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Imagem de microscopia de epifluorescência de lapso de tempo de fenótipos heterogêneos de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus

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DOI:

10.3791/67617

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14 de fevereiro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology & Biophysics, UConn Health, 2School of Dental Medicine, UConn Health, 3Richard D. Berlin Center for Cell Analysis and Modeling, UConn Health

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Neste manuscrito, fornecemos um protocolo abrangente para avaliar a sobrevida de antibióticos para Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, transformando plasmídeos em P. aeruginosa e S. aureus para criar cepas repórteres e visualizar variantes fenotípicas, como persistentes, por microscopia de epifluorescência de lapso de tempo.

Resumo

A persistência de antibióticos é um fenômeno no qual um pequeno número de células bacterianas em uma população geneticamente suscetível sobrevive ao tratamento com antibióticos que mata as outras células geneticamente idênticas. Os persistentes bacterianos podem retomar a replicação assim que o tratamento com antibióticos termina e são comumente considerados subjacentes à falha do tratamento clínico. Trabalhos recentes que aproveitam o poder da microscopia de fluorescência de lapso de tempo, na qual as bactérias são marcadas com repórteres transcricionais fluorescentes, repórteres translacionais e / ou corantes para uma variedade de características celulares, avançou nossa compreensão dos persistentes de Escherichia coli além do que poderia ser aprendido com ensaios de sobrevivência de antibióticos em nível populacional. Essas abordagens de célula única, em vez de ensaios populacionais em massa, são essenciais para delinear os mecanismos de formação de persistentes, resposta a danos e sobrevivência. No entanto, os métodos para estudar persistentes em outras espécies patogênicas importantes com esse nível de detalhe permanecem limitados.

Este estudo fornece uma abordagem adaptável para imagens de lapso de tempo de Pseudomonas aeruginosa (um bastonete gram-negativo) e Staphylococcus aureus (um coco gram-positivo) durante o tratamento e recuperação de antibióticos. Discutimos abordagens de genética molecular para introduzir repórteres fluorescentes nessas bactérias. Usando esses repórteres, bem como corantes, podemos rastrear as mudanças fenotípicas, características morfológicas e destinos de células individuais em resposta ao tratamento com antibióticos. Além disso, podemos observar os fenótipos de persistentes individuais à medida que ressuscitam após o tratamento. Ao todo, este trabalho serve como um recurso para os interessados em rastrear a sobrevivência e a expressão gênica de células individuais tratadas com antibióticos, incluindo persistentes, durante e após o tratamento, em patógenos clinicamente importantes.

Introdução

Os patógenos bacterianos podem escapar dos efeitos dos antibióticos por meio de dois mecanismos principais: resistência a antibióticos, que envolve alterações genéticas, e tolerância fenotípica, que envolve alterações não genéticas. A resistência aos antibióticos é um fenômeno geneticamente codificado que confere a capacidade de uma determinada célula bacteriana não apenas sobreviver, mas também se replicar na presença de um antibiótico1. A tolerância fenotípica, que pode abranger bactérias tolerantes ou persistentes a antibióticos, ocorre quando as células resistem ao tratamento com antibióticos bactericidas sem ganhar a capacidade de se replicar na presença de uma concentração inibitória do antibiótico 1,2. O que diferencia a tolerância da persistência é que a tolerância se refere à capacidade de toda a população de sobreviver ao tratamento, enquanto a persistência se refere a um subconjunto de uma população isogênica, mas fenotipicamente heterogênea, que sobrevive ao tratamento com antibióticos. Quando uma cultura clonal é tratada com antibióticos bactericidas e os sobreviventes que permanecem na cultura são plotados em relação ao tempo em uma escala log-linear, uma curva bifásica geralmente é detectada quando persistentes estão presentes. Nessas curvas, a primeira fase mostra que a maioria da população é morta de forma relativamente rápida, e a segunda fase indica que uma fração persistente de antibiótico é morta em um ritmo mais lento ou não é morta 1,2.

A persistência de antibióticos representa um grande fardo para os sistemas globais de saúde. Por exemplo, acredita-se que Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa persistentes, que são o foco deste artigo, causem infecções antibiótico-recalcitrantes, incluindo infecções recorrentes das vias aéreas em pacientes com fibrose cística e infecções crônicas de feridas 3,4. Portanto, elucidar ainda mais a biologia celular persistente e os programas fenotípicos é fundamental. Embora tenha havido progresso na compreensão de como os persistentes se formam e ressuscitam, lacunas críticas de conhecimento relativas à coordenação da reprogramação metabólica e eventos moleculares em células individuais subjacentes à persistência permanecem 5,6,7,8.

Estudar efetivamente a persistência provou ser um desafio técnico. Como a persistência só é observável em um pequeno subconjunto de uma população bacteriana, as técnicas que coletam amostras de populações bacterianas em massa geralmente não conseguem capturar informações biológicas relevantes 1,2,8,9,10. Além disso, como as alterações fenotípicas subjacentes à persistência são transitórias e não hereditárias, o rastreamento do destino das células persistentes pode ser complexo 1,8,9,10,11. Uma vez que os persistentes bacterianos retomam o crescimento, eles podem se dividir e dar origem a persistentes e não persistentes, o que torna impossível enriquecer para populações persistentes puras por cultura. Esses desafios destacam a necessidade de técnicas que possam atender aos seguintes critérios: 1) a capacidade de capturar informações biológicas de células vivas e 2) a capacidade de serem usadas em conjunto com corantes fluorescentes, sondas, sensores e repórteres que permitem que fenótipos de células individuais em populações heterogêneas sejam interrogados ao longo do tempo.

Avanços recentes nas tecnologias de célula única forneceram um caminho para investigar efetivamente a heterogeneidade bacteriana e superar esses obstáculos no estudo da persistência12,13. Algumas dessas técnicas incluem microscopia de fluorescência, citometria de fluxo / classificação de células ativadas por fluorescência, microfluídica e sequenciamento de RNA de célula única12,13. Aqui, descrevemos protocolos para elucidar a fisiologia persistente de célula única usando microscopia de lapso de tempo de epifluorescência de cepas repórter transcricionais ou translacionais. A microscopia de fluorescência é uma técnica poderosa que preenche os critérios para estudar fenótipos persistentes, ou seja, a capacidade de identificar quais células individuais em uma grande população se propagam após a remoção do antibiótico e, portanto, podem ser definidas como persistentes. Com a introdução de tecnologias de câmeras automatizadas e câmaras incubadas, a captura de células bacterianas vivas é amplamente acessível em todo o campo da microbiologia. Crucialmente, a microscopia de lapso de tempo oferece a capacidade de visualizar células individuais em tempo real, ao longo de horas e até dias, o que torna possível rastrear bactérias antes, durante e após o tratamento com antibióticos 14,15,16. Os insights dessas investigações que aproveitam a microscopia de lapso de tempo têm imenso potencial para gerar insights sobre os mecanismos complexos da biologia persistente.

Protocolo

1. Geração de cepas repórteres fluorescentes de  S. aureus por transformação e transdução

NOTA: As cepas repórter abrigam uma proteína fluorescente para indicar a expressão de um gene ou proteína de interesse. Os repórteres transcricionais apresentam uma cópia duplicada da sequência do promotor nativo para um gene de interesse a montante de uma proteína fluorescente, de modo que a fluorescência aumenta à medida que a expressão de um gene de interesse aumenta. Repórteres translacionais ligam os quadros de leitura abertos de uma proteína fluorescente e uma proteína de interesse com um conector peptídico flexível. A visualização de cepas repórter com microscopia de células vivas pode revelar se um determinado gene / proteína de interesse está associado a morfologias celulares específicas ou destinos celulares (Figura 1, Vídeo Suplementar 1 e Vídeo Suplementar 2). Escolha uma proteína fluorescente otimizada para códons para S. aureus. Embora este estudo use sGFP de pCM29 doado pelo Dr. Alexander Horswill, o Nebraska Transposon Mutant Library Genetic Toolkit contém plasmídeos com sGFP, eYFP, eCFP, DsRed.T3 e eqFP650otimizados para códons 17,18.

  1. Transforme plasmídeos repórter em S. aureus RN4220.
    NOTA: A seção do protocolo a seguir foi adaptada do Workshop Essentials of Staphylococcal Genetics and Metabolism do University of Nebraska Medical Center19,20.
    1. Primeiro, prepare o eletrocompetente S. aureus RN4220. Prepare 200 mL de caldo B2 combinando 2 g de casaminoácidos, 5 g de extrato de levedura, 2 mL de 10% K2HPO4, pH 7,5, 2 mL de solução de glicose a 50% e 5 g de NaCl. Aumente o volume para 100 mL com água ultrapura estéril. Misturar brevemente a 37 °C para dissolver os componentes e esterilizar com um filtro de frasco (poro de 0,22 μm).
    2. Inocular S. aureus RN4220 de um estoque congelado armazenado a -80 ° C em glicerol a 25% em 30 mL de caldo B2 em um frasco defletor de 250 mL e incubar por 18 h a 30 ° C, agitando a 125 rpm.
    3. Incube dois frascos defletores de 250 mL com 50 mL de caldo B2 cada um a 37 ° C durante a noite para pré-aquecer o meio para o dia seguinte.
    4. No dia seguinte, meça o OD600 da cultura noturna. Adicione cultura noturna suficiente a cada frasco contendo 50 mL de caldo B2 para obter um OD600 final de 0,25.
    5. Incubar a 37 °C, agitando a 250 rpm, até que o OD600 atinja 0,35-0,4.
      NOTA: Verifique o OD600 cerca de 30 min após a subcultura para garantir que a cultura não cresça além de 0,35-0,4. Se o OD600 não atingir 0,35-0,4 dentro de 1 h após a subcultura, abandone o procedimento e tente novamente no dia seguinte. As bactérias provavelmente cresceram muito durante a noite e estavam muito profundas na fase estacionária.
    6. Quando a cultura atingir a fase intermediária, despeje a cultura de cada frasco em um tubo cônico estéril de 50 mL e células de pellets por centrifugação a 4.000 x g por 10 min.
    7. Transvase o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 ml de água estéril à temperatura ambiente (RT). Transfira as células para um tubo de microcentrífuga.
    8. Centrifugue as células novamente a 21.000 x g por 30 s, remova o sobrenadante e ressuspenda em 1 mL de água RT estéril. Repita a centrifugação, remoção do sobrenadante e ressuspensão em 1 mL de etapas de água mais duas vezes para um total de três lavagens.
    9. Centrifugue as células, remova a água e, em seguida, ressuspenda as células em 1 mL de glicerol estéril RT 10% (em água, filtrado estéril) e deixe em RT por 15 min.
    10. Pellet as células por centrifugação a 21.000 x g por 30 s, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em outro 1 mL de glicerol estéril RT 10%. Essas células agora são eletrocompetentes.
    11. Alíquota de 70 μL de células eletrocompetentes em tubos de microcentrífuga de tampa de encaixe e armazene a -80 °C para uso futuro.
    12. Para transformar o eletrocompetente S. aureus RN4220, descongele uma alíquota de células no gelo. Adicione 1 μg de DNA de plasmídeo às células, sacuda a amostra para misturar e incube no gelo por 5 min. Em seguida, eletroporar as células e permitir que elas se recuperem em 390 μL de meio B2 por 1-2 h a 37 ° C, agitando a 225 rpm, e transformantes de placa em ágar soja tríptico seletivo.
      NOTA: A maioria dos vetores de transporte usados neste estudo apresenta um de resistência à ampicilina para seleção em E. coli (100 μg/mL) e um de resistência a cloranfenicol (10 μg/mL) ou eritromicina (Erm, 10 μg/mL) para seleção em S. aureus. Muitas cepas de S. aureus que são usadas rotineiramente em laboratório são resistentes a Erm. Certifique-se de que uma cepa de interesse seja compatível com o antibiótico seletivo antes de usar um determinado vetor de transporte. É importante que o volume de DNA adicionado às células seja minimizado (ou seja, <5 μL) para evitar arcos, que ocorrem quando a amostra é muito condutora durante a eletroporação. A purificação de altas concentrações (≥300 ng/μL) do DNA do plasmídeo de E. coli ajudará a manter os volumes baixos.
  2. Propagar bacteriófago em transformado S. aureus RN4220.
    NOTA: A seção de protocolo a seguir foi adaptada dos métodos de Krausz e Bose21e Olson22. Dois dos bacteriófagos mais comumente usados para S. aureus transdução são φ11 e 80α. O procedimento para colher ambos é o mesmo, exceto que obtemos φ11 de S. aureus RN451 e 80α de S. aureus RN10359. φ11 tem sido usado com sucesso com as cepas comuns JE2 e HG003, entre outras, e é usado neste protocolo23,24. No entanto, esses fagos podem não transduzir eficientemente isolados clínicos que possuem resistências variadas aos fagos. Consulte as publicações de Krausz e Bose21 e Olson22 para um método de preparação de φ11 e determinação do título de fagos.
    1. Para transduzir o plasmídeo repórter, preparar seis placas de ágar tríptico de soja (TSA) com 5 mM de CaCl2 e a concentração adequada do antibiótico seletivo. Streak S. aureus RN4220 transformou-se com o plasmídeo repórter em uma placa TSA contendo o antibiótico seletivo e sem CaCl2 e incubou durante a noite.
    2. No dia seguinte, ligue uma incubadora ou banho-maria a 56 °C. Rotule seis tubos de tampa de pressão de 5 mL 1 x 104 a 1 x 109 e alíquota de 40 μL de CaCl500 mM 2 em cada tubo de tampa de pressão.
    3. Derreta o TSA macio (0,5% de ágar) no micro-ondas com a tampa afrouxada para evitar o acúmulo de pressão, mantendo a esterilidade. Em seguida, alíquota de 4 mL em cada um dos tubos de tampa de pressão. Inverter os tubos para misturar e, em seguida, colocá-los na incubadora a 56 °C para evitar que o ágar mole solidifique.
    4. Dilua o estoque de fagos a 1 x 1010 PFU/mL em caldo de soja tríptico (TSB) + 5 mM CaCl2. Adicione 100 μL de fago 1 x 1010 PFU/mL a um tubo de microcentrífuga contendo 900 μL de TSB + 5 mM CaCl2 para uma concentração final de 1 x109 PFU/mL. Em seguida, dilua em série em tubos de microcentrífuga adicionais contendo 900 μL de TSB + 5 mM CaCl2 até uma concentração de 1 x 104 PFU/mL. Rotular cada uma das seis placas de ágar antibiótico seletivo TSA + 5 mM CaCl2 + com uma diluição seriada: 1 x104 a 1 x 109 PFU/mL.
    5. Ressuspenda o S. aureus RN4220 durante a noite contendo o plasmídeo em 1 mL de TSB + 5 mM CaCl2. Remova o tubo de tampa de pressão 109 da incubadora e adicione rapidamente 10 μL de RN4220 ressuspenso contendo o plasmídeo e 100 μL de diluição de fago 1 x 109 PFU/mL, inverta para misturar e despeje o conteúdo na placa de ágar antibiótico TSA + 5 mM CaCl2 + antibiótico seletivo correspondente.
    6. Execute este procedimento para as diluições de fagos restantes e suas respectivas placas. Deixar o ágar-ágar mole solidificar nas placas e, em seguida, incubar com o ágar-ágar mole virado para cima durante a noite a 37 °C.
    7. No dia seguinte, certifique-se de que as placas (áreas de folga no gramado bacteriano) estejam visíveis nas placas (Figura 2A). As placas representam áreas de lise onde o fago infectou com sucesso o RN4220, e alguns fagos terão absorvido o plasmídeo de interesse. Selecione a placa com o estoque de fago menos diluído que tem lise quase confluente (exemplo: 1 x 109 PFU/mL de fago), bem como as placas que receberam as duas diluições abaixo disso (neste caso, 1 x 108 PFU/mL e 1 x 107 PFU/mL, que devem ter lise quase confluente).
    8. Adicione 3 mL de TSB + 5 mM CaCl2 à menos diluída dessas placas (1 x 109 PFU/mL, para este exemplo). Use um espalhador de células estéril em forma de L para raspar suavemente a camada de ágar macio do ágar normal (Figura 2B). Use o espalhador de células para interromper o ágar o máximo possível para facilitar a liberação de fago do ágar macio.
    9. Uma vez que o ágar macio na primeira placa tenha sido completamente interrompido, despeje suavemente o ágar mole e a pasta de caldo na próxima placa (neste caso, 1 x 108 PFU/mL). Raspe e interrompa o ágar macio nesta placa, despeje a pasta resultante na placa final e repita.
    10. Depois de preparar a pasta de ágar mole de todas as três placas, despeje suavemente a pasta em um tubo cônico de 50 mL. Pipete suavemente para romper ainda mais o ágar macio, mas evite formar bolhas. Não vórtice, pois isso pode danificar o fago e diminuir o título.
    11. Centrifugue a pasta de ágar mole a 4.000 x g por 10 min em RT. Despeje suavemente o sobrenadante em uma seringa conectada a um filtro de 0,45 μm.
      NOTA: É essencial derramar suavemente e evitar que pedaços de ágar entrem no filtro. Essas peças obstruirão o filtro e impedirão a filtragem do sobrenadante restante, diminuindo o título.
    12. Determine o título do lisado de fago resultante usando RN422021 do tipo selvagem.
  3. Introduzir plasmídeos repórteres em cepas de S. aureus de interesse por transdução.
    1. Preparar oito placas TSA contendo 500 μg/ml de citrato de sódio e a concentração adequada de antibiótico selectivo. Listrar densamente a cepa de S. aureus receptora desejada em TSA simples e incubar durante a noite a 37 ° C.
    2. No dia seguinte, esfregue a placa e ressuspenda a cepa receptora em 1 mL de TSB + 5 mM de CaCl2.
    3. Diluir o estoque de fagos que transporta o plasmídeo repórter desejado para 1 x1010 PFU/mL.
    4. Misture 1,5 mL de TSB + 5 mM de CaCl2, 0,5 mL de cepa receptora ressuspensa e 0,5 mL de estoque de fago diluído em um tubo cônico de 50 mL. Incubar a 37 °C, agitando a 225 rpm, durante 20 min.
      NOTA: Tempos de incubação mais longos não são recomendados porque provavelmente diminuirão a eficiência da transdução à medida que o fago começa a lisar as células receptoras.
    5. Imediatamente depois, adicione 1 mL de citrato de sódio 0,02 M gelado filtrado estéril (em água) ao tubo cônico e centrifugue a 4.000 x g por 10 min a 4 ° C. Em seguida, ressuspenda o pellet em 1 mL de citrato de sódio 0,02 M gelado.
    6. Espalhe alíquotas de 100 μL em cada uma das seis placas TSA contendo 500 μg / mL de citrato de sódio e a concentração apropriada de antibiótico seletivo para selecionar transdutores. Incubar durante a noite a 37 °C.
    7. No dia seguinte, risque as colónias individuais das placas de transdução para as restantes duas placas TSA contendo 500 μg/ml de citrato de sódio e a concentração adequada de antibiótico selectivo. Incubar durante a noite a 37 °C.
      NOTA: Esta etapa de passagem em placas adicionais de citrato de sódio ajuda a reduzir o título de fago ao redor das células transduzidas, evitando a lise22.
    8. Escolha colônias individuais da placa de estria, cultive as células até a fase exponencial em TSB contendo o antibiótico seletivo e armazene em glicerol a 25% a -80 ° C para uso futuro.

2. Geração de cepas repórteres fluorescentes de  P. aeruginosa por conjugação

NOTA: A movimentação de um plasmídeo repórter para P. aeruginosa de uma cepa de clonagem de E. coli pode ser feita por acasalamento triparental25. São necessárias uma cepa doadora de E. coli que carrega o plasmídeo de interesse (que deve conter um oriT para transferência conjugal), E. coli HB101 + pRK2013 - uma cepa auxiliar para facilitar a conjugação (use 50 μg/mL de canamicina para manutenção do plasmídeo pRK2013) e a cepa receptora de P. aeruginosa que receberá o plasmídeo. Para este exemplo, o plasmídeo de interesse tem um marcador de resistência à tetraciclina (Tet), portanto, qualquer cultura de E. coli com o plasmídeo precisará de 10 μg/mL de Tet, e P. aeruginosa com o plasmídeo precisará de 75 μg/mL de Tet para seleção26.

  1. Inocular bactérias de estoques congelados armazenados a -80 ° C em glicerol a 25% em caldo de lisogenia (LB) com o antibiótico apropriado para crescimento durante a noite, agitando a 225 rpm a 37 ° C.
  2. No dia seguinte, espalhe 200 μL de cada cultura líquida durante a noite na placa de ágar LB com o antibiótico seletivo apropriado. Dependendo de quantos acasalamentos de transformação devem ser feitos, espalhe mais placas para as cepas ajudante e doadora. Recomenda-se uma placa de ajudante/doador por transformação. Incube as placas durante a noite a 37 °C para obter gramados densos de cada cepa.
  3. No dia seguinte, colete os gramados de crescimento esfregando cada superfície da placa com um cotonete estéril e limpando-o ao longo do interior de um tubo de microcentrífuga. Centrifugue cada tubo brevemente (pulse por 5 s) para coletar as células no fundo do tubo. Ressuspenda cada pellet celular em 200 μL de LB.
    NOTA: As ressuspensões devem parecer muito espessas, opacas e livres de grumos.
  4. Em novos tubos de microcentrífuga para cada acasalamento, combine 5 μL de cepa receptora de P. aeruginosa , 160 μL de cepa doadora de E. coli com o plasmídeo de interesse e 160 μL de E. coli auxiliar HB101 + pRK2013. Misture delicadamente, pipetando para cima e para baixo, e coloque 50 μL da mistura em uma placa de ágar LB pré-seca. Além disso, coloque 20 μL de cada cepa individual no ágar LB para controles. Deixe as manchas secarem completamente na placa e incube a 37 °C por 3-6 h.
    NOTA: A pré-secagem do ágar LB evita que o ponto de 50 μL se espalhe pela superfície e, assim, força as células a interagir em uma área menor.
  5. Após a incubação, passe suavemente a ponta de uma pipeta pelo local de contato para transferir algumas células para um novo tubo de microcentrífuga. Centrifugue brevemente para coletar as células no fundo do tubo. Ressuspenda em 200 μL de LB e coloque toda a ressuspensão em uma placa de ágar LB + Irgasan (Igr; 25 μg/mL) + Tet (75 μg/mL).
    NOTA: P. aeruginosa é intrinsecamente resistente ao Igrasan, e o plasmídeo de interesse contém o marcador de resistência Tet, portanto, apenas P. aeruginosa transformada com sucesso deve ser capaz de crescer nas placas LB + Irgasan + Tet. Dependendo da eficiência da transformação, ressuspender e chapear todo o local de acoplamento pode resultar em um gramado de transformadores no dia seguinte. Para obter colônias individuais, (i) ressuspenda todo o local de contato em um volume maior de LB e, em seguida, coloque 200 μL dele ou (ii) transfira uma pequena porção do local de contato para um tubo de microcentrífuga e, em seguida, ressuspenda em 200 μL e placa.
  6. Com os pontos de controle de cada cepa individual, passe suavemente um pouco do ponto de célula densa em uma ponta de pipeta, transfira para um novo tubo de microcentrífuga, ressuspenda em 200 μL de LB e, em seguida, coloque 50 μL em uma placa de ágar LB + Irgasan + Tet (vários pontos de controle podem ser colocados na mesma placa de ágar). Deixe as manchas secarem completamente. Incubar todas as placas durante 16-20 h durante a noite a 37 °C.
    NOTA: Para os pontos de controle, o objetivo é verificar se a placa antibiótica é seletiva para transformantes de P. aeruginosa . Se os pontos de controle estiverem muito concentrados quando detectados nas placas de ágar LB + Irgasan + Tet, será difícil determinar se a seleção funcionou no dia seguinte, porque haverá um halo de células mortas que podem ser confundidas com crescimento.
  7. No dia seguinte, confirme a seletividade antibiótica das placas LB + Irgasan + Tet, observando a falta de crescimento celular para os pontos de controle de cepas individuais.
    NOTA: As colônias que aparecem na placa de acasalamento triparental LB + Igrasan + Tet são transformantes de P. aeruginosa carregando o plasmídeo de interesse.
  8. Opcional para colher e listrar colônias em ágar LB + Irgasan + Tet e crescer durante a noite para se livrar do excesso de E. coli morta da mistura de acasalamento.
  9. Escolha colônias individuais, cresça por 3-6 h em LB + Tet líquido (75 μg / mL) até ficar visivelmente turvo e, em seguida, deposite os estoques congelados em 25% de glicerol (500 μL de cultura de células + 500 μL de glicerol a 50% em água). Verifique se os clones são transformados com sucesso por PCR de colônia seguido por Sanger ou sequenciamento de plasmídeo completo.

3. Determinação de doses de antibióticos para ensaios de persistência

NOTA: Para selecionar uma dose de um determinado antibiótico com o qual tratar a população bacteriana para experimentos persistentes, primeiro meça a concentração inibitória mínima (CIM) do antibiótico em relação à cepa bacteriana de interesse. Isso pode ser alcançado usando o método de microdiluição em caldo - uma abordagem que o Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) endossa - ou o teste do Epsilometer (E-test), que é feito usando tiras de teste com uma variedade de doses de antibióticos27. Uma vez que a CIM é determinada, escolha pelo menos cinco concentrações do antibiótico que variam de 1 a 100 vezes a CIM para tratamento celular.

  1. Inocular bactérias de estoques congelados armazenados a -80 ° C em glicerol a 25% em 2 mL de MHB (CA-MHB) ajustado para cátions ou outro meio rico em nutrientes. Cultivar as células durante cerca de 4 h a 37 °C com agitação a 250 rpm antes de transferir 125 μl da cultura para 25 ml de meio fresco quimicamente definido num balão Erlenmeyer com defletor de 250 ml. Cultivar a bactéria durante 16 h (até à fase estacionária) a 37 °C, agitando a 250 rpm.
    NOTA: O meio de sal basal (BSM) com succinato como única fonte de carbono é normalmente usado para experimentos de P. aeruginosa e meios quimicamente definidos ricos são normalmente usados para experimentos de S. aureus 28,29,30,31.
  2. Na manhã seguinte, prepare 100x estoques de antibióticos (nos respectivos solventes) para a faixa desejada de concentrações supra-MIC. Adicione 10 μL de cada diluição a tubos de ensaio individuais.
  3. Meça o OD600 da cultura noturna para confirmar a turbidez da fase estacionária. Dilua em série 10 μL de cultura e coloque as diluições em placas de ágar nutritivo - como ágar LB, ágar CA-MHB ou TSA - para determinar as unidades formadoras de colônias (UFCs) antes do tratamento com antibióticos.
  4. Para o tratamento com antibióticos, dispense alíquotas de 1 mL da cultura nos tubos de ensaio contendo 10 μL de concentrações de antibiótico 100x. Incubar as amostras a 37 °C, agitando a 250 rpm, durante um período suficiente para matar os não persistentes da população, deixando os persistentes como as únicas células formadoras de colónias.
    NOTA: A duração do tratamento pode variar dependendo do experimento e da cepa bacteriana que está sendo testada. Normalmente , S. aureus é tratado por 5 h ou 7 h e P. aeruginosa por 7 h ou 24 h. Em geral, qualquer ponto de tempo na segunda fase do ensaio de sobrevivência dependente do tempo pode ser usado porque se espera que as células restantes na segunda fase sejam persistentes.
  5. Após o tratamento com antibióticos, transfira 100 μL de células dos tubos de ensaio para tubos de microcentrífuga contendo 900 μL de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Pulverize as células por centrifugação em RT a 21.000 x g por 3 min. Remover 900 μL de sobrenadante e ressuspender o pellet em 900 μL de PBS estéril. Repita a etapa de lavagem pelo menos mais uma vez para reduzir os antibióticos residuais para níveis sub-MIC.
  6. Diluir em série a cultura 10 vezes (seis vezes) e colocar 10 μL de cada diluição em placas de ágar nutritivo. Incubar as placas a 37 °C durante a noite.
    NOTA: Use placas de 96 poços de fundo redondo não tratadas para diluição em série e células de placa em placas de ágar quadradas usando uma pipeta multicanal.
  7. No dia seguinte, conte as colônias em cada concentração de antibiótico. Representar graficamente a fração de sobrevivência (UFC no final do tratamento/UFC antes do tratamento) em função da concentração numa escala log-linear. Para escolher uma concentração de medicamento para futuros ensaios de persistência, selecione uma concentração na segunda fase da curva bifásica (Figura 3).

4. Células de imagem durante o tratamento ou recuperação de antibióticos

  1. Preparar almofadas de agarose e amostras de células para imagens de lapso de tempo
    NOTA: O seguinte protocolo de preparação de amostras foi desenvolvido como uma alternativa fácil de usar e econômica aos métodos tradicionais de "sanduíche" de agarose14,16. O uso de um prato de lamínula intercambiável evita a necessidade de graxa ou esmalte bagunçado para selar a amostra, o que pode limitar ainda mais a aeração da amostra. A agarose é colocada no prato de lamínula intercambiável com a lamínula já no lugar, criando superfícies de agarose planas confiáveis em comparação com as preparações de almofada de agarose à mão livre. No geral, esse método permitiu amostras de imagem com foco aprimorado em todo o campo de visão e por períodos mais longos devido à umidificação estável. O método descrito aqui é usado para visualizar bactérias durante o tratamento com antibióticos (Figura 4, Vídeo Suplementar 3e Vídeo Suplementar 4). Visualizar os persistentes enquanto ressuscitam e despertam após o tratamento com antibióticos (Figura 5, Vídeo Suplementar 5e Vídeo Suplementar 6), prepare as almofadas de agarose com meios de cultura frescos em vez de meios gastos e não adicione antibióticos às almofadas (exceto aqueles adicionados para manutenção de plasmídeo/seleção de antibióticos).
    1. Coloque uma lamínula estéril de 30 mm (espessura # 1.5) na parte inferior da base de aço inoxidável de uma lamínula intercambiável ("câmara"). Rosqueie suavemente o inserto de policarbonato na base de modo que a lamínula de 30 mm forme a base da câmara e sele-a no lugar comprimindo o O-ring de silicone anexado. Repita esta etapa para preparar uma câmara duplicada.
      NOTA: Recomenda-se que sejam preparadas duplicatas para cada experimento, caso a preparação de uma das câmaras seja subótima. Um divisor personalizado impresso em 3D é colocado contra a lamínula de 30 mm para evitar que células móveis como P. aeruginosa se contaminem cruzadamente e para fornecer pontos de referência para os locais das amostras. O arquivo STL para impressão 3D está disponível no Arquivo Suplementar 1.
    2. Prepare agarose a 1,5% em um tubo cônico de 50 mL usando o meio de sua escolha. Agite suavemente para misturar.
      NOTA: Para imagens de células de fase estacionária durante o tratamento, o meio gasto sem células de uma cultura noturna de fase estacionária é usado como meio de base. Normalmente, o meio de agarose é preparado como 0,105 g de agarose em 7 mL de meio para preparar duas câmaras; cada câmara requer 2 mL de meio de agarose, e o excesso é útil para evitar bolhas de ar durante a pipetagem.
    3. Coloque o cônico de 50 mL em um copo de vidro ou suporte próprio para micro-ondas (certifique-se de que a tampa esteja solta). Microondas em alta, parando a cada 3-4 s para girar e misturar. Faça uma pausa e misture com frequência para evitar que a mistura de agarose borbulhe.
      1. Após ~ 1 min de tempo total de aquecimento, verifique se há alguma agarose visível que não tenha derretido na mistura. Se a mistura estiver uniformemente límpida, deixe o meio de agarose esfriar a ~ 60 ° C brevemente antes de adicionar quaisquer medicamentos ou corantes adicionais. Agite suavemente para misturar e evitar a formação de bolhas de ar.
        NOTA: O iodeto de propídio (16 μM para P. aeruginosa ou 1,6 μM para S. aureus) pode ser adicionado para visualizar quando as células perdem a viabilidade.
    4. Movendo-se rapidamente para evitar que o meio de agarose se solidifique, pipete 2 mL do meio de agarose para a câmara com a lamínula de 30 mm. Coloque suavemente uma lamínula estéril de 25 mm (espessura # 1,5) sobre o meio de agarose na abertura da câmara superior; Isso ajuda a evitar a desidratação da almofada de agarose e garante uma superfície superior plana da agarose para imagens de contraste de fase ideais. Deixe a almofada solidificar por 1-2 h.
    5. Depois que a almofada se solidificar, prepare as células a serem fotografadas diluindo-as para uma densidade apropriadamente esparsa em PBS para visualizar células individuais. Aqui, as células são diluídas para OD600 0,01-0,05.
    6. Na lamínula de 25 mm, use um marcador permanente de ponta fina para marcar os locais/identidades de cada amostra semeada no bloco. Inverta a câmara de forma que o anel da base de aço inoxidável fique voltado para cima e segure cuidadosamente a inserção de policarbonato por baixo enquanto desrosqueia a base. Coloque a base de aço inoxidável de lado. Deslize cuidadosamente a lamínula de 30 mm para fora da almofada e descarte-a.
      NOTA: Remova a lamínula de 30 mm deslizando horizontalmente e tome cuidado para não recuar a superfície da agarose. Além disso, evite trabalhar sobre a superfície exposta de agarose: qualquer poeira que caia sobre ela afetará a qualidade da imagem e poderá contaminar a almofada.
    7. Usando as marcas na lamínula de 25 mm para orientação, localize 5 μL das células diluídas nos respectivos locais na almofada de agarose. Adicione três focos de 5 μL (ajuste conforme necessário, por exemplo, pontos de 4 x 4 μL, etc.). Depois que as manchas estiverem completamente secas, coloque levemente uma nova lamínula estéril de 30 mm centralizada sobre a almofada.
    8. Segure a inserção de policarbonato com uma mão e, com a outra, volte a enfiar lentamente a base de aço inoxidável sobre a nova lamínula. Rosquear até apertar com os dedos é suficiente para comprimir o O-ring de silicone e selar a câmara.
      NOTA: Tenha cuidado para não apertar demais - se a lamínula de 30 mm contra a superfície da amostra for comprimida pela base de aço inoxidável e torcida repetidamente, as células podem se espalhar em um padrão radial, potencialmente causando contaminação cruzada da amostra.
    9. Uma vez selada a câmara, observar se a agarose está em contacto com a superfície da lamínula de 30 mm; Nesse ponto, geralmente há algum contato superficial, mas não completo. Use a ponta romba de uma pinça ou um instrumento semelhante para pressionar suavemente contra a lamínula de 25 mm até que a agarose toque a lamínula de 30 mm uniformemente em toda a superfície.
      CUIDADO: Esta etapa pode resultar na quebra da lamínula de 25 mm se for usada força excessiva.
    10. Uma vez que a agarose esteja bem pressionada contra a lamínula de 30 mm para que não permaneçam grandes bolhas de ar, a almofada está pronta para ser fotografada.
  2. Configure o microscópio e a imagem.
    1. Prepare os controles ambientais do microscópio e da câmara de imagem. Defina as temperaturas da incubadora de topo do palco e da incubadora de câmara grande para 37 °C e ligue o umidificador de câmara. Coloque uma das preparações de almofada de agarose na incubadora de palco e feche a câmara de incubação para permitir que a amostra se equilibre. A tampa umidificadora da incubadora stage é deixada aberta neste ponto para evitar condensação na lamínula de 25 mm da câmara.
      NOTA: O encolhimento/expansão da almofada devido a mudanças de temperatura pode causar um desvio entre os pontos de tempo que vão além da faixa de varredura do algoritmo de foco automático. É crucial equilibrar a almofada de agarose a uma temperatura estável antes da imagem, o que normalmente leva pelo menos 15 minutos. O aquecimento suficiente também evita a condensação na lamínula superior quando a tampa umidificadora é colocada no lugar. Os componentes de hardware do sistema de imagem foram (Tabela de Materiais): câmara de incubação de células vivas, microscópio invertido com objetiva Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil Ph3 M27, mecanismo de luz LED Spectra 7 e câmera sCMOS (tamanho de pixel de 6,5 μm). O controle dos componentes motorizados do microscópio e a aquisição de imagens são feitos usando um aplicativo de software de análise de microscopia.
    2. Prepare o software para aquisição de imagens. Defina o algoritmo de foco automático integrado do MetaMorph (software de análise de microscopia) para usar o canal de fase durante a aquisição multidimensional.
      1. Na guia Estágio , defina várias posições de estágio para cada amostra, visando campos de visão onde a densidade celular é distribuída uniformemente. Na guia Timelapse , defina a duração e a frequência desejadas (intervalo de tempo) das imagens a serem tiradas. Nas guias Comprimentos de onda , defina os canais desejados para aquisição e ajuste os tempos de exposição para as intensidades de sinal das amostras.
        NOTA: As imagens de cada posição são tiradas a cada 10 minutos por até 24 h. Para imagens de fluorescência dos corantes/fluoróforos mencionados neste artigo, foram utilizadas as seguintes configurações de excitação do motor de luz: iodeto de propídio (Cy3; 555/15 nm) e GFP (GFP/FITC; 470/24 nm). O tempo de exposição típico de excitação de fluorescência usado é de 100 ms. São utilizados o conjunto de filtros 15 (Beamsplitter FT580, Emission LP590) para iodeto de propídio e o conjunto de filtros 44 (Beamsplitter FT500, Emission BP 530/50) para GFP.
    3. Depois que a almofada de agarose aquecer na câmara, adicione a tampa umidificadora à incubadora do palco. Isso ajudará a evitar que a almofada desidrate e se desloque durante a imagem.
    4. Com a tampa umidificadora, mude de fase para contraste de interferência diferencial (DIC) e ajuste o condensador do microscópio e o diafragma de abertura para iluminação Köhler adequada.
    5. Após o ajuste, volte para a fase. Navegue até cada posição do palco, ajuste o foco e redefina a posição do palco para o novo plano focal. As configurações agora estão em vigor para começar a geração de imagens.
      NOTA: É importante revisitar cada stage posição antes de iniciar a aquisição para garantir que o pad não tenha mudado. Se as células estiverem fora de foco quando revisitadas em uma determinada posição do palco, concentre-se novamente nelas e substitua a posição anterior do palco. A configuração do algoritmo de foco automático usa a posição z focal do último ponto de tempo ± 3 μm como faixa de pesquisa, portanto, se o pad se deslocar mais de 3 μm de distância, o algoritmo não conseguirá focar corretamente.
    6. Inicie a aquisição multidimensional clicando no botão Adquirir .
    7. Após a conclusão do experimento, compile as imagens individuais de cada canal em uma pilha para visualização como um vídeo ou para outra análise. Faça isso usando MetaMorph ou ImageJ.
      1. Para compilar imagens no MetaMorph (preferencial), no aplicativo Review Multi Dimensional Data , selecione os canais/comprimentos de onda de interesse e selecione todos os pontos de tempo para uma determinada posição do palco. Clique em Carregar imagens. Janelas aparecerão para cada canal/comprimento de onda. Salve cada compilação com seu respectivo nome de canal como um arquivo .tiff.
      2. Para compilar no ImageJ, abra os arquivos para todos os pontos de tempo para uma posição de estágio e um canal. Compile usando imagens para empilhar.

5. Criando vídeos com lapso de tempo usando Fiji/ImageJ

NOTA: Fiji (Fiji é apenas ImageJ) é um software disponível gratuitamente para processamento e análise de imagens que pode ser baixado aqui: "https://imagej.net/software/fiji/downloads32"32. Fiji/ImageJ2 1.54f foi usado para os métodos de processamento de imagem descritos abaixo.

  1. Corrija a pilha de imagens do canal de fase usando o BaSiC33. Abra a pilha de imagens de fase desejada em Fiji e selecione BaSiC na guia Plug-ins . A pilha corrigida por sombra aparecerá em uma janela separada intitulada Corrected:ImageName.
    NOTA: BaSiC.jar pode ser baixado aqui: "https://github.com/marrlab/BaSiC33"33. Siga as instruções do desenvolvedor para instalar corretamente o BaSiC em Fiji.
  2. Mescle a pilha de canais de fase com correção de tonalidade com quaisquer outros canais/comprimentos de onda usando Imagem > Cor > Mesclar canais. Ajuste o fundo e as intensidades do sinal com Image > Ajuste > brilho/contraste para cada canal. Salve o arquivo mesclado como um .tiff.
  3. Em seguida, estabilize as imagens usando Corrigir desvio 3D. Com a pilha corrigida por sombra selecionada, vá para Plugins > Registrations > Correct 3D Drift. Na janela de diálogo que é aberta, defina o canal para registro como o número do canal correspondente à pilha de fases. A pilha resultante após a correção será intitulada pontos de tempo registrados. Corte para o campo de visão desejado e salve o arquivo corrigido como um .tiff.
    NOTA: Se o MetaMorph foi usado para criar a pilha de imagens compiladas, há uma etapa extra de processamento: vá para Propriedades do > da imagem e troque os números nos campos Slices (z) e Frames (t). A correção de desvio agora pode interpretar corretamente cada quadro como um ponto de tempo e não uma fatia de uma pilha z. O arquivo de .tiff corrigido por sombra e desvio pode ser usado em análises de imagem subsequentes. Existem muitos pacotes de software disponíveis para medir intensidades de sinal fluorescente, quantificar características morfológicas, rastrear o destino de células individuais e muito mais. Dois programas comumente usados são o plug-in MicrobeJ para Fiji e o Oufti34,35.
  4. Adicione carimbos de data/hora e rótulos de texto à pilha usando Pilhas de > de imagem > Rótulo.
  5. Para adicionar uma barra de escala, primeiro conheça o tamanho do pixel da câmera e a ampliação da objetiva do microscópio. Calcule a proporção pixel:mícron como tamanho de pixel dividido pela ampliação. Na caixa de diálogo Analisar > definir escala , insira a proporção de pixels:mícrons no campo de distância conhecida . Em seguida, adicione uma barra de escala à pilha com Analisar > Ferramentas > Barra de Escala.
    NOTA: A escala precisa de um microscópio deve ser calibrada usando um micrômetro de platina. No entanto, a lente objetiva do microscópio e a câmera usada podem fornecer uma estimativa aproximada da escala. Por exemplo, a câmera PCO sCMOS usada aqui tem um tamanho de pixel de 6,5 x 6,5 μm2, e a objetiva de 63x foi usada para imagens, então o tamanho do pixel dividido pela ampliação é 6,5/63 = 0,1032 μm por pixel. Insira 0,1032 no campo de distância conhecida para a caixa de diálogo Definir escala .
  6. Para exportar a pilha de imagens finalizada como um vídeo que pode ser reproduzido no QuickTime Player, Microsoft PowerPoint, etc., salve como um arquivo .avi.

Resultados

A introdução bem-sucedida de plasmídeos repórteres em P. aeruginosa e S. aureus é indicada pelo crescimento nos antibióticos seletivos corretos e pode ser confirmada por PCR e/ou sequenciamento de colônias. As cepas modificadas devem ser verificadas como repórteres fenotípicas, submetendo-as a condições nas quais o gene de interesse é conhecido por ser induzido, e a fluorescência resultante pode ser medida por citometria de fluxo, espectrofotometria ou microscopia de epifluorescência (Figura 1).

Para facilitar a seleção de uma dose de antibiótico que será usada para experimentos subsequentes, realizar ensaios de persistência de antibióticos dependentes da concentração para as cepas de P. aeruginosa ou S. aureus de interesse. Os ensaios dependentes da concentração geralmente resultam em uma curva bifásica com uma inclinação inicial acentuada em concentrações mais baixas de antibióticos e um platô ou inclinação menos acentuada em concentrações mais altas. No entanto, para alguns pares de espécies de antibióticos, uma curva bifásica distinta pode não resultar. Por exemplo, a curva para S. aureus delafloxacino é claramente bifásica (Figura 3A), mas a curva de P. aeruginosa levofloxacino não é (Figura 3B)15. Nesse cenário, escolheríamos uma concentração que fosse pelo menos 10x a CIM (por exemplo, 5 μg/mL, que é cerca de 15x a CIM para P. aeruginosa)15. No entanto, como 15x levofloxacina MIC resulta em apenas ~ 0,001% de sobreviventes de P. aeruginosa , usamos 1 μg / mL de tratamento com levofloxacina se quisermos ver persistentes ao fazer imagens de células à medida que se recuperam em almofadas de agarose sem antibióticos (Vídeo Suplementar 6); caso contrário, o número de campos de visão necessários para criar imagens de vários persistentes se tornará proibitivo.

No início da imagem, a amostra ideal e a preparação da almofada de agarose devem parecer planas em todo o campo de visão, livres de grandes detritos, rugas ou bolhas de ar e com células únicas distribuídas uniformemente. A obtenção de células individuais bem distribuídas pode exigir a otimização da diluição ou ressuspensão da amostra. Para S. aureus, as células tendem a formar pequenos aglomerados e precisam ser completamente reviradas antes de se semearem na almofada de agarose (Figura 4 e Figura 5). Para P. aeruginosa, as células podem formar agregados envoltos em uma matriz extracelular pegajosa em suspensão; É necessário pipetar completamente essas amostras e interromper os agregados para obter imagens de células individuais.

Após a conclusão de um experimento de imagem, um lapso de tempo bem-sucedido de imagens aparecerá em foco, iluminado de forma estável e com desvio mínimo no plano x-y durante todo o experimento. O Vídeo Suplementar 7 representa uma aquisição de imagem ideal: t é o canal de fase do Vídeo Suplementar 4 antes da correção de sombra ou desvio. A perda de foco pode ocorrer se a condensação (devido à umidificação excessiva ou aquecimento insuficiente da amostra) fizer com que gotículas de água se formem na lamínula superior de 25 mm, distorcendo a luz e empurrando o plano focal para fora da faixa máxima de pesquisa do algoritmo de foco automático (Vídeo Suplementar 8). A variação na iluminação geralmente indica óleo de imersão insuficiente no momento da imagem. Se o estágio se mover muito rapidamente, o óleo na objetiva pode se arrastar para trás e ainda estar alcançando quando as imagens forem adquiridas. Isso pode ser atenuado ajustando os controles de aquisição para diminuir a velocidade do movimento ou adicionando uma pausa entre o movimento para a próxima posição e a aquisição da imagem. A grande deriva da amostra parecerá muitas células cruzando o campo de visão, enquanto algumas permanecem no lugar (Vídeo Suplementar 9). Isso geralmente ocorre mais tarde em experimentos porque a almofada de agarose desidratou devido ao controle insuficiente da umidade. A preparação da almofada de agarose apresentada neste artigo foi projetada para facilitar a estabilidade da amostra, mas aquecer/umidificar adequadamente a amostra e seu ambiente circundante é necessário para a aquisição ideal da imagem.

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Figura 1: Cepas repórteres fluorescentes iluminam a expressão de um gene de interesse. (A) S. aureus foi transduzido com um repórter transcricional GFP para um gene de interesse de acordo com o Protocolo 1. A cepa repórter foi tratada por 24 h com antibiótico, lavada com PBS e, em seguida, semeada em uma almofada de agarose feita de CA-MHB mais iodeto de propídio (1,6 μM) e cloranfenicol (10 μg / mL para manutenção do plasmídeo repórter) para imagens durante a recuperação (Vídeo Suplementar 1). (B) P. aeruginosa foi transformada com um plasmídeo contendo um repórter translacional ligado a mScarlet para uma proteína de interesse26. A cepa repórter foi tratada por 5 h com antibiótico, lavada com PBS e, em seguida, semeada em uma almofada de agarose feita de BSM mais Tet (75 μg / mL; para manutenção do plasmídeo repórter) para imagens durante a recuperação (Vídeo Suplementar 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Propagação e colheita de bacteriófago. (A) As seis placas mostram seis quantidades diferentes de estoque de fagos diluídos nos gramados de S. aureus RN4220. Os contornos vermelhos indicam as três placas que seriam colhidas, desde a placa com mais clareira (contorno vermelho em negrito; 1 x109 PFU/mL) até as próximas duas diluições (1 x108 e 1 x 107 PFU/mL). As setas pretas apontam para placas individuais. (B) Para colher o fago das placas, raspe a camada de ágar mole (esquerda), transfira a pasta para a próxima placa de diluição (centro) e, depois de agrupar o ágar mole de todas as três placas, misture em um tubo cônico para centrifugação (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Ensaios de persistência dependentes da concentração representativa. A persistência da fluoroquinolona dependente da concentração foi avaliada na fase estacionária (A) S. aureus (contra delafloxacina) e (B) P. aeruginosa (contra levofloxacina). Experimentos subsequentes utilizaram 5 μg / mL de delafloxacina (círculo vermelho) porque a morte de S. aureus se estabilizou nessa concentração. Uma dosagem de pelo menos 1 μg/mL de levofloxacina (círculo vermelho) seria utilizada para experimentos subsequentes com P. aeruginosa. Observe que a morte bacteriana não se estabiliza para P. aeruginosa, mas ainda há uma "segunda fase" menos íngreme da curva bifásica que indica uma subpopulação persistente. O Painel 3B foi adaptado com permissão de Hare et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Fenótipos bacterianos de imagem durante o tratamento com antibióticos. Células de fase estacionária (A) de S. aureus e (B) aeruginosa foram semeadas em almofadas de agarose contendo antibióticos fluoroquinolonas e monitoradas durante o tratamento: 5 μg/mL de delafloxacina para S. aureus (Vídeo Suplementar 3) e 5 μg/mL de levofloxacino para P. aeruginosa (Vídeo Suplementar 4)15. O iodeto de propídio (PI; 16 μM para P. aeruginosa, 1,6 μM para S. aureus) foi adicionado às almofadas para marcar células mortas ou moribundas. As células de S. aureus permanecem praticamente intactas e vivas na presença do FQ, enquanto a maioria das células de P. aeruginosa sofre mudanças morfológicas drásticas, incluindo a formação de esferoplastos redondos, antes de se lisar e morrer. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Rastreamento de persistentes durante a recuperação. (A) As populações de S. aureus e (B) P. aeruginosa foram semeadas em almofadas de agarose contendo meio fresco após terem sido tratadas com fluoroquinolonas (5 μg/mL de delafloxacina para S. aureus e 1 μg/mL de levofloxacina para P. aeruginosa) e monitoradas durante a recuperação pós-tratamento (Vídeo Suplementar 5 e Vídeo Suplementar 6). As periirmãs vistas são indicadas com setas verdes nos dois primeiros quadros de cada painel, e permaneceram intactas e viáveis durante o tratamento com antibióticos. Após um período inicial de defasagem, os persistentes começaram a se dividir e deram origem a uma nova progênie (indicada com círculos verdes). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Preparação da amostra do microscópio. (A) Esquema do fluxo de trabalho de preparação da amostra usando um prato de lamínula intercambiável ("câmara"). (B) Imagem da câmara desmontada e seus componentes individuais. (C) Foto da câmara totalmente montada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo Suplementar 1: S. aureus persister. Arquivo de vídeo contendo as imagens na Figura 1A. Em resumo, S. aureus portador de um repórter transcricional GFP para um gene de interesse foi tratado por 24 h com antibiótico, lavado com PBS e, em seguida, semeado em uma almofada de agarose feita com CA-MHB mais iodeto de propídio (1,6 μM) e cloranfenicol (10 μg / mL) para imagem durante a recuperação. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar 2: P. aeruginosa persister. Arquivo de vídeo contendo imagens na Figura 1B. Em resumo, P. aeruginosa portadora de um repórter translacional ligado a mScarlet para uma proteína de interesse foi tratada por 5 h com antibiótico, lavada com PBS e, em seguida, semeada em uma almofada de agarose feita com BSM mais Tet (75 μg / mL) para imagem durante a recuperação26. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar 3: S. aureus durante o tratamento com antibióticos. Uma cultura de fase estacionária de S. aureus cultivada em meio quimicamente definido rico foi semeada em almofadas de agarose feitas a partir do meio condicionado livre de células da cultura com iodeto de propídio (1,6 μM) e delafloxacina (5 μg/mL). Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar 4: P. aeruginosa durante o tratamento com antibióticos. Uma cultura de fase estacionária de P. aeruginosa cultivada em BSM foi semeada em almofadas de agarose feitas de meio condicionado livre de células de uma cultura de P. aeruginosa cultivada em BSM em paralelo; a almofada de agarose também continha iodeto de propídio (16 μM) e levofloxacina (5 μg/mL). Este vídeo foi adaptado com permissão de Hare et al.15. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar 5: S. aureus durante a recuperação pós-antibiótica. S. aureus foi cultivado até a fase estacionária em meios quimicamente definidos ricos. As culturas em fase estacionária foram tratadas com 5 μg/mL de delafloxacino em tubos de ensaio por 24 h, lavadas com PBS e, em seguida, semeadas em almofadas de agarose CA-MHB livres de antibióticos contendo iodeto de propídio (1,6 μM) para imagem. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar 6: P. aeruginosa durante a recuperação pós-antibiótica. Uma cultura em fase estacionária de P. aeruginosa cultivada em BSM foi tratada com 1 μg/mL de levofloxacina em tubos de ensaio por 7 h, lavada com PBS e, em seguida, semeada em almofadas de agarose BSM sem antibióticos contendo iodeto de propídio (16 μM) para imagem. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar 7: Exemplo de aquisição de imagem ideal. Este vídeo é o canal de fase do Vídeo Suplementar 4 antes do processamento da imagem como um exemplo de uma aquisição de lapso de tempo ideal. Observe o desvio mínimo, a iluminação estável e a manutenção do foco durante todo o experimento. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar 8: Exemplo de aquisição de imagem abaixo do ideal devido à condensação. Este vídeo mostra parte de um experimento em que a aquisição da imagem foi afetada por foco ruim, provavelmente devido à condensação na câmara devido ao aquecimento inadequado da amostra e/ou umidificação excessiva do ambiente de imagem. A amostra que está sendo fotografada foi P. aeruginosa tratada com levofloxacino durante a recuperação pós-antibiótica em uma almofada de agarose BSM. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar 9: Exemplo de aquisição de imagem abaixo do ideal devido ao desvio. Este vídeo mostra parte de um experimento em que a aquisição da imagem foi afetada pelo desvio da amostra, provavelmente devido à desidratação e ao encolhimento / levantamento da almofada de agarose da lamínula. A amostra que estava sendo fotografada era P. aeruginosa em uma almofada de agarose contendo levofloxacina e iodeto de propídio. Clique aqui para baixar este vídeo.

Arquivo Suplementar 1: 25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Descobrimos que o sucesso de um experimento de microscopia de lapso de tempo depende da qualidade das almofadas de agarose e de sua estabilidade ao longo do curso da imagem. As almofadas de agarose fechadas em câmara de aço inoxidável são relativamente fáceis de preparar, resultando em amostras consistentemente planas que podem ser visualizadas de forma estável ao longo de dezenas de horas. Isso permite a imagem de dezenas de milhares de células em um único experimento e aumenta a probabilidade de detectar variantes fenotípicas raras, como células persistentes, em uma população.

Este método de preparação de almofada de agarose apresenta uma alternativa facilmente implementável aos métodos publicados anteriormente. Nosso protocolo não requer a precisão técnica da fabricação de dispositivos microfluídicos ou as manipulações hábeis dos métodos "sanduíche" de agarose, facilitando a obtenção de preparações consistentes de execução em execução 14,16,36. Além disso, o sistema é econômico. A câmara de aço inoxidável é esterilizável e reutilizável (ao contrário das câmaras de plástico de uso único) e a configuração não requer equipamento especializado16,37. A câmara é facilmente ajustada a diferentes sistemas de microscopia usando insertos de platina disponíveis comercialmente. Além disso, como as bactérias são imobilizadas na interface agarose-vidro de cobertura, tivemos sucesso no rastreamento de bactérias altamente móveis, como P. aeruginosa, enquanto ainda permitimos mudanças morfológicas (Figura 4, Vídeo Suplementar 4). Outras técnicas de imagem de célula única, como a "máquina-mãe", confinam as células a canais que impedem a observação de alterações morfológicas diferentes da filamentação36.

Para ter sucesso com este protocolo, existem algumas etapas e parâmetros críticos a serem lembrados. Para a preparação da almofada, é importante aquecer e derreter completamente a agarose, pois quaisquer cristais de agarose restantes causarão difração de luz e afetarão a qualidade da imagem. Da mesma forma, deve-se ter o cuidado de pipetar a agarose para dentro da câmara sem introduzir bolhas de ar. Para garantir que a espessura das almofadas de agarose permaneça consistente e limitar o desvio da amostra, é importante permitir que a almofada se equilibre - normalmente por 15 minutos - no gabinete umidificado e com temperatura controlada antes do início da imagem. Outro fator que pode causar baixa qualidade de imagem é o controle de umidade: a baixa umidade resultará na desidratação e encolhimento da almofada de agarose, enquanto a alta umidade (ou aquecimento inadequado da amostra na câmara) pode fazer com que o ar quente se condense na amostra e distorça a imagem. Um exemplo de imagem de lapso de tempo abaixo do ideal devido à condensação pode ser encontrado no Vídeo Suplementar 8.

Uma limitação da configuração atual é que os meios de cultura não podem ser trocados, o que impede o rastreamento contínuo de bactérias individuais antes, durante e após o tratamento com antibióticos. Prevemos que o acoplamento da almofada de agarose com células de fluxo ou dispositivos microfluídicos que permitem a troca de meios de cultura pode permitir que as populações sejam rastreadas durante as mudanças nutricionais ou ambientais. Outro parâmetro do projeto atual que pode ser melhorado é a aeração da amostra. O selo O-ring, o design com tampa de rosca do prato de lamínula intercambiável permite uma melhor aeração da amostra em comparação com configurações que requerem o uso de selante à base de cera ou graxa para selar as almofadas16. No entanto, a aeração na câmara selada ainda pode ser limitada e pode não suportar o crescimento de aeróbios obrigatórios, embora isso ainda precise ser testado.

O protocolo de preparação de amostras de imagem com lapso de tempo que apresentamos neste artigo permite que milhares de bactérias sejam rastreadas à medida que respondem ou se recuperam do tratamento com antibióticos. Este método também é altamente generalizável e tem uma variedade de aplicações potenciais além da biologia persistente. Por exemplo, a configuração da almofada e do divisor de agarose permite a semeadura de amostras de células separadas espacialmente, mas permite a comunicação célula-célula via difusão através da almofada de agarose. Atualmente, estamos explorando o potencial dessa configuração para testar como a troca de produtos secretados afeta o crescimento celular em comunidades multiespécies. Prevemos que este protocolo fornecerá uma baixa barreira de entrada para a microscopia de lapso de tempo para o novo investigador e variações ilimitadas para o microbiologista experiente explorar.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos à Sra. Susan Staurovsky, do Centro de Saúde da UConn para Análise Celular e Instalação de Microscopia de Modelagem, por sua assistência com experimentos de microscopia. Agradecemos à Dra. Mona Wu Orr e ao Workshop de Fundamentos de Genética e Metabolismo Estafilocócico por seus protocolos e conselhos sobre clonagem em P. aeruginosa e S. aureus, respectivamente. Este trabalho foi apoiado por financiamento do National Institutes of Health (NIH; DP2GM146456-01 e 1R01AI167886-01A1 para W.W.K.M., 1F30DE032598-01A1 para P.J.H. e 1F31DK136259-01A1 para T.J.L.). Os financiadores não tiveram nenhum papel no projeto de nossos experimentos ou na preparação deste manuscrito.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BaSiCGitHubhttps://github.com/marrlab/BaSiC
Certified Molecular Biology AgaroseBiorad1613101
Fiji-ImageJNIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
Prato de Cobertura de Vidro IntercambiávelBioptechs190310-35CDI de 35 mm para preparação de almofadas de agarose; vem com lamínulas de
30 mm (# 1,5)Lumencor Spectra 7 Motor de luz LEDLumencorhttps://lumencor.com/products/spectra-light-engineSpectra 7 Motor de luz LED
MetaMorphMolecular DevicesVersão Premier 7.10.5
pco.edge 4.2 bi câmera sCMOSExcelitashttps://www.excelitas.com/product/pcoedge-42-bi-usb-scmos-cameracâmera sCMOS
PeCon câmara de incubação de células vivaspeConhttps://www.pecon.biz/
Thomas Scientific Vidro de cobertura redondo, espessura #1.5, 25 mm, pacote de 100Fisher ScientificNC127277025 mm (#1.5) microscópio
Zeiss Axiovert 200MZeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/widefield-microscopes/axiovert-for-materials.htmlMicroscópio invertido com objetiva Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil Ph3 M27, mecanismo de luz LED Lumencor Spectra 7 e câmera pco.edge 4.2 bi sCMOS (tamanho de pixel de 6,5 mm)
lamínulas

Referências

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