento cardíaco e distúrbios cardíacos congênitos. Ao contrário da maioria dos vertebrados, incluindo embriões de camundongos e pintinhos, que dependem de um sistema cardiovascular funcional e não podem sobreviver a defeitos cardíacos precoces, o peixe-zebra oferece uma vantagem única, permitindo a investigação de fenótipos cardíacos graves. Isso se deve ao seu pequeno tamanho, que facilita o fornecimento suficiente de oxigênio por meio da difusão passiva, permitindo a sobrevida mesmo na ausência de contração cardíaca e circulação sanguínea ativa 2,3,4. Além disso, entre as muitas características significativas do peixe-zebra está a transparência óptica de seus embriões, o que permite o monitoramento não invasivo do coração em desenvolvimento 5,6,7,8.
As forças mecânicas fornecem continuamente feedback aos programas morfogenéticos da válvula cardíaca 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 , e o fluxo sanguíneo aberrante é amplamente reconhecido como um fator compartilhado em vários distúrbios cardiovasculares23,24. No peixe-zebra, o desenvolvimento da válvula cardíaca depende da contração do coração e das forças mecânicas geradas pelo coração batendo. Múltiplos mutantes do peixe-zebra demonstraram a importância dos estímulos mecânicos gerados pelo coração na valvulogênese. Notavelmente, a completa ausência de contração cardíaca e, conseqüentemente, fluxo sanguíneo devido a mutações da troponina T cardíaca (tnnt2) em mutantes cardíacos silenciosos (sih) resulta na ausência de convergência tecidual e agrupamento de células endocárdicas (EdC) durante os estágios morfogenéticos iniciais25.
A hemodinâmica intracardíaca e as forças mecânicas geradas pelo fluxo sanguíneo emergem como componentes epigenéticos fundamentais que moldam o desenvolvimento do coração embrionário do peixe-zebra. Numerosos estudos sugerem que a morfogênese cardíaca adequada no peixe-zebra requer estímulos de fluxo distintos, e desvios desses padrões fisiológicos levam a defeitos valvares cardíacos 10,13,14,22,26. Aqui, descrevemos um método eficaz, adaptado de Fukui et al.13, para manipular forças mecânicas in vivo enxertando um cordão magnético de 30 μm a 60 μm de diâmetro dentro do coração batendo do peixe-zebra em desenvolvimento. A técnica envolve a inserção microcirúrgica de uma conta no lúmen cardíaco de larvas anestesiadas sem perturbar a função cardíaca. A presença do cordão leva à amplificação das forças mecânicas experimentadas pelos EdCs, desencadeando diretamente o influxo de cálcio dependente de estímulo mecânico13. Essa abordagem permite a investigação das vias de mecanotransdução que regulam a morfogênese do coração e oferece um meio de aprofundar nossa compreensão do papel das forças mecânicas na formação da válvula.
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Protocolo
Os procedimentos para trabalhar com embriões de peixe-zebra descritos neste protocolo seguem a diretiva europeia 2010/63/UE e as diretrizes do Ministério do Interior sob a licença do projeto PP6020928.
1. Obtenção de embriões de peixe-zebra para enxertia de contas
- Cruze a linha de peixe-zebra relevante e cultive os embriões no meio de Danieau a 28,5 °C. Para obter instruções mais detalhadas sobre como cruzar as linhas de peixe-zebra, consulte o Banco de Dados de Educação CientíficaJoVE 27.
- Trate os embriões com 1-fenil-2-tioureia (PTU) a partir de 24 h após a fertilização (hpf) para inibir a formação de pigmentos, usando uma concentração de 0,003% PTU no meio de Danieau.
- Se estiver usando uma linha marcada com fluorescência, examine os embriões sob um estereoscópio de fluorescência antes de iniciar o enxerto de esferas e selecione de 10 a 20 embriões saudáveis que exibam fluorescência brilhante. Descorione suavemente os embriões pré-selecionados sob o estereomicroscópio usando uma pinça, garantindo que os embriões não sejam danificados.
2. Montagem de embriões de peixe-zebra
- Prepare 20 mL de meio de Danieau contendo 0,02% de tricaína.
- Prepare alíquotas de 2 mL de agarose de baixo ponto de fusão a 1% (LMP) contendo 0,02% de tricaína em tubos de microcentrífuga de 2 mL. Coloque os tubos em um bloco de calor de 38 °C para manter a agarose LMP em estado líquido.
NOTA: A agarose LMP a 1% pode ser preparada com antecedência para uso no dia da montagem e enxerto de contas. - Transfira 3-6 embriões descorionados para uma placa de Petri contendo meio de Danieau suplementado com 0,02% de tricaína.
- Quando os embriões estiverem anestesiados, transfira-os para uma placa de fundo de vidro de 35 mm x 15 mm com o mínimo de meio. Adicione rapidamente 300-400 μL de agarose LMP a 1% contendo tricaína para criar uma cúpula. Com o uso de uma pinça, posicione os embriões de forma que fiquem retos, em contato com o vidro, com o lado ventral voltado para cima, conforme mostrado na Figura 1. Aguarde ~ 4 min para que a agarose solidifique.
NOTA: A quantidade de agarose usada para montar embriões é muito importante. Procure uma cúpula de aproximadamente 350 μL, que deve fornecer cobertura suficiente, deixando alguns milímetros de espaço acima dos embriões. Para iniciantes, montar um número menor de embriões por vez pode ser uma abordagem mais segura.
3. Enxerto de grânulos
- Assim que a agarose estiver solidificada, deposite aproximadamente 0,5 μL de esferas magnéticas por cima.
NOTA: Use uma ponta de pipeta de 10 μL para transferir as esferas magnéticas. A medição precisa de 0,5 μL não é necessária, pois os grânulos são altamente concentrados na suspensão. Simplesmente inserir a ponta no frasco depois de girar para baixo será suficiente para coletar uma quantidade adequada de contas. - Adicione uma gota do meio de Danieau contendo 0,02% de tricaína por cima da agarose e das contas.
- Selecione o cordão apropriado.
NOTA: Esta etapa é crítica. O tamanho das contas pode variar ligeiramente, variando de 30 μm a 60 μm de diâmetro, portanto, é essencial selecionar a conta apropriada a olho nu, com base na amostra e no tamanho do coração. - Uma vez selecionada a conta adequada, use uma pinça para colocá-la em cima da gema (Figura 2A e Vídeo 1).
- Crie uma lesão ou 'buraco' na gema no centro da gema usando um braço da pinça (Figura 2B e Vídeo 2).
NOTA: A profundidade da lesão não deve penetrar muito profundamente na gema; deve estar aproximadamente nivelado com a veia cardinal. O diâmetro do orifício criado corresponderá à ponta do braço da pinça. Certifique-se de que a lesão seja feita na gema e evite entrar em contato com as veias cardinais mirando abaixo delas. Uma pequena quantidade de gema normalmente sai quando o buraco é criado. - Coloque o cordão na lesão criada na etapa 3.5 e empurre-o suavemente anteriormente até atingir o pólo venoso. Lá, as contrações cardíacas criarão sucção, atraindo a conta para o lúmen cardíaco (Figura 2 e Vídeo 2).
NOTA: A parede venosa é rompida durante a inserção do grânulo, e a alta densidade da gema ajuda a minimizar o sangramento extenso. A lesão da gema geralmente cicatriza alguns minutos após a inserção do grânulo. Alguns embriões podem apresentar edema pericárdico 20-24 h após o enxerto de esferas.
4. Desmontagem de embriões de peixe-zebra
- Depois de enxertar esferas magnéticas em todos os embriões montados, adicione 1-2 mL do meio de Danieau contendo PTU no prato com fundo de vidro.
- Usando uma pinça, quebre suavemente a agarose LMP e remova cuidadosamente os peixes, garantindo que nenhuma agarose seja deixada neles.
- Usando uma pipeta Pasteur, transferir os embriões para uma nova placa de Petri contendo o meio de Danieau com PTU e permitir que eles se recuperem e se desenvolvam a 28,5 °C.
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Resultados
Exemplos de enxerto de esferas bem-sucedido são mostrados na Figura 3, Vídeo 3 e Vídeo 4. A conta magnética foi posicionada corretamente dentro do átrio do coração do peixe-zebra, permitindo fluxo sanguíneo desobstruído e nenhuma hemorragia observada. Além disso, as paredes do coração mantiveram sua integridade estrutural sem colapso (Figura 3 e Vídeo 3). Após 24 h, o embrião não apresentou sinais de edema peric...
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Discussão
Etapas críticas no protocolo e solução de problemas
Montagem de embriões de peixe-zebra
A quantidade de agarose usada para montar os embriões é importante. A cúpula formada não deve ser excessivamente grande, pois isso pode dificultar a manipulação do cordão da superfície para os embriões. Por outro lado, não deve ser muito pequeno; Ter várias contas em cima da agarose, posicionadas perto d...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros do laboratório Vermot pelas discussões e comentários sobre o protocolo. Somos gratos a todos os funcionários da instalação de peixes do Imperial College London. Este projeto recebeu financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC) no âmbito do programa de pesquisa e inovação Horizonte 2020 da União Europeia: GA N°682939, Additional Ventures (número de prêmio 1019496), MRC (MR/X019837/1) e BBSRC (BB/Y00566X/1). O CV-P foi apoiado por uma bolsa de estudos do Departamento de Bioengenharia (Imperial College London). A HF foi apoiada pela JSPS KAKENHI (23H04726 e 24K02207), pelo programa JST FOREST (23719210), pela Uehara Memorial Foundation, pela Cell Science Research Foundation, pela Takeda Medical Research Foundation e pela Novartis Research Foundation.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Materiais | |||
| Equipamento essencial para criação, reprodução e coleta | |||
| de peixe-zebra Prato com fundo de vidro (35 mm x 15 mm) | VWR International | 734-2905 | |
| Bloco de calor | Eppendorf | EP5382000031 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Pinça de joalheiro | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | Dumont No. 5, L 4 1/4 pol., Tubos de microcentrífuga de liga de inox |
| 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
| Pasteur pipeta | |||
| Placa | de Petri | ||
| Estereomicroscópio< | |||
| forte>Reagentes | |||
| 4 mg/mL solução estoque | |||
| Meio de Danieau (solução estoque 60x) | |||
| PureCube Glutathione MagBeads | Cube Biotech | 32201 | |
| PTU (1-fenil-2-tioureia) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| UltraPure baixo ponto de fusão agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| meio de Danieau (solução estoque 60x) | |||
| 34,8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| 1,6 g KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 5,8 g CaCl2· 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| 9.78 g MgCl2· 6H2O | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| Dissolva os ingredientes em H2O até um volume final de 2 L. Ajuste o pH para 7,2 usando NaOH e, em seguida, autoclave. | |||
| 4 mg/mL de solução estoque de tricaína | |||
| 400 mg de pó de tricaína (sal de metanossulfonato de etilo 3-aminobenzoato) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 97,9 mL de H2O biddestilado 2,1 | |||
| mL 1 M Tris (pH 9) | |||
| Ajuste o pH para 7, depois alíquota e armazene a -20 °C. |
Referências
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Reimpressões e permissões
