Quantificando a migração celular tridimensional dentro e dentro de biomateriais de hidrogel granular

Summary

Um protocolo para a avaliação quantitativa da migração de células 3D dentro e para a interface de hidrogéis granulares é apresentado aqui.

Abstract

Os andaimes de hidrogel granular têm um potencial significativo na medicina regenerativa, funcionando como transportadores para entrega celular ou como interfaces para integração tecidual. Este artigo apresenta duas novas abordagens para quantificar a migração celular dentro e dentro de hidrogéis granulares, destacando as aplicações distintas desses andaimes. Primeiro, é apresentado um ensaio de interface de monocamada celular que simula o crescimento de tecidos em hidrogéis granulares para fins de integração. Em segundo lugar, é descrito um ensaio baseado em esferóides, projetado para rastrear o movimento celular dentro da matriz de hidrogel, especificamente adequado para aplicações que envolvem entrega celular. Ambos os métodos permitem medições precisas e controladas da migração celular, fornecendo um kit de ferramentas abrangente para pesquisadores que utilizam andaimes de hidrogel granular. A motivação para esses métodos decorre da necessidade de controle personalizado sobre a migração celular dentro do andaime para se alinhar com aplicações específicas. Ao otimizar e padronizar essas técnicas de quantificação, os pesquisadores podem refinar iterativamente as propriedades granulares do hidrogel, garantindo sua eficácia em diversos contextos de medicina regenerativa. Este conjunto robusto de ferramentas quantitativas oferece novas oportunidades para aprimorar os andaimes de hidrogel granular, avançando seu uso em aplicações de entrega de células e integração de tecidos.

Introduction

Os biomateriais para aplicações terapêuticas estão evoluindo cada vez mais para modelos mais complexos e relevantes de ambientes celulares para estudar a integração tecidual. Os andaimes de biomateriais fornecem uma estrutura tridimensional (3D) para o crescimento celular e visam imitar um tecido desejado ^1,2. Os modelos tridimensionais de cultura de células incluem matrizes naturais e andaimes sintéticos que fornecem às células mais complexidade por meio de pistas haptotáticas ou quimiotáticas ^3,4. Os andaimes de hidrogel tradicionais são reticulados a granel, produzindo uma malha nanoporosa que permite a difusão de pequenas moléculas ^5,6, mas requer degradação para migração em escala celular para uma área de tecido que precisa de reparo⁷. Os hidrogéis granulares são um subconjunto de biomateriais que apresentam alto potencial de tradução clínica devido à sua biocompatibilidade, capacidade de se adaptar a formas irregulares e, em muitos casos, sua injetabilidade ^8,9. Sua natureza de bloco de construção oferece a vantagem da porosidade em escala celular para aumentar a infiltração e a angiogênese do tecido, bem como a modularidade, o que permite a adição de pistas heterogêneas para o comportamento celular^{10 , 11 , 12} . Compreender a resposta e o movimento celular dentro de um andaime 3D é vital para a relevância fisiológica em todas as aplicações que usam biomateriais para integração de tecidos.

O estudo do crescimento tecidual em três dimensões, no entanto, provou ser difícil de realizar com precisão quantitativa. A complexidade expandida de um ambiente 3D requer modelos in vitro de migração celular que podem não apenas fornecer informações sobre o comportamento celular, mas também a otimização da condição do material. Relatórios publicados anteriormente de migração de células de andaime granular 3D usaram semeadura tópica para explorar o comportamento celular, relatando infiltração na estrutura porosa e morfologia celular¹³ e outros brotos esferóides^14,15, medindo o comprimento do crescimento e o número de brotos. Os comprimentos de migração da semeadura tópica podem ser influenciados de forma desigual pelas forças da gravidade e, devido às limitações da microscopia, os resultados não podem ser longitudinais. O método de brotamento esferóide foi limitado à quantificação 2D via projeção máxima, que é incapaz de capturar o mecanismo de invasão controlada. Ambos os métodos são medidos em um plano xy, que não possui a nuance necessária para recapitular totalmente o movimento celular 3D e a infiltração do andaime.

Este protocolo descreve duas abordagens para quantificar a migração celular, como infiltração in vitro nos andaimes de hidrogel granular 3D poroso, especificamente usando andaimes de partículas recozidas microporosas (MAP) 16,17,18,19. O objetivo dos métodos a seguir é estudar o comportamento celular em géis granulares, controlando a direcionalidade de sua migração para análise tridimensional. A primeira abordagem, baseada em monocamada de ensaio de migração ascendente (MAMA), é um modelo simplificado de integração celular endógena que ilustra interações uniformes célula-material e serve como uma plataforma para representar o ambiente inicial no qual as células interagem com hidrogéis granulares, bem como para isolar o comportamento individual antes da infiltração do andaime. O segundo, chamado de método de ensaio de migração de esferóides em camadas paralelas para fora (PLOSMA), é um ensaio de migração de esferóides de células 3D, que explora o movimento celular quando totalmente cercado por um ambiente de andaime complexo e modela o movimento celular após o parto, bem como o movimento após as células terem entrado totalmente em um gel granular.

Ambos os métodos são quantificáveis por análise de imagem 3D e podem ser aplicados ao estudo e otimização de interações material-célula usando pontos de tempo longitudinais para aplicações de medicina regenerativa e engenharia de tecidos, onde promover ou restringir o movimento celular está dentro dos critérios de projeto. Além disso, esses métodos aproveitam a centrifugação em placas para uma preparação uniforme de ensaios com vários poços.

Protocol

Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação granular de hidrogel

NOTA: As partículas MAP usadas em todo este protocolo são 3,2% em peso p/v de gel com 45,88 mg/mL PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg/mL RGD, 8,06 mg/mL MethMal¹⁹ e 5,62 mg/mL de reticulador degradável MMP-2. A rigidez mecânica do gel é de 15-20 kPa para corresponder à rigidez dérmica¹⁷.

1. Gere partículas granulares de hidrogel e prepare-se para a cultura de células normalmente.
   NOTA: Este protocolo descreve a preparação estéril do gel de Partículas Microporosas Recozidas, cuja produção é detalhada por Roosa et ^al.18.
2. Prepare as partículas granulares de hidrogel para uso in vitro esterilizando com três lavagens de álcool isopropílico 70% seguidas de três lavagens de PBS 1x estéril.
3. Preparar um fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de lítio (LAP) estéril a 0,2 mM em solução de meios, dissolvendo o pó de LAP em água ultrapura e passando a solução através de um filtro estéril de 0,22 μm. Adicione esta solução 1:1 v/v com a quantidade de gel necessária para conduzir o experimento.
4. Incubar a solução de LAP, gel e meio de 0,2 mM a 37 °C em um rotador de tubo a 20 rpm por pelo menos 30 min antes de prosseguir para permitir a difusão de LAP através das micropartículas.
5. Decorridos 30 minutos, centrifugar a suspensão de partículas a 18.000 x g durante 5 minutos a 25 °C. Aspire o sobrenadante.
   NOTA: A secura geral das partículas MAP pode variar devido a diferenças na química, hidrofilicidade e tamanho das partículas. Para consistência, é uma prática recomendada centrifugar a suspensão de partículas conforme descrito, misturar as partículas no tubo usando uma pipeta de deslocamento positivo e, em seguida, repetir a etapa de centrifugação.

2. Método de ensaio de migração ascendente baseado em monocamada (MAMA): cultura de células e imagem

NOTA: As células foram fotografadas usando o canal FITC (488 nm). O corante usado para as células teve uma excitação a 492 nm e uma emissão a 517 nm. A ampliação de 10x fornece mais detalhes em relação à ampliação de 4x, mas qualquer uma delas pode ser usada.

1. Descongele os fibroblastos dérmicos humanos (HDFs) de acordo com o protocolo do fabricante. Passagem conforme necessário até que a passagem desejada seja alcançada; geralmente, as células primárias mantêm a composição genética e fenotípica através de P5.
2. Placa de 120.000 células/^cm2 para pelo menos n = 6 em uma placa de 96 poços ou tamanho de placa desejado usando o volume de meio recomendado por poço para suspensão, aspirando suavemente antes de cada adição. Deixe as células se ligarem durante a noite, conforme mostrado na Figura 1A, o que resultará em aproximadamente 80% de confluência no dia seguinte.
   NOTA: Geralmente, os poços da coluna central e da linha são os melhores para o espalhamento ideal do gel. Os autores usam até 24 poços para uma placa de 96 poços (linhas BG e colunas 5-8).
3. Prepare as condições do gel conforme observado acima e, durante a incubação no LAP, remova o meio com um aspirador ou pipeta da placa do poço das células. Tenha cuidado para não mexer no fundo do prato.
4. Adicione corante de rastreamento celular aos poços de acordo com as instruções do fabricante, representadas na Figura 1B. Certifique-se de que o gel esteja completamente preparado conforme descrito na etapa 1 antes de aspirar o corante de rastreamento celular dos poços.
5. Adicione 20 μL de cada condição de gel aos poços com uma pipeta de deslocamento positivo sem tocar no fundo da placa.
   NOTA: As melhores condições de ensaio ocorrem quando o gel é pipetado diretamente para o centro do poço.
6. Usando um acessório de centrífuga de rotor de rotação de placas a 25 ° C, gire a 100 x g por 15 s com aceleração e desaceleração de 8 para achatar o gel. Vire a placa 180° e gire novamente a 100 x g por 15 s para garantir uma distribuição uniforme do gel no fundo do poço, como visto na Figura 1C.
7. Foto-reticulação asséptica do gel a partir do topo (Figura 1D) aplicando luz focalizada (365 nm, 34,4 mW / cm²) à amostra por 30 s para recozer o andaime, adicionando 200 μL de meio a cada poço de células depois que todos os andaimes são formados. Deixe as células incubarem a 37 °C por 30 min para permitir que elas se fixem ao andaime granular antes da imagem.
8. Para capturar o comportamento de migração resumido na Figura 1E, faça a imagem das células usando um microscópio confocal. Encontre o ponto de foco mais baixo para uma área da placa onde as células são pelo menos 80% confluentes e defina-o como a borda inferior da pilha z.
   1. Encontre o ponto mais alto do sinal fluorescente da célula e defina-o como a borda superior da pilha z. Use um tamanho de passo de 5 μm ou menor para obter a melhor resolução.
9. Imagem de pelo menos três poços para representar a monocamada celular e as alturas das células não migratórias. O ponto de tempo t = 0 é mostrado tanto na vista superior quanto na vista lateral na Figura 2A. Incube durante a noite após a conclusão da imagem.
   NOTA: Essas células foram fotografadas com uma objetiva de 4x e a exposição foi mantida consistente para todos os poços.
10. Em t = 24 h, as células começarão a subir através do andaime granular, como visto na Figura 2B das vistas superior e lateral. Repita as etapas de imagem realizadas para t = 0 h usando os mesmos parâmetros. Use a altura anterior do palco como referência ou encontre as células que ainda não migraram e defina-a como a borda inferior da pilha z.
11. Repita as etapas para todos os poços, garantindo que cada poço seja salvo como uma imagem separada para facilitar a análise.
    NOTA: Os pontos de tempo podem ser visualizados para pontos de tempo mais longos, dependendo das restrições experimentais e do método de fluorescência de rastreamento celular.
12. Os andaimes podem ser fixados e tingidos para métricas adicionais. No ponto de tempo final desejado, aspire o meio dos poços com uma pipeta e descarte. Lave suavemente cada poço com 200 μL de PBS estéril duas vezes por 5 min cada. Adicione 200 μL de paraformaldeído a 4% (PFA) por 20 min, aspire e descarte. Os poços podem ser corados imediatamente ou armazenados a 4 °C em 1x PBS por até uma semana.

3. Método de ensaio de migração ascendente baseado em monocamada (MAMA): análise de imagem 3D

1. Para conversões em lote, abra o software IMARIS Image Conversion. Arraste e solte as imagens de microscopia no software de conversão e escolha uma pasta dentro do software Arena para importar. Pressione Iniciar tudo. As imagens convertidas aparecerão na Arena como arquivos .ims.
   NOTA: Se o tamanho do voxel não estiver incluído nos metadados da imagem, consulte as especificações de imagem confocal individuais para encontrar o valor. Alternativamente, o tamanho do voxel pode ser aproximado como o tamanho do passo usado durante a imagem.
2. Abra o software clicando duas vezes no ícone do IMARIS Arena da área de trabalho e selecionando uma imagem da Arena.
3. A imagem é carregada automaticamente na guia de análise 'Visualização 3D' vista no painel de ícones da barra de ferramentas na parte superior. Clique na guia Image Proc na barra de ferramentas principal.
4. No canto superior esquerdo do painel lateral, clique no menu suspenso do Canal 1 e selecione Subtração em segundo plano. Pressione Ok na parte inferior do painel para retornar à 'Visualização 3D'. Imagens representativas para t = 0 h e t = 24 h estão na Figura 2A, B, respectivamente.
5. Na pequena barra de ferramentas logo acima do menu do painel lateral, clique no ícone com formas azuis arredondadas, Adicionar novas superfícies, para criar uma guia de objetos editáveis chamada 'Superfícies 1'.
6. Uma interface para configurações de algoritmo de parâmetros de criação será aberta na parte inferior do painel de menus. Gere manualmente os parâmetros a serem usados para todas as réplicas clicando no botão de seta azul na parte inferior da interface. Certifique-se de que o canal de origem correto esteja selecionado e marque a caixa 'Suave'.
   1. Defina o detalhe da superfície para 0,7 μm e selecione Subtração de fundo (contraste local). Digite o comprimento médio da célula na caixa 'Diâmetro da maior esfera que cabe no objeto'. Pressione a mesma seta azul na parte inferior quando terminar.
      NOTA: Este valor pode ser estimado usando a guia 'Fatia' na barra de ferramentas e medindo a largura das células médias.
7. Para limiar, determine o histograma de intensidade em que apenas as células mais brilhantes são segmentadas. Usando a segmentação de dados, mova-se para cima e para baixo na pilha de imagens para garantir que ela seja a mais precisa possível.
   1. Selecione Ativar para 'Dividir objetos de toque (região em crescimento)' e defina o diâmetro dos pontos iniciais para o mesmo diâmetro usado anteriormente. Certifique-se de que o limite 'Baseado em Intensidade' esteja selecionado e clique no botão azul de seta para a direita.
8. As próximas duas etapas, Filtrar pontos iniciais e Filtrar superfícies, podem ser ajustadas por várias medições para garantir que as superfícies geradas sejam precisas; no entanto, a análise de linha de base não requer filtragem adicional. Quando nenhuma alteração for necessária, clique no botão de seta azul .
   NOTA: A etapa final permite uma classificação adicional da superfície, dependendo da saída desejada. Depois que qualquer edição for feita, clique no botão de seta verde para concluir a criação das superfícies.
9. Para salvar os Parâmetros de Criação para análise em lote, clique no ícone de varinha Criação. Clique em Armazenar parâmetros para lote e nomeie-o e, em seguida, clique em Ok. Imagens processadas representativas para t = 0 e t = 24 h são mostradas nas Figuras 2C,D, respectivamente.
   NOTA: Todos os objetos dentro de uma 'Superfície' selecionada podem ser classificados em conjuntos com base em várias propriedades fornecidas pelo software de conversão de imagem, como área de superfície, volume, intensidade e distância de outras superfícies criadas.
10. As propriedades da superfície são encontradas selecionando a guia Estatísticas . Para reunir todas as alturas das células, clique na guia Detalhado e selecione Valores Específicos e Posição Z nos menus suspensos sucessivos. Clique no único ícone Salvar para salvar todas as posições z e quaisquer classificações feitas em um arquivo .xls. Repita para todas as imagens.
11. Encontre a posição z mediana das células não migratórias da imagem representativa e subtraia todas as posições z abaixo desse número de cada condição de teste.
    NOTA: Os valores de migração são relatados como as médias das medianas para cada condição de replicação técnica acima da altura da célula não migratória. Eles podem ser relatados como altura mediana, vista na Figura 3A, ou como mudança de dobra na altura de migração para o ponto de tempo desejado em comparação com t = 0, visto na Figura 3B.

4. Método de Ensaio de Migração de Esferóides Externos em Camadas Paralelas (PLOSMA): Cultura de células e cultura de gotículas suspensas para esferoides 3D

NOTA: Este protocolo descreve a cultura de células e a cultura de gotas suspensas adaptadas do protocolo de autoria de Nandi et ^al.14.

1. Descongele os HDFs de acordo com o protocolo do fabricante. Passe conforme necessário até que a passagem desejada seja alcançada.
2. Em uma capela de cultura de células asséptica, prepare uma placa de Petri adicionando 10 mL de PBS ao fundo e virando a tampa para que o exterior fique sobre a capa de cultura de células.
3. Adicione o volume apropriado de células (determinado a partir da contagem de células) a um tubo de microcentrífuga. Adicione o corante de rastreamento celular diluído no meio. Traga o volume total para 1 mL com meio aquecido.
   NOTA: Os esferóides devem ter aproximadamente 8000 células por esferoide, mas podem mudar com base no tipo de célula.
4. Incubar a solução celular durante 45 min a 37 °C. Gire as células para baixo de acordo com a velocidade recomendada pelo fabricante e aspire o sobrenadante.
5. Ressuspender células em metilcelulose 1:100 em meio.
6. Pipetar gotículas de 20 μL da solução de célula/meio para a tampa da placa de Petri.
7. Inverta a tampa com confiança, rapidez e cuidado e coloque-a em cima da metade inferior da placa de Petri contendo PBS.
8. Incube as gotículas por pelo menos 24 h.
   NOTA: A formação de esferóides pode ser monitorada por microscopia de campo claro.

5. Método de Ensaio de Migração de Esferóides Externos em Camadas Paralelas (PLOSMA): Semeando esferóides celulares em hidrogel granular

NOTA: O processo a seguir está resumido na Figura 4A.

1. Para configurar o método PLOSMA descrito na Figura 4A, adicione assepticamente 15 μL de gel usando uma pipeta de deslocamento positivo aos poços em uma placa transparente de 96 poços.
2. Usando um acessório de centrífuga de rotor giratório de placas, gire a 1000 x g por 10 s para achatar o gel. Vire a placa 180° e gire novamente a 1000 x g por 10 s para garantir uma distribuição uniforme do gel no fundo do poço.
3. Uma vez que o nivelamento uniforme tenha sido alcançado, reticule assepticamente o gel a partir do topo, aplicando luz focalizada (365 nm, 33,4 mW / cm²) à amostra por 30 s para recozer o andaime.
4. Mova assepticamente a placa de Petri de gotículas penduradas na capa de cultura de tecidos asséptica e inverta a tampa.
5. Usando uma pipeta de 20 μL, levante lentamente uma gota até que o esferóide entre na ponta da pipeta. Ejete a gota no andaime no centro do poço.
6. Repita as etapas anteriores para todos os poços. Certifique-se de que cada poço tenha um esferóide, confirmando com microscopia de campo claro ou fluorescente.
7. Incubar a placa do poço a 37 °C durante 2 h para permitir que os esferoides se fixem ao andaime.
8. Pipete mais 15 μL de gel em cima de cada esferóide. Para garantir que haja uma distribuição uniforme do gel, centrifugue a placa a 300 x g por 15 s em cada direção.
9. Recozer a camada superior do gel durante 30 s utilizando luz UV (365 nm) a 33,4 mW/cm². Pipetar o meio no topo de cada andaime para elevar o volume total do poço a 200 μL.
   NOTA: Os andaimes estarão muito secos neste ponto, portanto, adicione mídia gota a gota na lateral do poço para evitar o desprendimento do esferoide.

6. Método de Ensaio de Migração de Esferóides Externos em Camadas Paralelas (PLOSMA): Imagem confocal de esferóides

NOTA: A facilidade de aquisição de imagens depende do sistema de imagem. Localize o esferóide dentro do poço em um tempo de exposição baixo. As células foram fotografadas usando o canal FITC (488 nm). O corante usado para as células teve uma excitação a 492 nm e uma emissão a 517 nm. A ampliação de 10x fornece mais detalhes em relação à ampliação de 4x.

1. Encontre o nível de estágio mais baixo (altura z) no qual as células ainda estão em foco. Defina isso como o limite inferior da pilha z.
2. Encontre o nível de estágio mais alto (altura z) no qual as células ainda estão em foco. Defina isso como o limite superior da pilha z.
   NOTA: Os melhores resultados de imagem incluem um tamanho de passo menor ou igual a 5 μm para manter a resolução em escala celular. Pode haver compensações entre a velocidade e a resolução da imagem, dependendo do sistema de microscópio confocal.
3. Visualize todos os esferoides conforme descrito em t = 0 e 24 h. Um ponto de tempo de 48 horas também pode ser fotografado, dependendo das restrições experimentais. Imagens de projeção máxima representativas de t = 0 e t = 24 são vistas na Figura 4B.

7. Método de Ensaio de Migração de Esferóides Externos em Camadas Paralelas (PLOSMA): análise de imagem 3D

1. Importe imagens para o software de análise conforme descrito nas etapas 3.1 a 3.4. No canto superior direito do painel esquerdo, clique no menu suspenso do Canal 1 e selecione Subtração em segundo plano. Pressione Ok na parte inferior do painel.
2. Quando voltar à visualização 3D, pressione Ajustar automaticamente todos os canais na janela pop-up Ajuste de exibição e corrija conforme necessário.
3. Na barra de ferramentas menor logo acima do menu lateral, clique no ícone Add new Reference Frame mostrado na Figura 5A com três setas ortogonais para adicionar uma nova guia chamada 'Reference Frame 1'.
4. Mova a origem para o centro do esferóide em todos os três planos, conforme visualizado na Figura 5B.
5. Na mesma barra de ferramentas das três setas ortogonais, clique no ícone com esferas laranja e adicione novos Spots para criar uma guia chamada 'Spots 1'. Pressione o botão de seta azul.
6. Em Detecção de ponto, defina o Diâmetro XY estimado como o diâmetro estimado das células. Pressione o botão de seta azul.
   NOTA: Para HDFs, esse número é de 15,0 μm.
7. Para limite, ajuste o histograma de intensidade para circundar apenas as partes mais brilhantes. Usando a segmentação de dados, mova-se para cima e para baixo na pilha de imagens para garantir que ela seja a mais precisa possível. Acerte a próxima seta azul.
8. Pressione o botão verde Executar para finalizar a análise.
9. Desmarque Renderizar na segmentação ou clique no ícone quadrado amarelo no lado direito do painel de configuração.
10. Clique na guia Estatísticas . No primeiro menu suspenso, selecione Valores Específicos. No segundo menu suspenso, selecione Distância do quadro de referência de origem. Todos os valores para as superfícies selecionadas serão exibidos, como visto na Figura 5C. Clique no ícone de salvamento único, que baixa um arquivo .xls.
11. Salve as alterações feitas na imagem e nas análises pressionando o ícone Salvar na barra de ferramentas principal. A Figura 6A representa uma renderização 3D de um esferóide fotografado em 24 h, enquanto a Figura 6B representa a função IMARIS Spots marcando células espalhadas, codificadas por cores de acordo com a distância do quadro de referência de origem.
12. Normalize os dados exportados para as imagens t = 0 e calcule a média da distância celular percorrida e da altura z para cada esferóide para obter um único valor para cada amostra. A Figura 7A, B representa gráficos representativos para cada saída, respectivamente.

Results

Este protocolo visa detalhar as etapas necessárias para dois novos ensaios de migração de andaimes granulares. O método MAMA pode ser utilizado para avaliar a infiltração celular em uma interface tecidual. Os hidrogéis granulares são um sistema mais complexo do que os hidrogéis a granel e, portanto, são inerentemente mais complexos de processar para migração ^9,20. É importante entender o processo passo a passo descrito na Figura 1. Cada etapa se baseia na próxima e foi otimizada neste protocolo. A semeadura de HDFs a uma densidade de 120.000 células/^cm2 resultará em pelo menos 80% de confluência durante a noite (Figura 1A), e essas células não fluorescentes são melhor marcadas com corante de rastreamento celular no dia do experimento para maximizar o potencial de imagem (Figura 1B). Este protocolo corresponde à força centrífuga mais baixa usada na passagem de HDF para manter a viabilidade celular. Devido ao ângulo produzido para uma única etapa de centrifugação, é necessário virar a placa 180° para garantir que o gel se desloque totalmente da superfície inferior dos poços (Figura 1C). Permitir que as células se recuperem na incubadora por 30 minutos após o recozimento (Figura 1D) manterá a viabilidade celular e resultará em migração ideal (Figura 1E). Uma grande área de uma placa de 96 poços pode ser visualizada com uma objetiva de 4x e combinada do ponto de tempo 0-24 h (Figura 2A, B) para avaliar amplamente o comportamento celular. O processamento das imagens z-stack resultantes no software de análise fornece análises avançadas para vários conjuntos de dados grandes em uma interface fácil de usar. Este protocolo resume as etapas para criar conjuntos de dados para a altura da célula, ou posição Z, em cada ponto de tempo visualizado com as imagens representativas na Figura 2B, C. A análise dos dados processados é vista na Figura 3A, visualizada usando a média das alturas medianas e seu desvio padrão de cada ponto no tempo, e a altura de mudança de dobra das células não migratórias em t = 0 h é mostrada na Figura 3B. Os dados subjacentes desse método geralmente não são distribuídos normalmente, portanto, as medianas são medidas mais robustas para comparação e, portanto, são usadas para resumir os dados.

Da mesma forma, o método PLOSMA pode ser utilizado para avaliar a motilidade das células entregues dentro de um andaime de hidrogel granular 3D. A Figura 4A descreve as etapas para o método PLOSMA, e é especialmente importante semear o esferóide no centro do poço. Recomenda-se centralizar o esferóide no campo de visão, mas depende das capacidades do microscópio. A Figura 4B exibe imagens representativas do espalhamento do esferóide para t = 0 h e t = 24 h tiradas com ampliação de 10x no canal FITC (488 nm). No software, um quadro de referência de origem pode ser criado e ajustado para cada pilha z (Figura 5A, B). O software pode rastrear a distância radial desse quadro de referência de origem e exportá-lo como o conjunto de dados desejado (Figura 5C). A Figura 6A mostra uma imagem representativa da renderização 3D do esferóide t = 24 h, enquanto a Figura 6B mostra a função Spots do software. Um exemplo dos dados processados é mostrado na Figura 7. A Figura 7A representa a distância média percorrida do centro normalizado para as distâncias do Dia 0. A Figura 7B isola as distâncias percorridas apenas no plano z, pois essa é a direção que o método PLOSMA pretende estudar.

Figura 1: Ensaio de migração ascendente baseado em monocamada cultura de células e imagem. Esquema das principais etapas no processamento de células e gel para MAMA. (A) As células são cultivadas até a confluência durante a noite e (B) o corante de rastreamento celular é adicionado pouco antes da adição do gel granular. O andaime é montado por centrifugação de placas (C) e estabilizado com (D) fotoreticulação. A imagem em vários pontos de tempo permite (E) a visualização da migração celular ascendente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Processamento de imagem MAMA. Imagens representativas do processamento de imagens. Comparação da vista superior e lateral de imagens confocais brutas em (A) t = 0 e (B) t = 24 h no canal FITC com ampliação de 4x. (B) Comparação das vistas superior e lateral das alturas Z da posição da célula processada em (C) t = 0 e (D) t = 24 h. O processamento por 24 h inclui a subtração das alturas z medianas não migratórias. Barras de escala = 500 μm. Abreviaturas: MAMA = Ensaio de Migração Ascendente Baseado em Monocamada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise de saída de migração de células MAMA. (A) Posição mediana Z e desvio-padrão das alturas das células em cada réplica (n = 6) nos momentos t = 0 (27,0 μm ± 1,4 μm) e t = 24 h (46,6 μm ± 10,8 μm). (B) Migração de células em 24 h normalizada para 0 h e relatada como mudança de dobra (1,8 ± 0,4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Ensaio de migração de esferóides de camada paralela para fora (PLOSMA) cultura de células e imagem. (A) Esquema descrevendo as etapas de estratificação de andaimes. (B) Projeções de intensidade máxima do esferóide feitas em 0 e 24 h. As imagens foram obtidas por microscopia fluorescente confocal no canal FITC (488 nm) com aumento de 10x. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: PLOSMA = Ensaio de Migração de Esferóides de Camada Paralela para Fora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Criando um novo quadro de referência de origem. (A) O novo botão do quadro de referência de origem destacado com uma caixa vermelha. (B) A nova origem está definida para estar no centro do esferóide em todas as três dimensões. (C) As métricas de saída mostradas são as distâncias das superfícies das células do quadro de referência de origem, que descreve a distância que as células migraram do centro. Barra de escala = 120 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Renderizações 3D do esferóide incorporado a 24 h. (A) Esferóide processado no espaço 3D. (B) O centro do mesmo esferóide foi determinado usando a função de quadro de referência de origem no IMARIS, e a propagação da célula é codificada por cores pela distância da origem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Exemplos de saídas para PLOSMA. (A) Exemplo de resultados de PLOSMA mostrando a distância percorrida em μm. A distância média percorrida foi de 240,8 μm ± 36,87 μm. (B) Mudança de dobra da altura Z (t_f / t₀) da brotação do esferóide. A variação média das dobras foi de 3,82 ± 1,495. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este protocolo descreve dois modelos in vitro para caracterização da migração celular em 3D para cicatrização de feridas e integração tecidual. O primeiro modelo, o ensaio de migração baseado em monocamada, depende de células confluentes e devidamente conectadas. Este protocolo foi desenvolvido com um tipo de célula de fibroblastos e otimizado com uma densidade de semeadura de 1,20,000 células/^cm2. Essa densidade permite que as células cresçam durante a noite até pelo menos 80% de confluência uniformemente na parte inferior da placa do poço. Esta etapa garante a migração na direção z em pelo menos 24 h; Se a confluência for muito baixa após a adição da camada de gel, as células podem continuar a se espalhar pelo plástico da cultura de tecidos, bem como pelo gel, resultando em um padrão de migração não uniforme e lento, que foi observado durante a otimização. Alturas de migração desiguais ainda podem ser observadas em áreas de células menos densas, mesmo com 80% de confluência. Bem replicados reduzirão o ruído desses comportamentos celulares. Células excessivamente confluentes podem causar o levantamento de células durante o período de centrifugação e potencialmente a morte celular. Essa variabilidade é abordada por meio da semeadura em um número consistente de células e da captura de uma área de imagem consistente para permitir comparações de dados apropriadas. Até onde o autor sabe, a centrifugação em placas não foi publicada para achatamento em gel, mas a centrifugação é comumente usada para passagem celular e manuseio de biomatéria^21,22. Ajustar a velocidade para corresponder às velocidades de passagem manterá a viabilidade celular para um processamento celular ideal adicional.

O principal desafio neste método é maximizar a resolução e a profundidade da imagem, minimizando o tempo de imagem para garantir a melhor análise. O corante de rastreamento de células verdes é suficientemente brilhante para obter imagens de um poço de 96 com um tamanho de passo de 5 μm ou menos e até 1000 ms de tempo de exposição. Reduzir o tempo de exposição reduz a quantidade de tempo que as células não estão em condições de incubação, mas também reduz a resolução. Esses parâmetros devem ser otimizados em um microscópio individual, mas a variabilidade é reduzida garantindo que todas as imagens sejam capturadas com as mesmas configurações em um estudo.

Uma observação importante para a análise de MAMAs é que ela requer a eliminação das células na altura da monocamada ou abaixo dela para garantir que apenas as células migratórias sejam consideradas para testes estatísticos. Assim, as medianas dos poços replicados são relatadas devido à natureza de distribuição não gaussiana das posições das células após a filtragem. A comparação entre os grupos pode ser visualizada com um histograma e as medianas podem ser analisadas estatisticamente com um teste não paramétrico.

Apesar desses desafios, o método de migração ascendente baseado em monocamada é, em sua forma mais simples, um ensaio reprodutível para infiltração de células 3D de andaimes porosos. Para estudar os efeitos mecanicistas da migração celular, certifique-se de que os parâmetros se ajustem ao tipo de célula que está sendo estudado. Isso pode incluir a adição de componentes quimiotáticos ou haptotáticos, dentro do gel ou na mídia. Os meios completos de fibroblastos dérmicos humanos incluem quimiocinas migratórias, mas outros tipos de células que usam pistas mais específicas requerem adaptação do ensaio de acordo. Este ensaio se presta a testar vários tipos de variáveis; no entanto, o âmbito de aplicação destas não é abrangido pelo presente protocolo. O MAMA fornece um ambiente fisiologicamente relevante análogo ao movimento celular do tecido a granel para um hidrogel poroso injetado in vivo.

Para o método PLOSMA, a colocação dos esferoides no centro do andaime é fundamental para imagens bem-sucedidas e migração celular significativa em três dimensões. A semeadura exata do esferóide no centro do gel depende do usuário. Para este fim, estabilizar a pipeta no cilindro com a mão não dominante do usuário auxilia na centralização, e a eficácia da posição de semeadura pode ser confirmada usando microscopia de campo claro ou fluorescente. Um esferóide fora do centro pode ser remediado por uma segunda tentativa com um novo esferóide, no mesmo andaime ou em um novo andaime. Por esse motivo, os autores recomendam a criação de mais esferoides do que o necessário e a preparação de mais gel MAP do que o necessário.

A etapa de centrifugação da segunda camada garante que o esferóide seja (1) coberto uniformemente pelo gel e (2) capaz de se espalhar uniformemente para cima e para baixo no gel, o que é crucial para estudar as células entregues. A centrifugação também pode fazer com que o esferóide se mova do centro em direção às bordas do poço e, embora esse protocolo limite esse fenômeno, otimizando as etapas de centrifugação e o volume do gel usado para cada camada (15 μL) para distribuição uniforme, ele não elimina completamente seu movimento. A velocidade exata de centrifugação e o tempo necessários para reduzir o movimento do esferóide podem precisar ser ajustados de acordo com o modelo da centrífuga; no entanto, a especificação descrita neste protocolo pode ser usada como referência para otimização individual. Outra abordagem é permitir que os esferóides 2 h de tempo de incubação se fixem ao andaime antes de adicionar a segunda camada de gel. O movimento esferóide é mitigado particularmente bem quando ambas as estratégias são implementadas. Finalmente, devido ao processo de centrifugação em várias etapas, esse método pode não ser adequado para linhagens celulares menos resistentes.

Além da logística de plaqueamento dos esferoides no método PLOSMA, existem limitações durante a aquisição da imagem. O esferóide pode ser fotografado usando ampliação de 4x ou 10x, mas para obter melhores resultados, use pelo menos uma ampliação de 10x e reduza o tamanho do passo das pilhas z para 2-5 μm. A ampliação deve ser consistente durante todo o estudo. O tempo de imagem aumenta com maior resolução, portanto, limite o número de amostras em cada placa de poço (4-8 poços por placa) para minimizar o tempo fora da incubadora. Uma configuração de imagem ao vivo também pode melhorar o rastreamento e fornecer maiores insights.

Como os hidrogéis granulares têm topologia e parâmetros de design exclusivos que incluem volume inerente, porosidade, resistência mecânica e, em alguns casos, bioatividade, é necessário estudar o comportamento celular em relação a esses aspectos com o máximo de fidelidade possível. O método PLOSMA é projetado para modelar o movimento celular após o parto ou depois que as células entraram totalmente em um gel granular. Como as células são forçadas a migrar através dos poros inerentes à geometria granular do hidrogel, o método PLOSMA isola efetivamente a porosidade como uma influência no comportamento celular. As aplicações potenciais para este ensaio são a entrega de células in situ e a integração do tecido dentro de um andaime granular, particularmente no espaço de cicatrização de feridas²³.

Ambos os protocolos foram desenvolvidos com fibroblastos dérmicos humanos primários devido ao papel da migração de fibroblastos no reparo e remodelação tecidual ^4,24, no entanto, o comportamento migratório de quaisquer células aderentes pode ser medido em resposta à alteração do arcabouço poroso - incluindo adições de fatores de crescimento e composição superficial / bulk do gel. Essas alterações podem exigir a adaptação desses ensaios para resultados apreciáveis. Os parâmetros que requerem otimização adicional incluem densidade de semeadura celular, duração do experimento e/ou pipeline de análise. O IMARIS é uma poderosa ferramenta de análise de imagem que é utilizada para análise de migração celular e possui recursos além do que é descrito aqui, que incluem a classificação de todos os objetos dentro de uma 'superfície' selecionada em conjuntos com base em várias propriedades, como área de superfície, volume, intensidade e distância de outras superfícies criadas. Existem muitos recursos online para determinar métodos de análise adicionais.

Os dois métodos descritos aqui não apenas abordam o estado inicial de introdução do tecido a um material granular de maneira fisiológica, mas também a resposta celular subsequente quando totalmente incorporada ao material. Como em todos os ensaios de migração, as células presentes são capazes de proliferar paralelamente ao movimento, no entanto, o design dos ensaios descritos não interrompe a proliferação e, portanto, garante que não haja impacto indevido na análise. Ambos os métodos são compatíveis com a coloração de ponto final, além da imagem longitudinal, que usa fixação PFA para detectar métricas como citoesqueleto, deposição de colágeno, proliferação e muito mais. O uso dos métodos descritos avança em direção a uma representação espaço-temporal mais precisa da migração de células 3D que utiliza a infiltração celular como um parâmetro mensurável em contraste com os métodos anteriores 1,6,14,15,25,26,27.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 Faloidina	ThermoFisher	A22287
Albumina de soro bovino	VWR International	332
CellTracker Green CMFDS Dye, 1 mg	ThermoFisher	C2925	20 x 50 ug unidades, 492/517 nm
Centrífuga	ThermoFisher	75016085	Série ST Plus
Placa transparente de 96 poços	MilliPore Sigma	CLS3997-50EA
Dimetilsulfóxido	Fisher Scientific	MT-25950CQC	250 mL
Fibroblasto Basal Médio	ATCC	PCS-201-030	480 mL, sem vermelho de fenol Kit de crescimento de
fibroblastos - Baixo soro	ATCC	PCS-201-041	7,5 mM L-glut, 5 ng/mL rh FGF básico, 5 ug/mL rh Insulina, 1 ug/mL Hidrocortisona, 50 ug/mL Ácido ascórbico, 2% FBS
FIJI (ImageJ)	NIH		Público acesso download
Fibroblastos dérmicos humanos	ATCC	PCS-201-012	Fibroblastos dérmicos humanos adultos
ImageXpress Micro	Dispositivos		Confocais Microscópio confocal de disco giratório com ampliações de 4x, 10x
IMARIS	Oxford Instruments		3/4D Imaged Visualizaiton and Analysis Software,
Incubadora	ThermoFisher	Finnpipette F2 Pipetas de volume variável	HeraCell Vios 160i Incubadora de CO2, 165L
M-20 Microplaca Balde Oscilante Rotor	ThermoFisher	75003624
Metilcelulose	Fisher Scientific	9004-67-5	Grau de laboratório, forma de pó
Tubo de microcentrífuga	Fisherbrand	05-408-129 Tubos de	microcentrífuga de 1,5 mL
Paraformaldeído (4%)	Alfa Aesar	AAJ19943K2	Para consertar
Placa de Petri	Corning	08-757-100A	Placas de Petri Bacteriológicas com Tampa 35 x 10 mm
Pipetas	ThermoFisher	4642080	Finnpipette F2 Pipetas de volume variável
Estéril PBS	Gibco	10010-023
Triton-X	Fisher Scientific	327371000