Manipulando forças mecânicas no coração do peixe-zebra em desenvolvimento usando contas magnéticas

Summary

Este protocolo descreve um método para enxertar um cordão magnético no coração do peixe-zebra em desenvolvimento por meio de microcirurgia, permitindo a manipulação de forças mecânicas in vivo e desencadeando o influxo de cálcio dependente de estímulo mecânico nas células endocárdicas.

Abstract

As forças mecânicas fornecem continuamente feedback aos programas morfogenéticos das válvulas cardíacas. No peixe-zebra, o desenvolvimento da válvula cardíaca depende da contração cardíaca e dos estímulos físicos gerados pelo coração batendo. A hemodinâmica intracardíaca, impulsionada pelo fluxo sanguíneo, surge como informação fundamental que molda o desenvolvimento do coração embrionário. Aqui, descrevemos um método eficaz para manipular forças mecânicas in vivo enxertando um cordão magnético de 30 μm a 60 μm de diâmetro no lúmen cardíaco. A inserção do cordão é realizada por meio de microcirurgia em larvas anestesiadas sem perturbar a função cardíaca e permite a alteração artificial das condições de contorno, modificando assim as forças de fluxo no sistema. Como resultado, a presença do grânulo amplifica as forças mecânicas experimentadas pelas células endocárdicas e pode desencadear diretamente o influxo de cálcio dependente de estímulo mecânico. Essa abordagem facilita a investigação das vias de mecanotransdução que governam o desenvolvimento do coração e pode fornecer informações sobre o papel das forças mecânicas na morfogênese da válvula cardíaca.

Introduction

Desde sua introdução no final^{da década de} 1970, o peixe-zebra (Danio rerio) emergiu como um poderoso sistema modelo para estudar os meandros do desenvolvimento cardíaco e distúrbios cardíacos congênitos. Ao contrário da maioria dos vertebrados, incluindo embriões de camundongos e pintinhos, que dependem de um sistema cardiovascular funcional e não podem sobreviver a defeitos cardíacos precoces, o peixe-zebra oferece uma vantagem única, permitindo a investigação de fenótipos cardíacos graves. Isso se deve ao seu pequeno tamanho, que facilita o fornecimento suficiente de oxigênio por meio da difusão pass....

Protocol

Os procedimentos para trabalhar com embriões de peixe-zebra descritos neste protocolo seguem a diretiva europeia 2010/63/UE e as diretrizes do Ministério do Interior sob a licença do projeto PP6020928.

1. Obtenção de embriões de peixe-zebra para enxertia de contas

1. Cruze a linha de peixe-zebra relevante e cultive os embriões no meio de Danieau a 28,5 °C. Para obter instruções mais detalhadas sobre como cruzar as linhas de peixe-zebra, consulte o Banco de Dados de Educação Científica^{JoVE 27}.
2. Trate os embriões com 1-fenil-2-tioureia (PTU) a partir d....

Results

Exemplos de enxerto de esferas bem-sucedido são mostrados na Figura 3, Vídeo 3 e Vídeo 4. A conta magnética foi posicionada corretamente dentro do átrio do coração do peixe-zebra, permitindo fluxo sanguíneo desobstruído e nenhuma hemorragia observada. Além disso, as paredes do coração mantiveram sua integridade estrutural sem colapso (Figura 3 e Vídeo 3). Após 24 h, o embrião não apresentou sinais de edema peric.......

Discussion

Etapas críticas no protocolo e solução de problemas

Montagem de embriões de peixe-zebra

A quantidade de agarose usada para montar os embriões é importante. A cúpula formada não deve ser excessivamente grande, pois isso pode dificultar a manipulação do cordão da superfície para os embriões. Por outro lado, não deve ser muito pequeno; Ter várias contas em cima da agarose, posicionadas perto d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiais
Equipamento essencial para criação, reprodução e coleta
de peixe-zebra Prato com fundo de vidro (35 mm x 15  mm)	VWR International	734-2905
Bloco de calor	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Pinça de joalheiro	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont No. 5, L 4 1/4 pol., Tubos de microcentrífuga de liga de inox
2 mL	Eppendorf	30120094
Pasteur pipeta
Placa		de Petri
Estereomicroscópio<
forte>Reagentes
4 mg/mL solução estoque
Meio de Danieau (solução estoque 60x)
PureCube Glutathione MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-fenil-2-tioureia)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure baixo ponto de fusão agarose	Invitrogen	16520-050
meio de Danieau (solução estoque 60x)
34,8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1,6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5,8 g CaCl2· 2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 g MgCl2· 6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
Dissolva os ingredientes em H2O até um volume final de 2 L. Ajuste o pH para 7,2 usando NaOH e, em seguida, autoclave.
4 mg/mL de solução estoque de tricaína
400 mg de pó de tricaína (sal de metanossulfonato de etilo 3-aminobenzoato)	Sigma-Aldrich	A5040
97,9 mL de H2O biddestilado 2,1
mL 1 M Tris (pH 9)
Ajuste o pH para 7, depois alíquota e armazene a -20 °C.